第9999二十一章 常用分子生物学技术的原理及应用

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1、目录目录常用分子生物学技术的常用分子生物学技术的原理及应用原理及应用The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology第第21章章目录目录第一节第一节分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization and Blotting Technique目录目录n核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)在在DNA复复性性过过程程中中，如如果果把把不不同同DNA单单链链分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中，或或把把DNA与与RNA放

2、放在在一一起起，只只要要在在DNA或或RNA的的单单链链分分子子之之间间有有一一定定的的碱碱基基配配对对关关系系，就就可可以以在在不不同同的的分分子子之之间间形形成杂化双链成杂化双链(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理目录目录复性复性RNADNA目录目录（一）印迹技术（一）印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为此称之为“blott

3、ing”，译为印迹技术。，译为印迹技术。目录目录用放射性核素、生物素或荧光染料标记其用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针探针”，探针可以与固定在，探针可以与固定在NC膜上的核苷膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。（二）探针技术（二）探针技术目录目录二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹印迹(Southern Blotting)（二）（二）RNA印迹印迹(Northern Blotting)（三）蛋白质的印迹（三）蛋白质的印迹(W

4、estern Blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。、重组质粒和噬菌体的分析。用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。目录目录n其他：其他：斑点印迹斑点印迹(dot blotting)原位杂交原位杂交(in situ hybridization)DNA点阵点阵(DNA array)DNA芯片技术芯片技术(DNA chip)三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较分子杂交实验分子杂交实验目录目录放放射射自自显显影影照照片片目录目录DNA点阵点阵目录目录第二节第二节聚合酶链反应聚合酶链反应Poly

5、merase Chain Reaction目录目录5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA一、一、PCR技术的技术的工作原理工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 目录目录Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。目录目录模板模板DNA特异性引物特异性引物耐热耐热DNA聚合酶聚合酶dNTPsMg2+n PCR体系基本组成成分体系基本组成成分目录目录n PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变

6、性变性9595 C C延伸延伸72C退火退火Tm-5C目录目录利利用用特特异异性性引引物物以以cDNA或或基基因因组组DNA为为模模板板获获得得已已知知目目的的基基因因片片段段,或或与与逆逆转转录录反反应应相相结结合合，直直接以组织和细胞的接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；为模板获得目的片段；利利用用简简并并引引物物从从cDNA文文库库或或基基因因组组文文库库中中获获得得序列相似的基因片段；序列相似的基因片段；利利用用随随机机引引物物从从cDNA文文库库或或基基因因组组文文库库中中克克隆隆基因。基因。二、二、PCR技术技术的主要用途的主要用途（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆目

7、录目录利利用用PCR技技术术可可以以随随意意设设计计引引物物在在体体外外对对目目的的基基因因片片段段进进行行嵌嵌和和、缺缺失失、点点突突变等改造。变等改造。PCR技技术术高高度度敏敏感感，对对模模板板DNA的的量量要要求求很很低低，是是DNA和和RNA微微量量分分析析的的最好方法。最好方法。（三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（二）基因突变（二）基因突变目录目录将将PCR技技术术引引入入DNA序序列列测测定定，使使测测序序工作大为简化，也提高了测序的速度；工作大为简化，也提高了测序的速度；待待测测DNA片片段段既既可可克克隆隆到到特特定定的的载载体体后后进行序列测定，也可直接测定。

8、进行序列测定，也可直接测定。PCR与与其其他他技技术术的的结结合合可可以以大大大大提提高高基基因突变检测的敏感性因突变检测的敏感性。（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析目录目录逆转录逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将是将RNA的逆转录反应和的逆转录反应和PCR反应联合反应联合应用的一种技术。应用的一种技术。RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分进行定性及半定量分析的最有效方法。析的最有效方法。（一）逆转录（一）逆转录P

9、CR技术技术三、几种重要的三、几种重要的PCR衍生技术衍生技术目录目录原原位位PCR(in situ PCR)是是在在组组织织切切片片或或细细胞胞涂涂片片上上的的单单个个细细胞胞内内进进行行的的PCR反反应应，然然后后用用特特异异性性探探针针进进行行原原位位杂杂交交，即即可可检检出出待待测测DNA或或RNA是否在该组织或细胞中存在。是否在该组织或细胞中存在。原原位位PCR方方法法弥弥补补了了PCR技技术术和和原原位位杂杂交交技技术术的的不不足足，是是将将目目的的基基因因的的扩扩增增与与定定位位相相结结合合的的一一种最佳方法。种最佳方法。（二）原位（二）原位PCR技术技术目录目录（三）实时（三）

10、实时PCR技术技术实实时时PCR(real-time PCR)技技术术通通过过动动态态监监测测反反应应过过程程中中的的产产物物量量，消消除除了了产产物物堆堆积积对定量分析的干扰，亦被称为定量对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。目录目录n实时实时PCR技术原理技术原理QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物荧光标记引物荧光标记引物RQ 3355目录目录第三节第三节核酸序列分析核酸序列分析Nucleic Acid Sequence Analysis目录目录n核酸序列分析的基本原理：核酸序列分析的基本原理：化学裂解法化学裂解法(Maxam-Gillbert法法)DNA链的末端合成终止法链的末端

11、合成终止法(Sanger法法)目录目录一、一、DNA链末端合成终止法链末端合成终止法目录目录GATC 测序反应测序反应 电泳电泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5 3 正极正极负极负极ddGddAddTddCn链末端合成终止法测定链末端合成终止法测定DNA序列的原理序列的原理目录目录二、二、DNA自动测序自动测序采采用用荧荧光光替替代代放放射射性性核核素素标标记记是是实实现现DNA序序列列分分析析自自动动化化的的基基础础。用用不不同同荧荧光光分分子子标标记记四四种种双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸，然然后后进进行行Sange

12、r测测序序反反应应，反反应应产产物物经经电电泳泳（平平板板电电泳泳或或毛毛细细管管电电泳泳）分分离离后后，通通过过四四种种激激光光激激发发不不同同大大小小DNA片片段段上上的的荧荧光光分分子子使使之之发发射射出出四四种种不不同同波波长长荧荧光光，检检测测器器采采集集荧荧光信号，并依此确定光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。目录目录ddGddAddTddC红色红色荧光荧光绿色绿色荧光荧光黄色黄色荧光荧光蓝色蓝色荧光荧光电泳电泳DNA序列自动分析原理及结果图序列自动分析原理及结果图目录目录第四节第四节基因文库基因文库Gene Library目录目录基因组基因组DNA文库文库(g

13、enomic DNA library)cDNA文库文库(cDNA library)n基因文库基因文库(gene library)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列序列的克隆群体。的克隆群体。目录目录一、基因组一、基因组DNA文库文库基因组基因组DNADNA文库是指生物的文库是指生物的基因组基因组DNA的的信息（包括所有的编码区和非编码区）以信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。片段形式贮存的克隆群体。用于构建基因组文库的载体有用于构建基因组文库的载体有目录目录n基因组文库和基因组文库和cDNA文库的构建和筛选文库的构建和筛选目录

14、目录第一轮筛选第一轮筛选第二轮筛选第二轮筛选第三轮筛选第三轮筛选n基因组文库筛选结果举例基因组文库筛选结果举例目录目录cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部件下所表达的全部mRNAmRNA经逆转录而合成的经逆转录而合成的cDNA序列序列的克隆群体，它以的克隆群体，它以cDNA片段的形片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。式贮存着该组织细胞的基因表达信息。二、二、cDNA文库文库目录目录第五节第五节生物芯片技术生物芯片技术Biological Chip Technique目录目录是指将许多特定的是指将许多特定的DNADNA片段有规律地紧密排片段有

15、规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列微阵列(DNA microarray)。一、基因芯片一、基因芯片n基因芯片基因芯片(gene chip)目录目录n基因芯片工作流程示意图基因芯片工作流程示意图目录目录是是将将高

16、高度度密密集集排排列列的的蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上，当当与与待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时，可可捕捕获获样样品品中中的的靶靶蛋蛋白白，再再经经检检测测系系统统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片蛋白质分子间的亲和反应蛋白质分子间的亲和反应n蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)n蛋白质芯片蛋白质芯片作用原理作用原理目录目录第六节第六节生物大分子相互作用研究技术生物大分子相互作用研究技术 The Method of Protein-protein and Pro

17、tein-DNA Interaction Study目录目录一、蛋白质相互作用研究技术一、蛋白质相互作用研究技术酵母双杂交酵母双杂交各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选噬菌体显示系统筛选n常用蛋白质相互作用的研究技术常用蛋白质相互作用的研究技术目录目录标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋

18、标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。合的未知分子。目录目录标签融合标签融合蛋白沉淀蛋白沉淀实验流程实验流程示意图示意图目录目录（二）酵母双杂交技术的基本原理（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途和用途目录目录n酵母双杂交系统的应用酵母双杂交系统的应用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。的生物信息学推测。分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的分析已知存在

19、相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。将拟研究的蛋白质的编码基因与将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成基因融合成为为“诱饵诱饵”表达质粒，可以筛选表达质粒，可以筛选AD基因融合的基因融合的“猎物猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。蛋白质。目录目录电电泳泳迁迁移移率率变变动动测测定定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或或称称凝凝胶胶迁迁移移变变动动实实验验(gel shift assay)最最初初用用于于研研究究DNA结结合合蛋蛋白

20、白与与相相应应DNA序序列列间间的的相相互互作作用用，可可用用于于定定性性和和定定量量分分析析，已已经经成成为为转转录录因因子子研研究究的的经经典典方方法法。目目前前这这一一技技术术也也被被用用于于研研究究RNA结结合合蛋蛋白白和和特特定定RNA序序列列间间的相互作用。的相互作用。二、二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定（一）电泳迁移率变动测定目录目录放放射射自自显显影影未结合探针未结合探针结合有蛋白的探针结合有蛋白的探针标记探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物核蛋白提取物1X10X10X未标记探针未标记探针10Xn凝胶迁移实验结果示意图

21、凝胶迁移实验结果示意图目录目录染染色色质质免免疫疫沉沉淀淀技技术术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)是是目目前前可可以以研研究究体体内内DNA与与蛋蛋白白质质相相互互作作用用的的主要方法。主要方法。（二）染色质免疫沉淀法（二）染色质免疫沉淀法目录目录n染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图目录目录遗传修饰动物模型的建立及应用遗传修饰动物模型的建立及应用The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model 第七节第七节目录目录n转基因技

22、术转基因技术采采用用基基因因转转移移技技术术使使目目的的基基因因整整合合入入受受精精卵卵细细胞胞或或胚胚胎胎干干细细胞胞，然然后后将将细细胞胞导导入入动动物物子子宫，使之发育成个体。宫，使之发育成个体。转基因转基因被导入的目的基因被导入的目的基因转基因动物转基因动物(transgenic animal)目的基因的受体动物目的基因的受体动物一、转基因技术一、转基因技术目录目录n核转移技术核转移技术 即即动动物物整整体体克克隆隆技技术术，将将动动物物的的一一个个体体细细胞胞核核全全部部导导入入另另一一个个体体的的去去胞胞核核的的的的激激活活的的卵卵细细胞胞内内，使使之之发发育育成成个个体体，即克隆

23、即克隆(clone)。二、核转移技术二、核转移技术目录目录n基因剔除技术基因剔除技术(gene knock out)也称也称基因靶向基因靶向(gene targeting)灭活灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。有目的去除动物体内某种基因的技术。三、基因剔除技术三、基因剔除技术目录目录将灭活的基因放入胚胎干细胞将灭活的基因放入胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)中，使这一灭活基因通过同源重中，使这一灭活基因通过同源重组取代原有的目的基因，筛选到基因已定点灭组取代原有的目的基因，筛选到基因已定点灭活的细胞后，通过显微注射将细胞注入小鼠囊活的细胞后，通过显微注射将细胞注入

24、小鼠囊胚中。细胞在小鼠囊胚中参与胚胎的发育，最胚中。细胞在小鼠囊胚中参与胚胎的发育，最终形成嵌合体小鼠。终形成嵌合体小鼠。n操作方式操作方式目录目录n建立动物模型建立动物模型 单基因决定疾病模型单基因决定疾病模型 基因剔除基因剔除获得性突变获得性突变(gain-of-function mutation)多基因决定疾病模型多基因决定疾病模型四、基因转移和基因剔除在医学四、基因转移和基因剔除在医学发展中的作用发展中的作用目录目录第八节第八节疾病相关基因的克隆与鉴定疾病相关基因的克隆与鉴定Cloning and Identification of Disease Relative Genes目录目录

25、功能克隆功能克隆(functional cloning)定位克隆定位克隆(positional cloning)n克隆疾病相关基因的策略克隆疾病相关基因的策略目录目录n定义定义 从对一种致病基因的功能的了解出发来从对一种致病基因的功能的了解出发来克隆该致病基因。克隆该致病基因。（一）功能克隆（一）功能克隆n应用应用 生化机制已明确、基因表达产物较易得生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。到部分纯化的遗传性疾病。目录目录利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。用用不不同同人人的的DNADNA片片段段转转化化与与人人类类遗遗传传疾疾病病具具有

26、有类类似似表表型型的的突突变变酵酵母母，可可以以恢恢复复(rescue)正正常常表表型型的的片片段段中中所所含含有有的的基基因因即即可可能能为为致致病病基基因因。这这种种实实验验称称为为功功能能互互补补试试验验 (functional complementation assay)。目录目录（二）定位克隆（二）定位克隆n定义定义从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。小范围，最后克隆该基因。n系统的定位克隆工作系统的定位克隆工作 遗传学分析遗传学分析(确定致病基因染色体定位确定致病基因染色体定位)交换分析、连锁不平衡分析交换分析、连锁不平衡

27、分析 分子生物学分析分子生物学分析染色体异常染色体异常(缺失、易位等缺失、易位等)分析、基因分析、基因文库的筛选与基因克隆文库的筛选与基因克隆目录目录基因诊断和基因治疗基因诊断和基因治疗第九节第九节Gene Diagnosis and Gene Therapy目录目录n定义定义直接检测基因结构及其表达水平是否正常，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。从而对疾病作出诊断的方法。一、基因诊断一、基因诊断(Gene Diagnosis)n特点特点以基因作为检查材料和探察目标，属于以基因作为检查材料和探察目标，属于“病因诊断病因诊断”。针对特定基因，特异性强。针对特定基因，

28、特异性强。所用技术具有放大效应，故诊断灵敏度高。所用技术具有放大效应，故诊断灵敏度高。适用性强，诊断范围广。适用性强，诊断范围广。目录目录1.DNA序列分析序列分析用于基因突变类型已经明确的遗传病的用于基因突变类型已经明确的遗传病的诊断及产前诊断诊断及产前诊断 。2.PCR技术技术快速检出样品中的痕量病原微生物。快速检出样品中的痕量病原微生物。微量微量DNA 样品中的基因及基因变异分析。样品中的基因及基因变异分析。用于个体识别、亲缘关系鉴定、器官移植术用于个体识别、亲缘关系鉴定、器官移植术前组织配型、基因连锁分析等等。前组织配型、基因连锁分析等等。目录目录样品中痕量病原微生物的迅速检出、分类及

29、分型。样品中痕量病原微生物的迅速检出、分类及分型。同时分析样品中可能存在的多种不同基因变异方同时分析样品中可能存在的多种不同基因变异方式。式。分析样品中耐药菌株的存在和个体对药物或毒物分析样品中耐药菌株的存在和个体对药物或毒物的敏感性。的敏感性。分析个体的疾病易感状态，如肿瘤、自身免疫病分析个体的疾病易感状态，如肿瘤、自身免疫病发生的预警。发生的预警。3.基因芯片基因芯片(gene chip)目录目录 将将某某种种遗遗传传物物质质转转移移到到患患者者细细胞胞内内，使使其其在在体体内内发发挥挥作作用用,以以治治疗疗疾疾病病的的方方法法，称为称为基因治疗。基因治疗。二、基因治疗二、基因治疗(Gene Therapy)n定义定义目录目录（一）基因治疗的基本策略（一）基因治疗的基本策略1.缺陷基因精确的原位修复基因增补缺陷基因精确的原位修复基因增补基因失活基因失活基因疫苗基因疫苗 基因矫正基因矫正基因置换基因置换目录目录（二）基因治疗的基本程序（二）基因治疗的基本程序治疗性基因的选择治疗性基因的选择基因载体的基因载体的选择选择靶细胞的选择靶细胞的选择基因转移基因转移病毒载体病毒载体非病毒载体非病毒载体体细胞体细胞生殖细胞生殖细胞间接体内疗法间接体内疗法直接体内疗法直接体内疗法