《蛋白质的分离与化》PPT课件

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1、第第第 九 节九 节九 节 一 、 引 言二 、 蛋 白 质 （ 酶 ） 分离 纯 化 的 前 处 理三 、 蛋 白 质 （ 酶 ） 分 离与 纯 化四 、 层 析 技 术五 、 电 泳 技 术六 、 离 心 技 术 一 、一 、一 、 引 言引 言引 言 蛋 白 质 （ 酶 ） 存 在 于 一 切 生 物 体 中 ，是 非 常 重 要 的 生 物 大 分 子 。 蛋 白 质是 生 物 功 能 的 执 行 者 ， 担 负 着 生 物催 化 、 物 质 运 输 、 运 动 、 防 御 、 调控 及 记 忆 、 识 别 等 多 种 生 理 功 能 。 （ 一 ） 分 离 纯 化 的 意 义（ 一

2、） 分 离 纯 化 的 意 义（ 一 ） 分 离 纯 化 的 意 义 从 生 物 材 料 中 分 离 制 备 蛋 白 质 、 核 酸 ， 研 究 其结 构 与 功 能 ， 对 于 了 解 生 命 活 动 的 规 律 ， 阐 明生 命 现 象 的 本 质 有 重 大 意 义 。 工 业 生 产 的 需 要 ： 食 品 、 发 酵 、 纺 织 、 制 革 等工 业 ， 需 要 大 量 的 高 活 性 的 酶 制 剂 。 如 用 淀 粉酶 制 造 葡 萄 糖 、 麦 芽 糖 、 糊 精 以 及 糖 浆 等 。 医 疗 的 需 要 ： 如 用 猪 胰 岛 素 治 疗 糖 尿 病 。 基 因 工 程 的

3、 需 要 （ 二 ） 分 离 纯 化 的 要 求（ 二 ） 分 离 纯 化 的 要 求（ 二 ） 分 离 纯 化 的 要 求1、 纯 度 ： 主 要 取 决 于 研 究 的 目 的 和 应 用 上 的 要求 。 如 作 为 研 究 蛋 白 和 一 级 结 构 、 空 间 结 构 ，一 级 结 构 与 功 能 的 关 系 的 蛋 白 质 制 剂 、 工 具 酶和 标 准 蛋 白 、 酶 法 分 析 的 酶 制 剂 ， 都 要 求 均 一 ；工 业 、 医 药 方 面 应 用 的 酶 和 蛋 白 质 制 剂 ， 达 到一 定 纯 度 即 可 ， 不 要 求 均 一 。2、 活 性 ： 要 求 大

4、分 子 保 持 天 然 构 象 状 态 ， 有 高度 的 生 物 活 性 。3、 收 率 ： 希 望 收 率 越 高 越 好 ， 但 在 分 离 纯 化 过程 中 总 有 不 少 损 失 。 而 且 提 纯 步 骤 越 多 ， 损 失越 大 。 （ 三 ） 分 离 纯 化 的 一 般 程 序（ 三 ） 分 离 纯 化 的 一 般 程 序（ 三 ） 分 离 纯 化 的 一 般 程 序 生 物 大 分 子 的 分 离 纯 化 一 般可 分 为 以 下 几 个 阶 段 ： 材 料 的 选 择 和 预 处 理 破 碎 细 胞 及 提 取 （ 有 时 还需 要 进 行 细 胞 器 的 分 离 ） 分 离

5、 纯 化 ： 包 括 粗 分 级 分离 和 细 分 级 分 离 其 中 前 两 个 阶 段 为 生 物 大 分子 分 离 纯 化 的 前 处 理 。 选 择 材 料破 碎 细 胞提 取分 离 纯 化分 析 及 鉴 定 二 、二 、二 、 蛋 白 质 （ 酶 ）蛋 白 质 （ 酶 ）蛋 白 质 （ 酶 ） 分 离 纯 化 的 前 处 理分 离 纯 化 的 前 处 理分 离 纯 化 的 前 处 理（ 一 ） 材 料 的 选 择 与 预 处 理 选 择 材 料 主 要 根 据 实 验 目 的 而 定 。 工 业 生 产 上 注 意 选择 含 量 高 、 来 源 丰 富 、 易 获 得 、 制 备 工

6、 艺 简 单 、 成 本低 的 动 植 物 组 织 或 微 生 物 做 原 料 。 科 研 选 材 则 无 需 考虑 上 述 问 题 ， 只 要 能 达 到 实 验 目 的 即 可 。 实 验 材 料 选 定 后 ， 常 常 需 要 进 行 预 处 理 ， 如 动 物 材 料需 要 除 去 一 些 与 实 验 无 关 的 结 缔 组 织 、 脂 肪 组 织 ； 植物 种 子 需 要 除 壳 ； 微 生 物 需 要 将 菌 体 与 发 酵 液 分 开 。另 外 ， 必 须 尽 可 能 保 持 材 料 的 新 鲜 ， 尽 快 加 工 处 理 。若 不 立 即 进 行 实 验 或 加 工 ， 应 冷

7、 冻 保 存 。 （ 二 ） 细 胞 的 破 碎（ 二 ） 细 胞 的 破 碎（ 二 ） 细 胞 的 破 碎 分 离 提 取 某 一 生 物 大 分 子 ， 首 先 要 求 生 物 大 分子 从 原 来 的 组 织 或 细 胞 中 以 溶 解 的 状 态 释 放 出来 ， 并 保 持 原 来 的 天 然 状 态 ， 不 丢 生 物 活 性 。因 此 应 选 择 适 当 的 方 法 将 组 织 和 细 胞 破 碎 。 但若 材 料 是 体 液 （ 如 血 ） 或 生 物 体 分 泌 到 体 外 的分 泌 物 ， 则 不 必 进 行 组 织 细 胞 的 破 碎 。 组 织 细 胞 的 破 碎 方

8、法 很 多 ， 不 同 的 实 验 规 模 ，不 同 的 实 验 材 料 和 实 验 要 求 ， 使 用 的 破 碎 方 法和 条 件 也 不 同 。 1. 机 械 法 ： 1) 研 磨 ： 将 剪 碎 的 动 物 组 织 置 于 研 钵 或匀 浆 器 中 ， 加 入 少 量 石 英 砂 研 磨 或 匀 浆 。 2) 组 织 捣 碎 器 ： 这 是 一 种 较 剧 烈 的 破 碎细 胞 的 方 法 ， 通 常 可 先 用 家 用 食 品 加 工机 将 组 织 打 碎 ， 然 后 再 用 10000r/min20000r/min的 内 刀 式 组 织 捣 碎 机 (即 高 速分 散 器 )将 组

9、 织 的 细 胞 打 碎 。 2.物 理 法 ： 1) 反 复 冻 融 法 ： 将 待 破 碎 的 细 胞 冷 至 15 到 20 ， 然 后 放 于 室 温 (或 40 )迅 速 融 化 ， 如 此 反 复 冻融 多 次 ， 由 于 细 胞 内 形 成 冰 粒 使 剩 余 胞 液 的 盐 浓 度增 高 而 引 起 细 胞 溶 胀 破 碎 。 2) 超 声 波 处 理 法 ： 此 法 是 借 助 超 声 波 的 振 动 力 破 碎细 胞 壁 和 细 胞 器 。 破 碎 微 生 物 细 菌 和 酵 母 菌 时 ， 时间 要 长 一 些 。 3) 压 榨 法 ： 这 是 一 种 温 和 的 、 彻

10、 底 破 碎 细 胞 的 方 法 。在 1000 105Pa 2000 105Pa 的 高 压 下 使 细 胞 悬 液 通过 一 个 小 孔 突 然 释 放 至 常 压 ， 细 胞 将 彻 底 破 碎 。 4) 冷 热 交 替 法 ： 从 细 菌 或 病 毒 中 提 取 蛋 白 质 和 核 酸时 可 用 此 法 。 在 90 左 右 维 持 数 分 钟 ， 立 即 放 入 冰浴 中 使 之 冷 却 ， 如 此 反 复 多 次 ， 绝 大 部 分 细 胞 可 以被 破 碎 。 3. 化 学 与 生 物 化 学 方 法 ： 1) 自 溶 法 ： 将 新 鲜 的 生 物 材 料 存 放 于 一 定

11、的 pH和 适当 的 温 度 下 ， 细 胞 结 构 在 自 身 所 具 有 的 各 种 水 解 酶（ 如 蛋 白 酶 和 酯 酶 等 ） 的 作 用 下 发 生 溶 解 ， 使 细 胞内 含 物 释 放 出 来 。 2) 溶 胀 法 ： 细 胞 膜 为 天 然 的 半 透 膜 ， 在 低 渗 溶 液 和低 浓 度 的 稀 盐 溶 液 中 ， 由 于 存 在 渗 透 压 差 ， 溶 剂 分子 大 量 进 入 细 胞 ， 将 细 胞 膜 胀 破 释 放 出 细 胞 内 含 物 。 3) 酶 解 法 ： 利 用 各 种 水 解 酶 ， 如 溶 菌 酶 、 纤 维 素酶 、 蜗 牛 酶 和 酯 酶

12、等 ， 于 37 ， pH8， 处 理 15分 钟 ，可 以 专 一 性 地 将 细 胞 壁 分 解 。 4) 有 机 溶 剂 处 理 法 ： 利 用 氯 仿 、 甲 苯 、 丙 酮 等 脂 溶性 溶 剂 或 SDS（ 十 二 烷 基 硫 酸 钠 ） 等 表 面 活 性 剂 处理 细 胞 ， 可 将 细 胞 膜 溶 解 ， 从 而 使 细 胞 破 裂 ， 此 法也 可 以 与 研 磨 法 联 合 使 用 。 （ 三 ） 细 胞 器 的 分 离（ 三 ） 细 胞 器 的 分 离（ 三 ） 细 胞 器 的 分 离 细 胞 器 包 括 细 胞 核 、 线 粒 体 、 核 糖 体 、 内 质 网 ，

13、植 物细 胞 还 有 叶 绿 体 。 如 果 要 分 离 制 备 分 布 在 这 些 细 胞 器 中 的 生 物 大 分 子 ，为 了 防 止 其 他 细 胞 组 分 中 的 物 质 对 制 备 物 的 干 扰 或 污染 ， 还 需 先 将 细 胞 器 分 离 出 来 ， 然 后 在 某 一 细 胞 器 中分 离 某 一 物 质 。 细 胞 器 的 分 离 一 般 采 用 差 速 离 心 法 ， 即 将 破 碎 后 的 细胞 在 适 当 的 介 质 中 进 行 离 心 ， 常 用 的 介 质 有 蔗 糖 、 甘露 醇 、 柠 檬 酸 、 聚 乙 二 醇 等 。 各 种 细 胞 组 分 按 质

14、量 大小 的 不 同 ， 经 过 不 同 速 度 的 离 心 后 ， 沉 降 于 离 心 管 的不 同 部 位 ， 经 多 次 分 步 离 心 后 ， 即 可 获 得 所 需 组 分 。 （ 四 ） 提 取（ 四 ） 提 取（ 四 ） 提 取 组 织 细 胞 破 碎 过 程 中 ， 大 量 的 胞 内 酶 及 细 胞 内含 物 被 释 放 出 来 ， 必 须 立 即 将 其 置 于 一 定 条 件下 和 溶 剂 中 ， 让 制 备 物 充 分 溶 解 ， 并 尽 可 能 保持 原 来 的 天 然 状 态 ， 避 免 因 长 久 放 置 造 成 制 备物 的 分 解 破 坏 ， 这 就 是 提

15、取 。 1. 影 响 提 取 的 因 素影 响 提 取 的 因 素影 响 提 取 的 因 素 目 的 产 物 在 提 取 的 溶 剂 中 溶 解 度 的 大 小 ； 由 固 相 扩 散 到 液 相 的 难 易 ； 溶 剂 的 pH值 和 提 取 时 间 等 。通 常 ： 极 性 物 质 易 溶 于 极 性 溶 剂 ， 非 极 性 物 质 易 溶于 非 极 性 溶 剂 ； 碱 性 物 质 易 溶 于 酸 性 溶 剂 ， 酸 性 物 质 易 溶 于碱 性 溶 剂 ； 温 度 升 高 ， 溶 解 度 加 大 ； 远 离 等 电 点 的 pH值 ， 溶 解 度 增 加 。 提 取 时 所 选 择 的

16、条 件 应 有 利 于 目 的 产 物 溶 解 度 的增 加 和 保 持 其 生 物 活 性 。 2. 水 溶 液 提 取水 溶 液 提 取水 溶 液 提 取 蛋 白 质 和 酶 的 提 取 一 般 以 水 溶 液 为 主 。 用 水 溶 液 提 取 生 物 大分 子 应 注 意 的 几 个 主 要 影 响 因 素 是 ： 1) 盐 浓 度 （ 即 离 子 强 度 ） ： 离 子 强 度 对 生 物 大 分 子 的 溶 解 度 有 极 大 的 影 响 ， 绝 大 多 数 蛋白 质 和 酶 ， 在 低 离 子 强 度 的 溶 液 中 都 有 较 大 的 溶 解 度 ， 如 在纯 水 中 加 入

17、少 量 中 性 盐 ， 蛋 白 质 的 溶 解 度 比 在 纯 水 时 大 大 增加 ， 称 为 “ 盐 溶 ” 现 象 。 盐 溶 现 象 的 产 生 主 要 是 少 量 离 子 的活 动 ， 减 少 了 偶 极 分 子 之 间 极 性 基 团 的 静 电 吸 引 力 ， 增 加 了溶 质 和 溶 剂 分 子 间 相 互 作 用 力 的 结 果 。 为 了 提 高 提 取 效 率 ， 有 时 需 要 降 低 或 提 高 溶 剂 的 极 性 。 向 水溶 液 中 加 入 蔗 糖 或 甘 油 可 使 其 极 性 降 低 ， 增 加 离 子 强 度 （ 如加 入 KCl、 NaCl、 NH 4Cl

18、或 (NH4)2SO4） 可 以 增 加 溶 液 的 极 性 。 2) pH值 ： 蛋 白 质 、 酶 的 溶 解 度 和 稳 定 性 与pH值 有 关 。 过 酸 、 过 碱 均 应 尽 量 避 免 ， 一 般控 制 在 pH=6 8范 围 内 ， 提 取 溶 剂 的 pH应 在蛋 白 质 和 酶 的 稳 定 范 围 内 ， 通 常 选 择 偏 离 等电 点 的 两 侧 。 3) 温 度 ： 为 防 止 变 性 和 降 解 ， 制 备 具 有 活 性的 蛋 白 质 和 酶 ， 提 取 时 一 般 在 0 5 的 低温 操 作 。 4) 防 止 蛋 白 酶 的 降 解 作 用 ： 加 入 抑

19、制 剂 或调 节 提 取 液 的 pH、 离 子 强 度 或 极 性 等 方 法 使相 应 的 水 解 酶 失 去 活 性 ， 防 止 它 们 对 欲 提 纯的 蛋 白 质 、 酶 的 降 解 作 用 。 5) 搅 拌 与 氧 化 ： 搅 拌 能 促 使 被 提 取 物 的溶 解 ， 一 般 采 用 温 和 搅 拌 为 宜 ， 速 度 太快 容 易 产 生 大 量 泡 沫 ， 增 大 了 与 空 气 的接 触 面 ， 会 引 起 酶 等 物 质 的 变 性 失 活 。因 为 一 般 蛋 白 质 都 含 有 相 当 数 量 的 巯 基 ，有 些 巯 基 常 常 是 活 性 部 位 的 必 需 基

20、 团 ，若 提 取 液 中 有 氧 化 剂 或 与 空 气 中 的 氧 气接 触 过 多 都 会 使 巯 基 氧 化 为 分 子 内 或 分子 间 的 二 硫 键 ， 导 致 酶 活 性 的 丧 失 。 在提 取 液 中 加 入 少 量 巯 基 乙 醇 或 二 硫 苏 糖醇 以 防 止 巯 基 氧 化 。 3. 有 机 溶 剂 提 取有 机 溶 剂 提 取有 机 溶 剂 提 取 一 些 和 脂 类 结 合 比 较 牢 固 或 分 子 中 非 极 性 侧 链 较 多的 蛋 白 质 和 酶 难 溶 于 水 、 稀 盐 、 稀 酸 、 或 稀 碱 中 ，常 用 不 同 比 例 的 有 机 溶 剂 提

21、 取 。 常 用 的 有 机 溶 剂 有 乙 醇 、 丙 酮 、 异 丙 醇 、 正 丁 酮等 ， 这 些 溶 剂 可 以 与 水 互 溶 或 部 分 互 溶 ， 同 时 具 有亲 水 性 和 亲 脂 性 。 有 些 蛋 白 质 和 酶 既 溶 于 稀 酸 、 稀 碱 ， 又 能 溶 于 含有 一 定 比 例 的 有 机 溶 剂 的 水 溶 液 中 ， 在 这 种 情 况 下 ，采 用 稀 的 有 机 溶 液 提 取 常 常 可 以 防 止 水 解 酶 的 破 坏 ，并 兼 有 除 去 杂 质 提 高 纯 化 效 果 的 作 用 。 例 如 ， 胰 岛 素 。 三 、 分 离 与 纯 化三 、

22、 分 离 与 纯 化三 、 分 离 与 纯 化 从 细 胞 中 提 取 得 到 的 生 物 大 分 子 往 往 是 不 纯 净的 ， 含 有 大 量 杂 质 ， 必 须 进 一 步 分 离 纯 化 ， 这一 阶 段 可 分 为 粗 分 级 分 离 和 细 分 级 分 离 两 步 进行 。 蛋 白 质 分 离 纯 化 的 方 法 很 多 ， 主 要 是 根 据 蛋 白分 子 之 间 特 异 性 的 差 异 ， 如 分 子 大 小 ， 溶 解 度 ，电 荷 等 建 立 起 来 的 。 常 用 的 蛋 白 质 分 离 纯 化 技 术常 用 的 蛋 白 质 分 离 纯 化 技 术常 用 的 蛋 白 质

23、 分 离 纯 化 技 术溶 解 度 盐 析 、 等 电 点 沉 淀 、有 机 溶 剂 沉 淀分 子 大 小 透 析 、 超 过 滤 密 度 梯 度 离 心 、 凝胶 过 滤带 电 特 性 电 泳 、 离 子 交 换 层 析吸 附 特 性 吸 附 层 析对 配 体 分 子的 亲 和 性依 据 性 质 方 法用 于 粗 分 用 于 细 分 亲 和 层 析 、 金 属螯 合 层 析 （ 一 ） 粗 分 级 分 离（ 一 ） 粗 分 级 分 离（ 一 ） 粗 分 级 分 离 主 要 是 利 用 盐 析 法 、 等 电 点 沉 淀 、 有 机 溶 剂 沉淀 等 方 法 ， 使 目 的 蛋 白 与 其 它

24、 较 大 量 的 杂 蛋 白分 开 。 优 点 ： 简 便 、 处 理 量 大 、 既 能 除 去 大 量 杂 质 ，又 能 浓 缩 蛋 白 质 。 缺 点 ： 分 辨 率 低 ， 产 品 杂 质 多 。 1. 盐 析 （盐 析 （盐 析 （ 中 性 盐 沉 淀中 性 盐 沉 淀中 性 盐 沉 淀 ） 在 溶 液 中 加 入 中 性 盐 使 生 物 大 分 子 沉 淀 析 出的 过 程 称 为 “ 盐 析 ” 。 除 了 蛋 白 质 和 酶 以 外 ，多 肽 、 多 糖 和 核 酸 等 都 可 以 用 盐 析 法 进 行 沉淀 分 离 。 盐 析 法 应 用 最 广 的 还 是 在 蛋 白 质

25、 领 域 ， 已有 八 十 多 年 的 历 史 ， 其 突 出 的 优 点 是 ： 成 本 低 ， 不 需 要 特 别 昂 贵 的 设 备 。 操 作 简 单 、 安 全 。 对 许 多 生 物 活 性 物 质 具 有 稳 定 作 用 。 盐 析 的 基 本 原 理盐 析 的 基 本 原 理盐 析 的 基 本 原 理 蛋 白 质 溶 液 为 亲 水 溶 胶 体 系 ， 其 稳 定 因素 ： 水 化 膜 和 电 荷 。 中 性 盐 的 亲 水 性 大 于 蛋 白 质 分 子 的 亲 水性 。 加 入 大 量 中 性 盐 后 ， 夺 走 了 水 分 子 ， 破坏 了 水 膜 ， 暴 露 出 疏 水

26、 区 域 ， 同 时 又 中和 了 电 荷 ， 破 坏 了 亲 水 溶 胶 ， 蛋 白 质 分子 即 形 成 沉 淀 。 溶解度 盐 浓 度Salting-outSalting-in 脱 水 脱 水 脱 水带 负 电 荷 蛋 白 质（ 疏 水 胶 体 ）阴 离 子 阳 离 子碱酸 酸蛋 白 质蛋 白 质蛋 白 质 聚 集聚 集聚 集 沉 淀沉 淀沉 淀碱水 化 膜带 正 电 荷 蛋 白 质（ 疏 水 胶 体 ） 中 性 盐 的 选 择中 性 盐 的 选 择中 性 盐 的 选 择 常 用 的 中 性 盐 中 最 重 要 的 是 （ NH4） 2SO4，因 为 它 与 其 他 常 用 盐 类 相

27、比 有 十 分 突 出 的优 点 ： 1) 溶 解 度 大 ： 尤 其 是 在 低 温 时 仍 有 相 当高 的 溶 解 度 ， 这 是 其 他 盐 类 所 不 具 备 的 。由 于 酶 和 各 种 蛋 白 质 通 常 是 在 低 温 下 稳 定 ，因 而 盐 析 操 作 也 要 求 在 低 温 下 （ 0 4 ）进 行 。 由 下 表 可 以 看 到 ， 硫 铵 在 0 时 的溶 解 度 ， 远 远 高 于 其 它 盐 类 ： 几 种 盐 在 不 同 温 度 下 的 溶 解 度 （ 克几 种 盐 在 不 同 温 度 下 的 溶 解 度 （ 克几 种 盐 在 不 同 温 度 下 的 溶 解 度

28、 （ 克 /100毫 升 水 ）毫 升 水 ）毫 升 水 ） 0 20 80 100 （ NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH 2PO4 1.6 7.8 93.8 101 硫 铵 在 0 时 的 溶 解 度 ， 远 远 高 于 其 它 盐 类 ： 2) 分 离 效 果 好 ： 有 的 提 取 液 加 入 适 量硫 酸 铵 盐 析 ， 一 步 就 可 以 除 去 75 的杂 蛋 白 ， 纯 度 提 高 了 四 倍 。 3) 不 易 引 起 变 性 ， 有 稳 定 酶 与 蛋 白 质结 构 的 作 用 。 有 的 酶 或

29、 蛋 白 质 用 23mol/L浓 度 的 （ NH4） 2SO4保 存 可 达数 年 之 久 。 4) 价 格 便 宜 ， 废 液 不 污 染 环 境 。 （ 3） 分 段 盐 析） 分 段 盐 析） 分 段 盐 析 不 同 的 蛋 白 质 分 子 ， 由 于 其 分 子 表 面 的 极 性 基 团 的种 类 、 数 目 以 及 排 布 的 不 同 ， 其 水 化 层 厚 度 不 同 ，故 盐 析 所 需 要 的 盐 浓 度 也 不 一 样 ， 因 此 调 节 蛋 白 质的 中 盐 浓 度 ， 可 以 使 不 同 的 蛋 白 质 分 别 沉 淀 。血 清 球 蛋 白 清 蛋 白(NH4)2S

30、O450%饱 和 度 饱 和析 出 析 出饱 和 度 ： 在 给 定 条 件 下 以 可 能 达 到 的 最 大 浓 度 的 百分 数 表 示 的 盐 浓 度 。 硫 酸 铵 饱 和 度硫 酸 铵 饱 和 度硫 酸 铵 饱 和 度 （ 4） 盐 析 的 影 响 因 素） 盐 析 的 影 响 因 素） 盐 析 的 影 响 因 素 1) 蛋 白 质 的 浓 度 ： 高 浓 度 的 蛋 白 质 用 稍 低 的 硫 酸 铵饱 和 度 沉 淀 ， 若 蛋 白 质 浓 度 过 高 ， 易 产 生 各 种 蛋 白质 的 共 沉 淀 作 用 。 低 浓 度 的 蛋 白 质 ， 共 沉 淀 作 用 小 ，但 回

31、 收 率 降 低 。 较 适 中 的 蛋 白 质 浓 度 是 2.5 3.0 ，相 当 于 25 mg/mL 30mg/mL。 2) pH值 对 盐 析 的 影 响 ： 在 等 电 点 处 溶 解 度 小 ， pH值常 选 在 该 蛋 白 质 的 等 电 点 附 近 。 3) 温 度 的 影 响 ： 对 于 蛋 白 质 、 酶 和 多 肽 等 生 物 大 分子 ， 在 高 离 子 强 度 溶 液 中 ， 温 度 升 高 ， 它 们 的 溶 解度 反 而 减 小 。 在 低 离 子 强 度 溶 液 或 纯 水 中 蛋 白 质 的溶 解 度 大 多 数 还 是 随 浓 度 升 高 而 增 加 的

32、。 一 般 情 况下 ， 可 在 室 温 下 进 行 。 但 对 于 某 些 对 温 度 敏 感 的 酶 ，要 求 在 0 4 下 操 作 ， 以 避 免 活 力 丧 失 。 2.有 机 溶 剂 沉 淀 法有 机 溶 剂 沉 淀 法有 机 溶 剂 沉 淀 法 基 本 原 理 有 机 溶 剂 对 于 许 多 蛋 白 质 （ 酶 ） 、 核 酸 、 多 糖 和小 分 子 生 化 物 质 都 能 发 生 沉 淀 作 用 ， 是 较 早 使 用 的沉 淀 方 法 之 一 。 其 原 理 主 要 是 ： 降 低 水 溶 液 的 介 电 常 数 ， 向 溶 液 中 加 入 有 机 溶剂 能 降 低 溶 液

33、 的 介 电 常 数 ， 减 小 溶 剂 的 极 性 ， 从 而削 弱 了 溶 剂 分 子 与 蛋 白 质 分 子 间 的 相 互 作 用 力 ， 导致 蛋 白 质 溶 解 度 降 低 而 沉 淀 。 由 于 使 用 的 有 机 溶 剂 与 水 互 溶 ， 它 们 在 溶 解 于水 的 同 时 从 蛋 白 质 分 子 周 围 的 水 化 层 中 夺 走 了 水 分子 ， 破 坏 了 蛋 白 质 分 子 的 水 膜 ， 因 而 发 生 沉 淀 作 用 。 （ 2） 有 机 溶 剂 沉 淀 法 的 优 点） 有 机 溶 剂 沉 淀 法 的 优 点） 有 机 溶 剂 沉 淀 法 的 优 点 分 辨

34、能 力 比 盐 析 法 高 ， 即 一 种 蛋 白 质或 其 他 溶 质 只 在 一 个 比 较 窄 的 有 机 溶 剂浓 度 范 围 内 沉 淀 。 沉 淀 不 用 脱 盐 ， 过 滤 比 较 容 易 （ 如 有必 要 ， 可 用 透 析 袋 脱 有 机 溶 剂 ） 。 因 而在 生 化 制 备 中 有 广 泛 的 应 用 。 其 缺 点 是 对 某 些 具 有 生 物 活 性 的 大 分 子容 易 引 起 变 性 失 活 ， 操 作 需 在 低 温 下 进行 。 （ 3） 有 机 溶 剂 的 选 择 和 浓 度 的 计 算） 有 机 溶 剂 的 选 择 和 浓 度 的 计 算） 有 机 溶

35、 剂 的 选 择 和 浓 度 的 计 算 用 于 生 化 制 备 的 有 机 溶 剂 的 选 择 首 先 是要 能 与 水 互 溶 。 沉 淀 蛋 白 质 和 酶 常 用 的是 乙 醇 、 甲 醇 和 丙 酮 。 为 了 获 得 沉 淀 而 不 着 重 于 进 行 分 离 ，可 用 溶 液 体 积 的 倍 数 ： 如 加 入 一 倍 、 二倍 、 三 倍 原 溶 液 体 积 的 有 机 溶 剂 ， 来 进行 有 机 溶 剂 沉 淀 。 （ 4） 有 机 溶 剂 沉 淀 的 影 响 因 素） 有 机 溶 剂 沉 淀 的 影 响 因 素） 有 机 溶 剂 沉 淀 的 影 响 因 素 1) 温 度

36、： 多 数 生 物 大 分 子 如 蛋 白 质 、 酶 和 核 酸 在有 机 溶 剂 中 对 温 度 特 别 敏 感 ， 温 度 稍 高 就 会 引 起 变性 ， 且 有 机 溶 剂 与 水 混 合 时 产 生 放 热 反 应 ， 因 此 必须 预 冷 ， 操 作 要 在 冰 盐 浴 中 进 行 ， 加 入 有 机 溶 剂 时必 须 缓 慢 且 不 断 搅 拌 以 免 局 部 过 浓 。 一 般 规 律 是 温 度 越 低 ， 得 到 的 蛋 白 质 活 性 越 高 。 2) 样 品 浓 度 ： 低 浓 度 样 品 回 收 率 低 ， 要 使 用 比 例更 大 的 有 机 溶 剂 进 行 沉

37、淀 。 高 浓 度 样 品 ， 可 以 节 省有 机 溶 剂 ， 减 少 变 性 的 危 险 ， 但 杂 蛋 白 的 共 沉 淀 作用 大 。 通 常 使 用 5mg/mL 20mg/mL的 蛋 白 质 初 浓 度 为 宜 。 3) pH值 ： 选 择 在 样 品 稳 定 的 pH值 范 围 内 ， 通 常 是选 在 等 电 点 附 近 ， 从 而 提 高 此 沉 淀 法 的 分 辨 能 力 。 4) 离 子 强 度 ： 盐 浓 度 太 大 或 太 小 都 有 不 利 影 响 ，通 常 盐 浓 度 以 不 超 过 5 为 宜 ， 使 用 乙 醇 的 量 也 以不 超 过 原 蛋 白 质 水 溶

38、 液 的 倍 体 积 为 宜 ， 少 量 的中 性 盐 对 蛋 白 质 变 性 有 良 好 的 保 护 作 用 ， 但 盐 浓度 过 高 会 增 加 蛋 白 质 在 水 中 的 溶 解 度 ， 降 低 了 沉淀 效 果 ， 通 常 是 在 低 浓 度 缓 冲 液 中 沉 淀 蛋 白 质 。 沉 淀 所 得 的 固 体 样 品 ， 如 果 不 是 立 即 溶 解 进 行下 一 步 的 分 离 ， 则 应 尽 可 能 抽 干 沉 淀 ， 减 少 其 中有 机 溶 剂 的 含 量 ， 如 若 必 要 可 以 装 透 析 袋 透 析 脱有 机 溶 剂 ， 以 免 影 响 样 品 的 生 物 活 性 。

39、 3.等 电 点 沉 淀 法等 电 点 沉 淀 法等 电 点 沉 淀 法 利 用 具 有 不 同 等 电 点 的 两 性 电 解 质 ， 在 达 到 电中 性 时 溶 解 度 最 低 ， 易 发 生 沉 淀 ， 从 而 实 现 分离 的 方 法 。 氨 基 酸 、 蛋 白 质 、 酶 和 核 酸 都 是 两性 电 解 质 ， 可 以 利 用 此 法 进 行 初 步 的 沉 淀 分 离 。 由 于 许 多 蛋 白 质 的 等 电 点 十 分 接 近 ， 而 且 带 有水 膜 的 蛋 白 质 等 生 物 大 分 子 仍 有 一 定 的 溶 解 度 ，不 能 完 全 沉 淀 析 出 ， 因 此 ，

40、单 独 使 用 此 法 分 辨率 较 低 ， 因 而 此 法 常 与 盐 析 法 、 有 机 溶 剂 沉 淀法 或 其 他 沉 淀 剂 一 起 配 合 使 用 ， 以 提 高 沉 淀 能力 和 分 离 效 果 。 此 法 主 要 用 于 在 分 离 纯 化 流 程 中 去 除 杂 蛋 白 ，而 不 用 于 沉 淀 目 的 物 。 pH 和 离 子 强 度 对 -乳 球 蛋 白 溶 解 度 的 影 响 4. 选 择 性 变 性 沉 淀 法选 择 性 变 性 沉 淀 法选 择 性 变 性 沉 淀 法 这 一 方 法 是 利 用 生 物 大 分 子 与 非 目 的 生 物 大 分 子 在 物理 化

41、学 性 质 等 方 面 的 差 异 ， 选 择 一 定 的 条 件 使 杂 蛋 白等 非 目 的 物 变 性 沉 淀 而 得 到 分 离 提 纯 。 热 变 性 利 用 生 物 大 分 子 对 热 的 稳 定 性 不 同 ， 加 热 升 高 温 度使 非 目 的 生 物 大 分 子 变 性 沉 淀 而 保 留 目 的 物 在 溶 液 中 。 表 面 活 性 剂 和 有 机 溶 剂 变 性 使 那 些 对 表 面 活 性 剂 和 有 机 溶 剂 敏 感 性 强 的 杂 蛋 白 变性 沉 淀 。 通 常 在 冰 浴 或 冷 室 中 进 行 。 选 择 性 酸 碱 变 性 利 用 对 pH值 的 稳

42、 定 性 不 同 而 使 杂 蛋 白 变 性 沉 淀 。通 常 是 在 分 离 纯 化 流 程 中 附 带 进 行 的 分 离 纯 化 步 骤 。 5. 有 机 聚 合 物 沉 淀 法有 机 聚 合 物 沉 淀 法有 机 聚 合 物 沉 淀 法 有 机 聚 合 物 是 六 十 年 代 发 展 起 来 的 一 类 重 要 的 沉 淀 剂 ， 最 早应 用 于 提 纯 免 疫 球 蛋 白 和 沉 淀 一 些 细 菌 和 病 毒 。 近 年 来 广 泛用 于 核 酸 和 酶 的 纯 化 。 其 中 应 用 最 多 的 是 “ 聚 乙 二 醇 ” 【 HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n 4

43、)】( Polyethylene Glycol 简 写 为 PEG )， 它 的 亲 水 性 强 ， 溶 干 水和 许 多 有 机 溶 剂 ， 对 热 稳 定 ， 有 广 泛 围 的 分 子 量 ， 在 生 物 大分 子 制 备 中 ， 用 的 较 多 的 是 分 子 量 为 6000 20000的 PEG。 本 方 法 的 优 点 是 ： 操 作 条 件 温 和 ， 不 易 引 起 生 物 大 分 子 变 性 。 沉 淀 效 能 高 ， 使 用 很 少 量 的 PEG即 可 以 沉 淀 相 当 多 的 生 物大 分 子 。 沉 淀 后 有 机 聚 合 物 容 易 去 除 。 6. 透 析透

44、析透 析 自 Thomas Graham 1861年 发 明 透 析 方 法 至 今 已 有一 百 多 年 。 透 析 已 成 为 生 物 化 学 实 验 室 最 简 便 最常 用 的 分 离 纯 化 技 术 之 一 。 在 生 物 大 分 子 的 制 备过 程 中 ， 除 盐 、 除 少 量 有 机 溶 剂 、 除 去 生 物 小 分子 杂 质 和 浓 缩 样 品 等 都 要 用 到 透 析 的 技 术 。 透 析 只 需 要 使 用 专 用 的 半 透 膜 即 可 完 成 。 保 留在 透 析 袋 内 未 透 析 出 的 样 品 溶 液 称 为 “ 保 留 液 ” ，袋 （ 膜 ） 外 的

45、 溶 液 称 为 “ 渗 出 液 ” 或 “ 透 析 液 ” 。截 留 分 子 量 MwCO通 常 为 1万 左 右 。 用 1 BaCl 2检 查 (NH4)2SO4， 用 1 AgNO3 检 查NaCl、 KCl等 。 7. 超 滤超 滤超 滤 超 过 滤 即 超 滤 ， 自 20年 代 问 世 后 ， 直 至 60年 代 以来 发 展 迅 速 ， 很 快 由 实 验 室 规 模 的 分 离 手 段 发 展成 重 要 的 工 业 单 元 操 作 技 术 。 超 滤 现 已 成 为 一 种 重 要 的 生 化 实 验 技 术 ， 广 泛 用于 含 有 各 种 小 分 子 溶 质 的 各 种

46、生 物 大 分 子 （ 如 蛋白 质 、 酶 、 核 酸 等 ） 的 浓 缩 、 分 离 和 纯 化 。 超 滤 是 一 种 加 压 膜 分 离 技 术 ， 即 在 一 定 的 压 力 下 ，使 小 分 子 溶 质 和 溶 剂 穿 过 一 定 孔 径 的 特 制 的 薄 膜 ，而 使 大 分 子 溶 质 不 能 透 过 ， 留 在 膜 的 一 边 ， 从 而使 大 分 子 物 质 得 到 了 部 分 的 纯 化 。 加 压 的 蛋白 质 溶 液 浓 缩 的 蛋白 质 溶 液含 小 分 子的 溶 液 超 滤 根 据 所 加 的 操 作 压 力 和 所 用 膜 的 平 均 孔 径 的不 同 ， 可

47、 分 为 微 孔 过 滤 、 超 滤 和 反 渗 透 三 种 。 微 孔 过 滤 所 用 的 操 作 压 通 常 小 于 4 104Pa， 膜的 平 均 孔 径 为 500埃 14微 米 （ 1微 米 104埃 ） ，用 于 分 离 较 大 的 微 粒 、 细 菌 和 污 染 物 等 。 超 滤 所 用 操 作 压 为 4 104Pa 7 105Pa， 膜 的 平均 孔 径 为 10100埃 ， 用 于 分 离 大 分 子 溶 质 。 反 渗 透 所 用 的 操 作 压 比 超 滤 更 大 ， 常 达 到35 105Pa 140 105Pa， 膜 的 平 均 孔 径 最 小 ， 一般 为 10

48、埃 以 下 ， 用 于 分 离 小 分 子 溶 质 ， 如 海 水 脱盐 ， 制 高 纯 水 等 。 （ 二 ） 精 分 级 分 离（ 二 ） 精 分 级 分 离（ 二 ） 精 分 级 分 离一 般 蛋 白 质 样 品 经 粗 制 分 级 后 ， 体 积 较 小 ， 杂 质大 部 分 被 除 去 。 进 一 步 提 纯 ， 通 常 使 用 高 分 辨率 的 柱 层 析 及 电 泳 方 法 。 常 用 的 柱 层 析 方 法 有 分 子 筛 层 析 、 离 子 交 换 层析 、 疏 水 吸 附 层 析 、 亲 和 层 析 和 金 属 螯 合 层 析等 。 常 用 的 电 泳 方 法 有 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 、 等 电聚 焦 电 泳 等 。 另 外 ， 结 晶 也 是 蛋 白 质 分 离 纯 化 的 方 法 之 一 ，制 备 的 结 晶 物 常 常 作 为 蛋 白 质 结 构 分 析 之 用 。 To Be Continued YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY