液相操作讲义gere课件

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1、高效液相色谱法应用讲座高效液相色谱法应用讲座台州市药品检验所台州市药品检验所曾茂法曾茂法1、HPLC概述概述2、HPLC实验操作应知实验操作应知3、HPLC常见问题与思考常见问题与思考主要内容主要内容HPLC实验操作应知实验操作应知HPLC操作操作流程操作操作流程流动相的配制流动相的配制色谱柱使用与维护色谱柱使用与维护实验操作注意事项实验操作注意事项检测器检测器数据处理数据处理1概述概述定义定义分离模式与主要分离机制分离模式与主要分离机制基本术语基本术语正相与反相色谱正相与反相色谱 HPLC的特点 问题思考 定义定义HPLC用高压输液泵将规定的流动相用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色

2、谱柱进行分离测定泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。的色谱方法。仪器结构简介仪器结构简介仪器组成仪器组成根据需要配置流动相在线脱气装置、梯根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应系统等。系统等。泵泵输液泵是输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。泵系统中最重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能：结果的可靠性。输液泵应具备如下性能：流流量稳定，其量稳定，其RSD应应0.5%，这对定性定量的准，这对定性定量的准确性至关重要；确性至关重

3、要；流量范围宽，分析型应在流量范围宽，分析型应在0.110ml/min范围内连续可调，制备型应能达范围内连续可调，制备型应能达到到100ml/min；输出压力高，一般应能达到输出压力高，一般应能达到150300kg/cm2；液缸容积小；液缸容积小；密封性能密封性能好，耐腐蚀。好，耐腐蚀。泵的使用和维护注意事项泵的使用和维护注意事项防止任何固体微粒进入泵体，常用的方法防止任何固体微粒进入泵体，常用的方法是滤过，输液泵的滤器应经常清洗或更换。是滤过，输液泵的滤器应经常清洗或更换。流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵冲液的流

4、动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。过夜或更长时间的情况下。溶剂瓶内的流动相被用完。溶剂瓶内的流动相被用完。输液泵的工作压力决不要超过规定的最高输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。附：高效液相色谱仪流程图附：高效液相色谱仪流程图1 1贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2 2高压泵高压泵高压泵高压泵（输液泵）（输液泵）（输液泵）（输液泵）3 3进样装置进样装置进样装置进样装置4 4色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱

5、分离分离分离分离5 5检测器检测器检测器检测器分析分析分析分析6 6废液出口或组分收集器废液出口或组分收集器废液出口或组分收集器废液出口或组分收集器 7 7记录装置记录装置记录装置记录装置泵1.2HPLC分离模式与主要分离机制分离模式与主要分离机制分离模式主要保留机制液-固吸附吸附剂的表面吸附键合相溶质在两相间的分配或溶质与极性固定相的吸附离子交换溶质离子与填料上的反电荷层之间的相互作用离子对电中性离子对在两相间的分配分子排阻基于流体动力学体积的过滤作用手性溶质手性异构体与填料手性作用点间非对应异构体相互作用。亲和溶质与固定化配体间生化专属结合正相色谱法与反相色谱法正相色谱法与反相色谱法正相色

6、谱法正相色谱法反相色谱法反相色谱法正相与反相正相与反相 正相色谱法正相色谱法反相色谱法反相色谱法固定相极性固定相极性高中高中中低中低流动相极性流动相极性低中低中中高中高组分洗脱次序组分洗脱次序极极性小先洗出性小先洗出极性大先洗出极性大先洗出正相：流动相极性正相：流动相极性，洗脱能力，洗脱能力，k，组分组分tR反相：流动相极性反相：流动相极性，洗脱能力，洗脱能力，k，组分组分tR1.3特点特点适适用用范范围围宽宽：现现在在绝绝大大部部分分化化学学类类药药品品皆可采用该仪器分析。皆可采用该仪器分析。分分离离效效率率高高：复复方方分分析析、辅辅料料干干扰扰时时等等情况下，更显示其威力。情况下，更显示

7、其威力。速度快：一般出峰时间均在速度快：一般出峰时间均在30min以内。以内。灵灵敏敏度度高高：可可检检测测物物质质达达10-9g左左右右，一一般般最最低低检检测测浓浓度度均均可可达达10-110-3g/ml（进进样样体体积积1020l）。并并可可通通过过使使用用不不同同的的检检测测器器，测测定定不不同同物物质质，或或再再提提高高测定灵敏度。测定灵敏度。色色谱谱柱柱可可反反复复使使用用：一一般般保保存存好好，均均可可达达2年以上。年以上。流流出出的的组组分分容容易易收收集集：可可用用于于制制备备色色谱谱或价格极为昂贵的物质收集。或价格极为昂贵的物质收集。安安全全：仅仅有有一一些些有有机机溶溶剂

8、剂的的污污染染（使使用用时时，流流动动相相口口要要密密封封，一一者者以以免免挥挥发发，流流动动相相中中各各组组分分比比例例不不准准，二二者者防防止止挥挥发发，污污染染环境），比气相要安全的多。环境），比气相要安全的多。1.4思考思考1、为什么说分离度与重复性是系统适应性试、为什么说分离度与重复性是系统适应性试验指标中是更具有实用意义的参数？验指标中是更具有实用意义的参数？2、影响柱效的因素有哪些？、影响柱效的因素有哪些？3、影响分离度的因素有哪些？、影响分离度的因素有哪些？4、影响重复性的因素有哪些？、影响重复性的因素有哪些？Rs仪器影响分离的因素影响分离的因素1思考思考psi、bar、Mpa

9、如何换算？如何换算？乙醇为什么不常用作流动相？乙醇为什么不常用作流动相？2、HPLC操作操作流程操作操作流程开机开机最后开检测器最后开检测器配制流动相配制流动相流动相平衡，在此过程和适当时候调节柱温、流动相平衡，在此过程和适当时候调节柱温、流速、流动相比例。必要时要选柱子。配制对流速、流动相比例。必要时要选柱子。配制对照品、样品溶液。照品、样品溶液。系统适应性试验系统适应性试验进样进样数据处理数据处理关机关机先关检测器，后冲洗先关检测器，后冲洗流动相的配制流动相的配制流动相应具有的特点流动相应具有的特点流动相脱气流动相脱气流动相过滤除去微粒流动相过滤除去微粒流动相贮存流动相贮存流动相极性与截止

10、波长流动相极性与截止波长流动相调流动相调pH值值思考题思考题流动相具备以下的特点：流动相具备以下的特点：a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱或长时间保留在柱中中)。b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应反应(特殊情况除外特殊情况除外)。c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命压降，延长液体泵的使用寿命(可运

11、用提高温可运用提高温度的方法降低流动相的黏度度的方法降低流动相的黏度)。d、流动相的物化性质要与使用的检测器、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用相适应。如使用UV检测器，最好使用对检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。紫外吸收较低的溶剂配制。e、流动相沸点不要太低，否则容易产、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。生气泡，导致实验无法进行。流动相为什么要脱气流动相为什么要脱气流动相使用前必须进行脱气处理流动相使用前必须进行脱气处理，以除去其中，以除去其中溶解的气体（如溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，

12、因压力降低而流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用而改变柱的分离性能。若用FLD，可能会造成，可能会造成荧光猝灭。荧光猝灭。常用的脱气方法比较常用的脱气方法比较氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。本高。加热回流法：效果较

13、好，但操作复杂，且加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。有毒性挥发污染。抽真空脱气法：易抽走有机相。抽真空脱气法：易抽走有机相。常用的脱气方法比较常用的脱气方法比较超声脱气法：流动相放在超声波容器中，超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡用超声波振荡10-15min，此法效果最差。，此法效果最差。在线真空脱气法：在线真空脱气法：Agilent1100LC真空脱真空脱机利用膜渗透技术，机利用膜渗透技术，在线脱气，智能控在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂

14、体系。溶剂体系。压力、温度与气泡压力、温度与气泡压力减少时要产生气泡压力减少时要产生气泡温度升高时要产生气泡温度升高时要产生气泡防止产生新的气泡防止产生新的气泡沿管壁缓缓倒入沿管壁缓缓倒入先混合后脱气先混合后脱气梯度洗脱预先梯度洗脱预先“部分混合部分混合”为什么要滤除微粒为什么要滤除微粒为什么溶剂和样品要过滤为什么溶剂和样品要过滤?色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。柱和毛细管容易堵塞。仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞

15、和磨损，同时也会增加泵头内样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。要正确选用滤膜要正确选用滤膜流动相的贮存流动相的贮存流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。流动相。磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存。如确需贮量新鲜配制使用，不要贮存。如确需贮存

16、，可在冰箱内冷藏，并在存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，天内使用，用前应重新滤过。用前应重新滤过。流动相的贮存流动相的贮存容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。因甲醇有防沉淀和可能生长的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子无此现象。腐作用，所以盛甲醇的瓶子无此现象。6，流动相常用溶剂的极性和截止波长，流动相常用溶剂的极性和截止波长 由由极极性性可可以以看看出出，在在反反相相色色谱谱中中，要要使使出出峰峰时时间间加加快快，可可增增加加流流动动相相中中的的乙乙腈腈比比例

17、例，但但要要注注意意分分离离度度的的减减小小；若若要要使使出出峰峰时时间间减减慢慢，可可增增加加流流动动相相中中水水的的比比例例，增增加加水水的的比比例例还还会会引引起起分分离离度度的的增增加加；两两者者之之间间综综合合来来考考虑虑。四四氢氢呋呋喃喃使使用时注意波长。必须选用色谱级的。用时注意波长。必须选用色谱级的。由于甲醇的极限波长为由于甲醇的极限波长为210nm左右，故短波长测定时，左右，故短波长测定时，最好不要采用甲醇，而用乙腈。最好不要采用甲醇，而用乙腈。样品稀释用溶剂的选择：测定有关物质时最好选用流样品稀释用溶剂的选择：测定有关物质时最好选用流动相，避免以溶剂峰的干扰，水往往出倒峰。

18、动相，避免以溶剂峰的干扰，水往往出倒峰。各溶剂截止波长各溶剂截止波长流动相的流动相的pH值值采用反相色谱法分离弱酸（采用反相色谱法分离弱酸（3pKa7）或弱碱（或弱碱（7pKa8）样品时，通过调节）样品时，通过调节流动相的流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸，流动相的弱酸，流动相的pH值越小，组分的值越小，组分的k值值越大，当越大，当pH值远远小于弱酸的值远远小于弱酸的pKa值时，值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情弱酸主要

19、以分子形式存在；对弱碱，情况相反。况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。三乙胺溶液。注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）尾现象。所以在这

20、种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。又称为减尾剂或除尾剂。流动相的配制流动相的配制缓冲盐溶液缓冲盐溶液浓度不要配错浓度不要配错，临用新配，临用新配调调PH时一般在水相调，当流动相中有机时一般在水相调，当流动相中有机相比例较高时无法调。相比例较高时无法调。思考题思考题1、流动相流速与组成与保留时间的关系、流动相流速与组成与保留时间的关系如何？如何？2、流速与柱效、峰面积的关系、流速与柱效、峰面积的关系3、乙腈与甲醇在应用上的区别。、乙腈与甲醇在应用上的区别。4、水与有机相混合比例不同，会引起粘、水与有机相混合比例不同，会引起粘度变化吗？度变化吗？5、流动相有时为什么要调、流动相有时为

21、什么要调pH？6、流动相配好后可用多长时间？、流动相配好后可用多长时间？色谱柱的使用与维护色谱柱的使用与维护阅读说明书阅读说明书安装时注意方向安装时注意方向如何排气泡？如何排气泡？反相柱反相柱C-18或或C8当用含缓冲盐或表面活性当用含缓冲盐或表面活性剂的流动相后，要冲洗干净。剂的流动相后，要冲洗干净。色谱柱的使用与维护色谱柱的使用与维护色色谱谱柱柱不不用用、存存放放时时，两两头头柱柱塞塞一一定定塞塞住住，防防止柱内溶剂挥干止柱内溶剂挥干,否则容易挥发干损伤柱子。否则容易挥发干损伤柱子。分分析析生生化化样样品品、血血液液制制品品和和手手性性色色谱谱柱柱时时，最最好加一预柱以保护。好加一预柱以保

22、护。流动相极性及流速（压力）不要突变。流动相极性及流速（压力）不要突变。（1）色谱柱不能够碰撞、弯曲或强烈震荡；）色谱柱不能够碰撞、弯曲或强烈震荡；安装时，一定要保证阀件或管路的清洁。安装时，一定要保证阀件或管路的清洁。（2）尽量不使用或少使用高粘度的流动相。）尽量不使用或少使用高粘度的流动相。（3）在满足灵敏度的情况下，尽可能使用）在满足灵敏度的情况下，尽可能使用小进样量。如果样品比较小进样量。如果样品比较“脏脏”，要进行净，要进行净化或提纯处理。化或提纯处理。柱温控制柱温控制柱温箱的作用：柱温箱的作用：1、保留时间精确再现、保留时间精确再现2、提高分离效率、提高分离效率3、对高分子化合物或

23、黏度大的样品，分析、对高分子化合物或黏度大的样品，分析时柱温必须高于室温。时柱温必须高于室温。4、对一些具有生物活性的生物分子，要求、对一些具有生物活性的生物分子，要求低的柱温低的柱温系统平衡系统平衡1.除上所述外，流动相配制时还需注意什么？除上所述外，流动相配制时还需注意什么？2.流动相冲洗多长时间平衡？如何平衡？流动相冲洗多长时间平衡？如何平衡？3.有表面活性剂时小流速过夜，再到规定流速有表面活性剂时小流速过夜，再到规定流速30min。4.基线什么情况下才算平衡？基线什么情况下才算平衡？配制样品和对照品溶液配制样品和对照品溶液2配制：配制：溶剂；溶剂；容器：塑料容器常含有容器：塑料容器常含

24、有高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收。附，影响样品中药物的定量回收。3对照品称量问题对照品称量问题预试预试预试目的预试目的n，R是否符合要求；是否符合要求；保留时间是否合适保留时间是否合适调节色谱条件调节色谱条件流动相组成流动相组成流速流速柱温柱温柱子柱子因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于

25、一根特定的同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择的色谱柱，流速一般选择1mlmin，对于内径为，对于内径为4.0mm柱，流速柱，流速0.8mlmin为佳。为佳。当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量腈的含量)。流流速速和和柱柱温温均均可可适适当当改改变变，以以适

26、适应应测测定定的的需需要要。如如含含量量测测定定时时，可可适适当当加加大大流流速速和和提提高高柱柱温温；改改变变柱柱温温和和流流速速降降低低均均可提高分离效果。可提高分离效果。第一次测定时，应先将空白溶剂、对照第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如收集较长时间的图谱（如30分钟以上），分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定

27、。响主峰的测定。4进样量：药品标准中常标明注入进样量：药品标准中常标明注入10ul而目前多数而目前多数HPLC系统采用定量环（系统采用定量环（10ul、20ul和和50ul），因此应注意进样量是否一），因此应注意进样量是否一致。（可改变样液浓度）致。（可改变样液浓度）系统适应性试验系统适应性试验含量测定对照品含量测定对照品2份份,样品样品2份份;有关物质有关物质,对照品一份对照品一份,样品一份。样品一份。每份对照品进样三次，计算每份对照品进样三次，计算RSD%。系。系统适应性符合要求后，再进样。或者一统适应性符合要求后，再进样。或者一份对照品先进份对照品先进5针，计算针，计算RSD%符合要求，

28、符合要求，实验过程或实验结束进另一份对照品核实验过程或实验结束进另一份对照品核对，范围应在对，范围应在98%102%之间之间样品测定样品测定含量测定样品含量测定样品2份，每份份，每份1针针;有关物质样有关物质样品品1份份,每份每份2针。针。为了考察系统在实验过程中的稳定性。适为了考察系统在实验过程中的稳定性。适当间隔再进标样核对。当间隔再进标样核对。有关物质检查时，空白应进有关物质检查时，空白应进1针。含量测针。含量测定可不做。定可不做。自身对照进几针？自身对照进几针？10.3应应尽尽量量保保持持样样品品溶溶液液和和对对照照品品溶溶液液使使用用同同一一溶溶剂剂。含含量量测测定定时时一一般般可可

29、以以做做到到，溶溶出出度度测测定定时时，往往往往有有所所差差异异，通通过过先先浓浓配配后后，再用该溶剂稀释的办法进行，比例尽可能小。再用该溶剂稀释的办法进行，比例尽可能小。仪器冲洗仪器冲洗如何冲洗如何冲洗一般溶剂一般溶剂缓冲缓冲梯度梯度检测器类型检测器类型最最通通用用的的紫紫外外检检测测器器：注注意意测测定定波波长长较较短短时时，基基线线有有可可能能会会飘飘；洗洗柱柱子子时时，尽尽量量关关闭闭光光源源，以以延长使用寿命。延长使用寿命。二二极极管管阵阵列列检检测测器器：目目前前使使用用者者越越来来越越多多。用用于于多多波波长长检检测测、峰峰纯纯度度测测定定、对对被被测测定定物物质质进进行紫外扫描

30、后选择波长等用途。行紫外扫描后选择波长等用途。10.二极管阵列检测器的应用二极管阵列检测器的应用采用二极管阵列检测器进行论证，也是目前常采用的一个强有力采用二极管阵列检测器进行论证，也是目前常采用的一个强有力的手段。它通过对一个色谱峰的数点进行紫外扫描，然后比较所得到的手段。它通过对一个色谱峰的数点进行紫外扫描，然后比较所得到的扫描图谱的接近程度从而评价被检测峰的纯度。的扫描图谱的接近程度从而评价被检测峰的纯度。利用二极管阵列检测器进行峰纯度检查的缺点利用二极管阵列检测器进行峰纯度检查的缺点：（1）杂质浓度低，或与主成分相比吸收太小，达不到检测）杂质浓度低，或与主成分相比吸收太小，达不到检测灵

31、敏度，无法检测出来。灵敏度，无法检测出来。（2）当杂质的发色团与主成分一致，或者说杂质与主组分）当杂质的发色团与主成分一致，或者说杂质与主组分有相同或几乎相同的光谱图且具相近的流出时间，此时杂有相同或几乎相同的光谱图且具相近的流出时间，此时杂质也无法发现。质也无法发现。荧荧光光检检测测器器：灵灵敏敏度度更更高高，对对那那些些g级级的的制制剂剂品品种种，有有时时适适用用。但但缺缺点点是是，基基线稳定需平衡时间较长。线稳定需平衡时间较长。示示差差折折光光检检测测器器、蒸蒸发发光光散散射射检检测测器器、电化学检测器（电导检测器）等。电化学检测器（电导检测器）等。检测检测最小峰面积的设定最小峰面积的设

32、定峰纯度的测定峰纯度的测定自身对照法与归一化法的区别自身对照法与归一化法的区别结果计算结果计算8定量分析定量分析8.1外标法：计算公式：外标法：计算公式：使用时应注意尽量保持样品溶液和对照品溶液浓度相同使用时应注意尽量保持样品溶液和对照品溶液浓度相同 8.2 内标法：计算公式：内标法：计算公式：8.3归归一一化化法法和和自自身身对对照照法法：为为有有关关物物质质（杂杂质质）的的测测定定方方法法。这这是是通通过过峰峰面面积积的的比比较较来来推推算算出出各各物物质质质质量量比比例例的的方方法法。目目前前多多采采用用自自身身对对照照法法来来进进行行。(1)归归一一化化法法：即即一一个个峰峰的的峰峰面

33、面积积（杂杂质质峰峰）占占总总峰峰面面积积或或占占主主峰峰面面积积的的多多少少。由由于于有有关关物物质质测测定定时时，总总峰峰面面积积的的绝绝大大部部分分均均为为主主峰峰面面积积，故故两两者者结结果果差差不不多多，结结果基本一致。果基本一致。(2)自自身身对对照照法法：通通常常是是将将供供试试品品溶溶液液稀稀释释一一定定倍倍数数后后（通通常常为为100倍倍）作作为为对对照照溶溶液液（这这里里对对照照溶溶液液与与对对照照品品溶溶液液的的区区别别需需要要强强调调一一下下），将将其其和和供供试试品品溶溶液液分分别别进进样样测测定定，供供试试品品溶溶液液色色谱谱图图中中的的每每个个杂杂质质峰峰面面积积

34、，与与对对照照溶溶液液主主成成分分峰峰面面积积进进行行比比较较或或计计算算进进行行对对杂杂质质的的判判断断。如如比比较较，直直接接比比峰峰面面积积大大小小，如如计计算算，则则采采用用公式计算杂质含量公式计算杂质含量。如如果果该该物物质质线线性性关关系系良良好好，稀稀释释100倍倍，峰峰面面积积还还呈呈线线性性的的话话，那那么么，归归一一化化法法和和自自身身对对照照法法所所得得结结果果基基本本是是一一致致的的（最最多多差差0.02%左左右右）。但但如如果果稀稀释释100倍倍，峰峰面面积积不不呈呈线线性性的的话话，那那么么，归归一一化化法法和和自自身身对对照照法法所所得得结结果果将将有有所所差差异

35、异，如如此此时时采采用用归归一一化化法法，将将得得不不到到较较为为正正确确的的结结果果，因因为为此此时时，峰峰面面积积已已不不能能较较为为准准确确地地表表示示质质量量；而而采采用用自自身身对对照照法法，则则可可避避免免该该情情况况的的发发生生，这这也也是是目目前推荐采用该法的原因所在。前推荐采用该法的原因所在。用紫外检测器，一般化合物的线性范围可达用紫外检测器，一般化合物的线性范围可达1106或或107，但也有一些测定物质，线性范围，但也有一些测定物质，线性范围较窄，此时便需要摸索其范围，但又不能单纯较窄，此时便需要摸索其范围，但又不能单纯考虑线性范围，还应着重考虑供试品溶液的浓考虑线性范围，

36、还应着重考虑供试品溶液的浓度才是最为重要的。度才是最为重要的。制剂测定中注意事项：制剂测定中注意事项：1.紫外鉴别中辅料的干扰，易使最大吸收波长偏离。紫外鉴别中辅料的干扰，易使最大吸收波长偏离。2.含含量量均均匀匀度度采采用用先先加加水水浸浸泡泡使使溶溶涨涨，再再超超声声使使崩崩散散，再再加加有机溶剂使主药溶解的办法进行，准确、可靠、易行。有机溶剂使主药溶解的办法进行，准确、可靠、易行。3.溶溶出出度度测测定定时时如如灵灵敏敏度度不不够够，可可通通过过加加大大进进样样量量的的办法解决。办法解决。对对照照品品溶溶液液配配制制、测测定定值值偏偏高高、过过滤滤损损失失等等问问题题一一定要注意。定要注

37、意。4.含含量量测测定定浓浓度度设设定定得得尽尽可可能能低低些些。测测定定值值与与投投料料量量的吻合性。色谱条件可与有关物质测定时的不一致。的吻合性。色谱条件可与有关物质测定时的不一致。5.有有关关物物质质注注意意辅辅料料的的影影响响，可可规规定定主主峰峰保保留留时间几倍前的辅料峰不计。单个杂质的设定。时间几倍前的辅料峰不计。单个杂质的设定。6勿需去除薄膜衣、糖衣！勿需去除薄膜衣、糖衣！2.5中国药典具体品种存在问题举例：中国药典具体品种存在问题举例：1.甲甲硫硫酸酸新新斯斯的的明明注注射射液液含含量量测测定定采采用用定定氮氮法法；BP同同品品种种采采用用UV、E值法测定，方法简便、易行。值法

38、测定，方法简便、易行。2.甲甲磺磺酸酸酚酚妥妥拉拉明明及及其其注注射射液液含含量量测测定定均均采采用用沉沉淀淀法法，经经多多次次操操作作后后测测定定，该该法法费费时时费费力力，且且易易造造成成损损失失、使使结结果果偏偏低低；BP和和USP同同品品种种均均采采用用氢氢氧氧化化四四丁丁基基铵铵直直接接滴滴定定的的方方法法，操操作简便、易行。作简便、易行。克克霉霉唑唑含含量量测测定定采采用用对对照照品品、容容量量分分析析滴滴定定法法测测定定。但但未未给给出出滴滴定定度度，故故滴滴定定时时不不知知该该选选用用何何种种体体积积的的滴滴定定管管和和大大约约消消耗耗的的体体积积数数，使使试试验验人人员员需需

39、经经多多次次试试验验进进行行摸摸索，浪费了人力、物力。索，浪费了人力、物力。4.酮康唑乳膏酮康唑乳膏含含量量测测定定采采用用有有机机溶溶剂剂多多次次提提取取，费费时时费费力力，且且必必造造成成一一定定的的损损失失（至至少少5%）。应应改改为为采采用用甲甲醇醇破破坏坏基基质质、溶溶解解主主药药后后，离离心心，取取上上清清液液直直接接进进行行HPLC法测定，结果准确、可靠，便于操作。法测定，结果准确、可靠，便于操作。5.盐酸布比卡因注射液盐酸布比卡因注射液含含量量测测定定极极为为烦烦琐琐，费费时时费费力力；BP和和USP同同品品种种采采用用HPLC法法测测定定，方法简便、易行。方法简便、易行。6.

40、提高办法，及时更改、完善提高办法，及时更改、完善!思考：下图说明什么？思考：下图说明什么？找原因找原因如图所示：同一份溶如图所示：同一份溶液进样两次。液进样两次。怎么会多出一个峰怎么会多出一个峰同一样品两份溶液，同一样品两份溶液，各自进样，出现图示各自进样，出现图示结果结果什么原因？什么原因？找原因找原因图示：上图为空白溶图示：上图为空白溶剂。中图为样品溶液。剂。中图为样品溶液。下图为自身对照。下图为自身对照。什么原因？什么原因？主峰不见了主峰不见了右图为空白溶剂图谱右图为空白溶剂图谱实验人员说在样品的实验人员说在样品的图谱上主峰不见了，图谱上主峰不见了，怎么回事？怎么回事？提高分离度有什么途

41、径？提高分离度有什么途径？增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。低塔板高度，提高柱效。增加选择性。当增加选择性。当1时，时，R0，无论柱效有，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：措施来改变选择性：a.改变流动相的组成及改变流动相的组成及pH值；值；b.改变柱温改变柱温c.改变固定相。改变固定相。提高分离度有什么途径？提高分离度有什么途径？改变容量因子。这常常是提高分离度改变容量因子。这

42、常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。组成来实现。k2趋于趋于0时，时，R也趋于也趋于0；k2增大，增大，R也增大。但也增大。但k2不能太大，否则不不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般响分离度和检测灵敏度。一般k2在在110范围内，最好为范围内，最好为25，窄径柱可更小些。，窄径柱可更小些。为什么要梯度洗脱为什么要梯度洗脱样品的保留范围宽样品的保留范围宽样品分子量样品分子量样品中含强保留成份样品中含强保留成份样品稀溶液的柱上浓样品稀溶液的柱上浓缩缩梯度洗脱时应注意

43、什么问题？梯度洗脱时应注意什么问题？要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。当有机溶互溶，使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心体，尤其使用磷酸盐时需特别小心梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。进行样品分析前以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂必

44、须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。产生气泡。梯度洗脱时应注意什么问题？梯度洗脱时应注意什么问题？混合溶剂的粘度常随组成而变化，因混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时

45、的两倍。因大约是甲醇或水为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。输液泵或色谱柱能承受的最大压力。梯度洗脱时应注意什么问题？梯度洗脱时应注意什么问题？每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。理，使其恢复到初始状态。1.1.在在100%B100%B结果运行一定时间结果运行一定时间(2(2 5个柱体积个柱体积)以洗以洗脱干扰物脱干扰物,或在每次分析结束后或在每次分析结束后,快速自最终快速自最终B%结结果运行一梯度至于果运行一梯度至于100%B100%B并维持一段

46、时间并维持一段时间柱平衡柱平衡:指用起始流动相冲洗色谱柱达到两相平衡。指用起始流动相冲洗色谱柱达到两相平衡。在每次进样前，用同方法及时间平衡色谱柱。在每次进样前，用同方法及时间平衡色谱柱。方法：方法：510510柱体积（柱体积（715ml715ml，对，对150mm150mm4.6mm4.6mm）。也可）。也可用反梯度平衡稳固需让用反梯度平衡稳固需让1030倍柱容积的初始流动相流经倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。梯度洗脱时，基线为什么漂移梯度洗脱时，基线为什么漂移在梯度洗脱中，基线漂移是常见的，尤其是低在梯度洗脱中，基

47、线漂移是常见的，尤其是低检测波长时更为严重。这是由于检测波长时更为严重。这是由于A和和B溶剂溶剂UV吸收不同造成的。吸收不同造成的。这种这种UV吸收相关的漂移可用吸收匹配法消除。吸收相关的漂移可用吸收匹配法消除。向向A溶剂加溶剂加UV吸收物。吸收物。注意：用注意：用UV低波长及高灵敏度检测时，运行低波长及高灵敏度检测时，运行空白试验，在色谱图中常常会出现一些空白试验，在色谱图中常常会出现一些“非样非样品峰，这些峰来自流动相及污染的色谱系统。品峰，这些峰来自流动相及污染的色谱系统。与检测器有关的故障及其排除与检测器有关的故障及其排除1）流动池内有气泡）流动池内有气泡如果有气泡连续不断地通过流动池

48、，将使噪如果有气泡连续不断地通过流动池，将使噪音增大，如果气泡较大，则会在基线上出现许音增大，如果气泡较大，则会在基线上出现许多线状多线状峰峰，这是由于系统内有气泡，需要对，这是由于系统内有气泡，需要对流动相进行充分的除气，检查整个色谱系统是流动相进行充分的除气，检查整个色谱系统是否漏气，再加大流量驱除系统内的气泡。如果否漏气，再加大流量驱除系统内的气泡。如果气泡停留在流动池内，也可能使噪音增大，可气泡停留在流动池内，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的办法除去气泡（最好不连采用突然增大流量的办法除去气泡（最好不连接色谱柱）；接色谱柱）；与检测器有关的故障及其排除与检测器有关的故障及其排除或

49、者启动输液泵的同时，用手指紧压流动池出或者启动输液泵的同时，用手指紧压流动池出口，使池内增压，然后放开。可反复操作数次，口，使池内增压，然后放开。可反复操作数次，但要注意不使压力增加太多，以免流动池破裂。但要注意不使压力增加太多，以免流动池破裂。2）流动池被污染）流动池被污染无论参比池或样品池被污染，都可能产生噪无论参比池或样品池被污染，都可能产生噪音或基线漂移。可以使用适当溶剂清洗检测池，音或基线漂移。可以使用适当溶剂清洗检测池，要注意溶剂的互溶性；如果污染严重，就需要要注意溶剂的互溶性；如果污染严重，就需要依次采用依次采用1mol/L硝酸、水和新鲜溶剂冲洗，或硝酸、水和新鲜溶剂冲洗，或者取

50、出池体进行清洗、更换窗口。者取出池体进行清洗、更换窗口。思考思考如何判断仪器哪一部分堵塞？如何判断仪器哪一部分堵塞？柱子如何再生？柱子如何再生？柱子反方向可以用吗？柱子反方向可以用吗？瓶内溶剂过滤器堵塞后的处理？瓶内溶剂过滤器堵塞后的处理？保留时间变化、出现肩峰或分叉、鬼峰、保留时间变化、出现肩峰或分叉、鬼峰、基线噪声、峰拖尾、峰展宽的可能原因基线噪声、峰拖尾、峰展宽的可能原因各有哪些？各有哪些？几个公式几个公式psi，bar，Mpa的关系的关系1bar=100Kpa=0.1Mpa=14.5psi1psi=1磅磅/平方英寸平方英寸1Kg=2.205磅磅1英寸英寸=2.54cm14.52.205

51、2.5429.81002=100kpa1psi=6.89kpa如何判断仪器哪一部分堵塞如何判断仪器哪一部分堵塞堵塞表现压力过高堵塞表现压力过高1 1拆拆去去保保护护预预柱柱，看看柱柱压压是是否否还还高高，否否则则是是保保护护柱柱的的问问题题，若若柱柱压压仍仍高高，再再检检查；查；2 2把把色色谱谱柱柱从从仪仪器器上上取取下下，看看压压力力是是否否下下降降，否否则则是是管管路路堵堵塞塞，需需清清洗洗，若若压力下降，再检查压力下降，再检查:如何判断仪器哪一部分堵塞如何判断仪器哪一部分堵塞3 3将柱子的进出口反过来接在仪器上，用将柱子的进出口反过来接在仪器上，用1010倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此

52、时不要连接倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查；如果柱压仍不下降，再检查；44更换柱子入口筛板，若柱压下更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系高，请与厂商联系瓶内溶剂过滤器堵塞后的处理瓶内溶剂过滤器堵塞后的处理？将过滤头从组件中取下，在将过滤头从组件中取下，在5mol/L硝酸硝酸超声超声15min,再用水超声并处理。再用水超声

53、并处理。谢谢谢谢大家！大家！1流动相比例调整：由于我国药品标准流动相比例调整：由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度，因中没有规定柱的长度及填料的粒度，因此每次新开检新品种时几乎都须调整流此每次新开检新品种时几乎都须调整流动相（按经验，主峰一般应调至保留时动相（按经验，主峰一般应调至保留时间为间为615分钟为宜）。所以建议第一次分钟为宜）。所以建议第一次检验时请少配流动相，以免浪费。弱电检验时请少配流动相，以免浪费。弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，解质的流动相其重现性更不容易达到，请注意充分平衡柱。请注意充分平衡柱。保留时间控制多少合适？保留时间控制多少合适？含量测定主成份峰保留时间一般不少于含量测定主成份峰保留时间一般不少于5分钟分钟有关物质检查一般在有关物质检查一般在1015分钟。分钟。定性时保留时间在多少范围内才算一致定性时保留时间在多少范围内才算一致？