流式细胞仪原理

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1、流式细胞术简介一、流式细胞术发展简史流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型 分析技术和分选技术其特点是：测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞；可 进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统 计学意义；是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细 胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果;既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采 集和分析技术等。FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面

2、的心血和成果。1934年，Moldavan首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用 显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞, 因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。1953年 Crosland Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的 鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。于是设计了一个流 动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液;细胞悬浮液和 鞘液都在作层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。1956年,C

3、oulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了 Coulter计数器。其基本原理 是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小 孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和 数目方面的信息。1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检 测设备计数的装置.1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞, 既能分析计数，又能进行细胞分选的装置这样就基本完成了现代FCM计数技术的主要历程。现代的FCM数据采集和分析技术是从组织化学发源的，其开拓者是Kamentsky。

4、1965年, Kamentsky在组织化学的基础上提出了两个新设想:（1）细胞的组分是可以用光光度学来定 量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学的重要信息。（2）细胞的不同 组分可以同时进行多参数测量，从而可以对细胞进行分类换句话说，对同一细胞可以同时获 得有关不同组分的多方面信息，用作鉴别细胞的依据。Kamentsky不仅思路敏捷，而且能身 体力行。他是第一个把计算机接口接到仪器上并记录分析了多参数数据的人，也是第一个采 用了二维直方图来显示和分析多参数的人。流式细胞术在细胞化学中的应用的先驱者是Van Dilla和美国的Los Alamos小组。他们在 1967年研制出流液束

5、、照明光轴、检测系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基础上，首 次用荧光Feulgen反应对DNA染色显示出DNA的活性与荧光之间存在着线性关系，并在 DNA的直方图上清楚地显示出细胞周期的各个时相。Gohde和Dittrich接着把这项技术推 向实用，他们用流式细胞术测定细胞周期借以研究细胞药代动力学问题。FCM用于免疫组织 化学中的关键是对细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应用并没有多大差异。近20年来，国内外在FCM上都做了不少的研究和应用工作，也取得了不少成果。特别是 随着仪器和方法和日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工 作以扩大FCM的应用领域和使用效

6、果.FCM在免疫组织化学中的应用也大致差不多，并注 重了在临床应用的推广。二、流式细胞计的基本结构和工作原理流式细胞计是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体 中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量 范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量 一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白 的多少。也就是说，它的细节分辨率为零。国外又把流式细胞计称作荧光激活细胞分选器(Fluorescenee Activated Cell Sorter, FACS)。

7、美国BectonDickinson 公司生产的流 式细胞计系列均冠以FACS字头。目前我国国内使用的仪器多为美国、西欧及日本等国的 产品，国内有些单位也已研制成功，但尚无定型产品面市。1。流式细胞计的基本结构流式细胞计主要由四部分组成。它们是：流动室和液流系统激光 源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统图10-1为其结构示意图。图101流式细胞计结构示意图(1) 流动室和液流系统：流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等 透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个 细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，

8、包围在样品外周 后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度u10m/s。由于鞘液的作用，被 检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。(2) 激光源和光学系统：经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收 集检测常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配和氪离子激 光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。汞灯是最常用的弧光 灯,其发射光谱大部分集中于300400nm,很适合需要用紫外光激发的场合。氩离子激光器 的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光

9、器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在 550nm以上，可使用染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份可使原激光器的 光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有 Rhodami ne 6G水溶液的染料激光器，则可得到550650nm连续可调的激光，尤在590nm处 转换效率最高，约可占到一半。为使细胞得到均匀照射,并提高分辨率，照射到细胞上的激 光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。光斑直径d可由下式确定： d=4入f/nD.入为激光波长；f为透镜焦距；D为激光束直径。色散棱镜用来选择激光的波长，

10、调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长入。为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光 讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片。带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段 的光线滤除或通过.例如使用525nm带通滤片只允许FITC(Fluoresceinisothiocyanate,异 硫氰荧光素)发射的525nm绿光通过。长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线 通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫分析中常要同时探测两种以上的波 长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。(3) 光电管和检测系统：经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是

11、通过光电转 换器转变成电信号而进行测量的。光电倍增管(PMT)最为常用。PMT的响应时间短，仅 为ns数量级；光谱响应特性好，在200900nm的光谱区，光量子产额都比较高光电倍增 管的增益从103到108可连续调节，因此对弱光测量十分有利。光电管运行时特别要注意 稳定性问题，工作电压要十分稳定，工作电流及功率不能太大。一般功耗低于0。5W；最 大阳极电流在几个毫安。此外要注意对光电管进行暗适应处理，并注意良好的磁屏蔽在使 用中还要注意安装位置不同的PMT，因为光谱响应特性不同，不宜互换。也有用硅光电二极 管的,它在强光下稳定性比PMT好。从PMT输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分

12、析仪器。流式细胞计中一般备 有两类放大器。一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系，称为线性放大器线性放大器 适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例DNA测量等。另一类 是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大 器。因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群,它们的荧光强度相差1 2个数量级;而且在多色免疫荧光测量中，用对数放大器采集数据易于解释。此外还有调节便 利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。(4) 计算机和分析系统：经放大后的电信号被送往计算机分析器。多道的道数是和电信号的 脉冲高度相对应的，也是和光

13、信号的强弱相关的。对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的 细胞相对数目。多道分析器出来的信号再经模一数转换器输往微机处理器编成数据文件，或 存贮于计算机的硬盘和软盘上，或存于仪器内以备调用。计算机的存贮容量较大，可存贮同 一细胞的68个参数。存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现，进行数据处理和分 析,最后给出结果。除上述四个主要部分外，还备有电源及压缩气体等附加装置。2。流式细胞计的工作原理下面分别简要介绍流式细胞计有关的参数测量、样品分选及数据 处理等工作原理.（1）参数测量原理：流式细胞计可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧 光散射信号。测量是在测量区进行的，所谓测量区

14、就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直 相交点。液流中央的单个细胞通过测量区时,受到激光照射会向立体角为2n的整个空间散射 光线，散射光的波长和入射光的波长相同.散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、 质膜和细胞内部结构密切相关，因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特 性有关。未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号 对不经染色活细胞进行分析和分选.经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其 散射光信号当然不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关，还跟散射角、 及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。在流式细胞术测量中，常用

15、的是两种散射方向的散射光测量：前向角（即0。角）散射（FSC）； 侧向散射（SSC），又称90。角散射。这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射 光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。一般说来，前向角散射光的强度与细胞 的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大;对球形活细胞经实验表明在小 立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系;对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异 很大，尤其需要注意。侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的 有关信息。侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、胞质、核膜的折射 率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵

16、敏反映。在实际使用中，仪器首先要对光散射信号进行测量。当光散射分析与荧光探针联合使用时， 可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别 出某些亚群。荧光信号主要包括两部分：自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所 发出的荧光;特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光 强度较弱，波长也与照射激光不同自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧 光信号的分辨和测量。在免疫细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说如何 提高信噪比是个关键。一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子（例核黄素、细胞 色素等)的含量

17、越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强； 细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：尽量选用较亮的荧光染料；选用适宜的 激光和滤片光学系统;采用电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。(2) 样品分选原理：流式细胞计的分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是由喷嘴 射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选, 而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集 器中;其它液体被当作废液抽吸掉，某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。稳定的小液滴是由

18、流动室上的压电晶体在几十KHz的电信号作用下发生振动而迫使液流均 匀断裂而形成的一般液滴间距约距约数百pm。实验经验公式f=v/4.5d给出形成稳定水滴的 振荡信号频率。其中v是液流速度,d为喷孔直径。由此可知使用不同孔径的喷孔及改变液 流速度，可能会改变分选效果使分选的含细胞液滴在静电场中的偏转是由充电电路和偏转 板共同完成的。充电电压一般选+150V,或一150V;偏转板间的电位差为数千伏。充电电路 中的充电脉冲发生器是由逻辑电路控制的，因此从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一 段延迟时间，一般为数十ms。精确测定延迟时间是决定分选质量的关键，仪器多采用移位 寄存器数字电路来产生延迟。可

19、根据具体要求予以适当调整。(50)数据处理原理：FCM的数据处理主要包括数据的显示和分析，至于对仪器给出的结果 如何解释则随所要解决的具体问题而定。数据显示:FCM的数据显示方式包括单参数直方图(histogram)、二维点图(dot plot)、二维 等高图(contour )、假三维图(pseudo 3D)和列表模式(list mode)等。直方图是一维数据用昨最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同 一般XY平面描图仪给出的曲线。根据选择放大器类型不同，横座标可以是线性标度或对 数标度，用“道数”(Channel No。)来表示，实质上是所测的荧光或散射光的强度。纵座

20、标一般 表示的是细胞的相对数。图102给出的是直方图形式。只能显示一个参数与细胞之间的 关系是它的局限性。二维点图能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系横座标和纵座标分别为与细胞有 关的两个独立参数，平面上每一个点表示同时具有相应座标植的细胞存在（图10-3）。可 以由二维点图得到两个一维直方图，但是由于兼并现象存在，二维点图的信息量要大于二个 一维直方图的信息量。所谓兼并就是说多个细胞具有相同的二维座标在图上只表现为一个 点，这样对细胞点密集的地方就难于显示它的精细结构.100 ooo图102直方图图10-3二维点图二维等高图类似于地图上的等高线表示法。它是为了克服二维点图的不足而设置的

21、显示方 法。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即等高”。曲线层次越高所 代表的细胞数愈多。一般层次所表示的细胞数间隔是相等的，因此等高线越密集则表示变化 率越大，等高线越疏则表示变化平衡。图10-4给出了二维等高图的样式.假三维图是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方法。它把原二维图中的隐 座标一细胞数同时显现，但参数维图可以通过旋转、倾斜等操作，以便多方位的观察山峰” 和“谷地”的结构和细节，这无疑是有助于对数据进行分析的图10-5为假三维图的示意图.C/aniriE图104二维等高图图105假三维图列表模式其实只是多参数数据文件的一种计算机存贮方式，三个以上的

22、参数数据显示是用多 个直方图、二维图和假三维图来完成的。可用List Mode中的特殊技术，开窗或用游标调出 相关部分再改变维数进行显示。例如，“一调二就是在一维图上调出二维图来；“二调一就 是从二维图中调出一维图来。图10-6给出了从二维图等高图中调出相应窗口的直方图的示 意图。art图106从一维图设窗调出直方图示意上面简要地介绍了几种数据显示形式，在实际应用中，可根据需要选择匹配，以便了解和获 得尽可能多的有用信息。 数据分析:数据分析的方法总的可分为参数方法和非参数方法两大类。当被检测的生物学 系统能够用某种数学模型技术时则多使用参数方法。数学模型可以是一个方程或方程组，方 程的参数产

23、生所需要的信息来自所测的数据。例如在测定老鼠精子的DNA含量时，可以获 取细胞频数的尖锐波形分布。如果采用正态分布函数来描述这些数据，则参数即为面积、平 均值和标准偏差。方程的数据拟合则通常使用最小二乘法。而非参数分析法对测量得到的分 布形状不需要做任何假设，即采用无设定参数分析法。分析程序可以很简单只需要直观观 测频数分布;也可能很复杂，要对两个或多个直方图逐道地进行比较。逐点描图（或用手工，或用描图仪、计算机系统）是大家常用的数据分析的重要手段。我们 常可以用来了解数据的特性、寻找那些不曾预料的特异征兆、选择统计分析的模型、显示最 终结果等事实上，不经过先对数据进行直观观察分析就决不应该对

24、这批数据进行数值分析。 从这一点来看，非参数分析是参数分析的基础.逐道比较工作量较大，但用直观法很容易发现明显的差异，特别是对照组和测试组。考虑到 FCM的可靠性，要注意到对每组测量，都要有对照组，对照组可以是空白对照组、阴性对 照组、或零时刻对照组等，具体设置应根据整体实验要求而定。对照组和测试组的逐道比较 往往可以减少许多不必要的误差和错误解释。顺便指出,进行比较时对曲线的总细胞数进行 归一化处理，甚至对两条曲线逐道相减而得到差结果曲线”往往是适宜的.因为数据分析往往和结果解释关系十分密切，也就是说和生物学背景相关，因此具体的分析 法和原理将在后面结合实例再介绍。3流式细胞计的技术参数为了

25、表征仪器性能，往往根据使用目的和要求而提出几个技术参 数或指标来定量说明。对于流式细胞计常用的技术指标有荧光分辨率、荧光灵敏度、适用样 品浓度、分选纯度、可分析测量参数等。(1)荧光分辨率：强度一定的荧光在测量时是在一定道址上的一个正态分布的峰，荧光分辨 率是指两相邻的峰可分辨的最小间隔。通常用变异系数(C.V值)来表示。C.V的定义式为:C.V=o/p式中，o为标准偏差,p是平均值.在实际应用中，我们使用挖关系式o=0.423FWHM；其中FWHM为峰在峰高一半处的峰宽 值目前仪器的荧光分辨率均优于2.0%。(2) 荧光灵敏度:反映仪器所能探测的最小荧光光强的大小。一般用荧光微球上所标可测出

26、 的FITC(fluorescein isothiocyanate异硫氰基荧光素)的最少分子数来表示.目前仪器均可 达到1000左右。(3) 分析速度/分选速度：仪器每秒种可分析/分选的数目。一般分析速度为500010000； 分选速度掌握在1000以下。(4) 样品浓度：主要给出仪器工作时样品浓度的适用范围。一般在10507细胞/ml的数量 级。其它技术参数尚多，不再一一介绍。4。流式细胞计的调试和使用古语说：“工欲善其事，必先利其器”要想很好地应用流式细胞 分析和分选技术，必需先对仪器进行调试，使其处于良好的工作状态，并能正确使用仪器。 下面简要介绍细胞计的调试项目及要点、使用的程序等等。

27、（1）调试和校准：流式细胞计在使用前，甚至在使用过程中都要精心进行调试以保证工作的 可靠性和最佳性。调试的项目主要是激光强度、液流速度和测量区的光路等。激光强度：除调整反射镜的角度以调整到所需波长的激光出光外，还要结合显示屏上的光谱 曲线使激光的强度输出为最大.液流速度：可通过操作台数字显示监督，调节气体压力大小以获得稳定的液流速度.测量区光路调节：这是调试工作的关键需要保证在测量区的液流、激光束、90。散射测量 光电系统垂直正交，而且交点较小。一般可在用标准荧光微球等校准中完成流式细胞术中所测得的量是相对值，因此需要在使用前或使用中对系统进行校准或标定，这 样才能通过相对测量获得绝对的意义因

28、而FCM中的校准具有双重功能:仪器的准直调整和 定量标度。标准样品应该稳定，有形成份形状应是大小比较一致球形，样品分散性能良好, 且经济、容易获得。常用标准荧光微球作为非生物学标准样品,鸡血红细胞做为生物学标准 样品。微球用树脂材料制作,或标有荧光素，或不标记荧光素。Flow Cytometry Stands公司 可提供荧光强度药盒，在免疫实验中可用来作为定量荧光标准来测定每个细胞所标记的抗原 位点数目。所用的鸡血红细胞标准样品制作过程昭下：取3。8%枸橼酸或肝素抗凝的鸡血 （抗凝剂：鸡血=1： 4）,经PBS清洗3次，再用510ml的1.0%戊二醛与清洗后的鸡 红细胞混合，室温下振荡醛化24

29、h,最后经PBS再清洗，贮4C冰箱中备用。需要指出的是因 为未经荧光染色，所测光信号为鸡血红蛋白的自发荧光.（2）仪器的操作和使用： 打开电源，对系统进行预热； 打开气体阈，调节压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统； 在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统； 利用校准标准样品，调整仪器,使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基 础上，0。和90。散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小； 选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品；同时选 择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程； 样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统； 因为实验数据已存入计算机硬盘（有的机器还备有光盘系统，存贮量更大），因此可关闭气 体、测量装置,而单独使用计算机进行数据处理； 将所需结果打印出来。在操作和使用中一定要注意如下事项：1）光电倍增管要求稳定的工作条件，暴露的较强的光线下以后，需要较长时间的“暗适应”以消 除或降低部分暗电流本底才能工作；另外还要注意磁屏蔽；2）光源不得在短时间内（一般要1h左右）关上又打开；使用光源必须预热并注意冷却系统工 作是否正常；3）液流系统必需随时保持液流畅通，避免气泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要经过过滤、 消毒；4）注意根据测量对象的变换选用合适的滤片系统、放大器的类型等；5）特别强度每次测量都需要对照组.