细胞培养过程中的遗传变异

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1、细 胞 培 养 过 程 中 的 遗 传 变 异 离 体 培 养 中 的 遗 传 与 变 异 特 点 体 细 胞 变 异 的 基 础 体 细 胞 突 变 体 诱 导 与 筛 选 的 方 法 遗 传 与 变 异 特 点 离 体 培 养 的 遗 传 稳 定 性 离 体 培 养 下 的 变 异 影 响 体 细 胞 遗 传 与 变 异 的 因 素 离 体 培 养 的 遗 传 稳 定 性 离 体 培 养 的 细 胞 学 基 础 是 有 丝 分 裂 ， 有丝 分 裂 的 DNA半 保 留 复 制 和 染 色 体 的 均等 分 裂 机 制 ， 从 理 论 上 可 以 保 证 离 体 培养 物 在 一 般 情

2、况 下 的 遗 传 稳 定 性 。 离 体 培 养 的 遗 传 稳 定 性 表 现 的 另 一 个 方面 是 即 使 发 生 某 些 变 异 ， 只 需 根 据 需 要选 择 适 当 的 培 养 方 式 进 行 离 体 繁 殖 ， 即可 淘 汰 或 选 择 变 异 、 或 分 离 纯 合 体 。 离 体 培 养 下 的 变 异 特 点 普 遍 性 ： 变 异 可 发 生 在 各 种 培 养 类 型 中 ； 各 种 培 养 植 物 中 局 限 性 ： 从 表 型 上 看 ， 在 不 同 植 物 类 型 中 经 常 发 生 的 体 细胞 变 异 主 要 是 植 株 形 态 （ 株 高 、 叶 形

3、、 叶 色 等 ） 、生 长 势 、 育 性 、 某 些 抗 性 等 性 状 的 变 异 。 从 生 理 生 化 特 性 上 看 ， 容 易 出 现 同 功 酶 谱 、 次 生代 谢 的 消 长 等 变 异 。 嵌 合 性 ： 嵌 合 性 是 指 同 一 有 机 体 中 同 时 存 在 有 遗 传 组 成 不同 的 细 胞 。 嵌 合 体 可 以 以 不 同 倍 性 的 形 式 存 在 ， 必 须 分 离 培养 才 能 纯 化 。 离 体 培 养 再 生 植 株 的 表 型 变 异 频 率植 物 种 类 再 生 植 株 来 源 变 异 频 率 (%)烟 草 体 细 胞 愈 伤 组 织 10水

4、稻 胚 愈 伤 组 织 71.9甘 蔗 幼 叶 愈 伤 组 织 18玉 米 体 细 胞 愈 伤 组 织 14大 麦 花 粉 植 株 10 15马 铃 薯 叶 肉 原 生 质 体 100菠 萝 顶 芽 愈 伤 组 织 7腋 芽 愈 伤 组 织 34幼 果 愈 伤 组 织 100 离 体 培 养 变 异 的 影 响 因 素 供 体 植 物 遗 传 背 景倍 性 水 平 ， 二 倍 体 比 单 倍 体 稳 定基 因 型 生 理 状 态来 源 于 茎 尖 的 愈 伤 组 织 的 DNA含 量 及 染 色体 数 的 稳 定 性 好 于 来 源 于 薄 壁 细 胞 的 继 代 培 养 的 次 数 培 养

5、基 及 培 养 方 式 1.8 亚 二 倍 体 是 指 正 常 的 46条 染 色 体 丢 失 一 个 或 多 个 染 色 体 继 代 次 数 越 多 ， 细 胞 变 异 概 率 越 高 培 养 基 及 培 养 方 式 不 同 的 激 素 浓 度 可 以 有 选 择 地 诱 导 不 同 倍性 的 细 胞 的 分 裂 。 豌 豆 ， 低 浓 度 2,4-D(0.25 mg/L) 多 倍 体 高 浓 度 2,4-D(20 mg/L) 二 倍 体 激 素 除 了 引 起 染 色 体 倍 性 的 增 加 外 ， 在 一些 培 养 中 还 发 现 染 色 体 倍 性 减 少 的 现 象 。 蚕 豆 ，

6、无 激 素 多 倍 体 发 生 频 率 6.31% 10NAA， 2.5KT-单 倍 体 13.3 培 养 基 的 物 理 状 态 以 及 培 养 类 型 也 会 引 起细 胞 的 变 异 。 一 般 来 讲 ， 悬 浮 培 养 的 细 胞较 半 固 体 培 养 的 细 胞 易 产 生 变 异 。 体 细 胞 变 异 的 基 础 遗 传 学 基 础 DNA在 核 内 重 复 复 制 同 源 多 倍 体培 养 天 数 不 同 DNA值 细 胞 比 例 （ ）2C 2c4c 8c0 88.3 11.75 80.7 16.8 2.513 4.8 79.5 6.6 9.117 9.7 81.5 7.9

7、 0.9硬 粒 小 麦 中 胚 轴 培 养 中 DNA值 的 变 化 体 细 胞 变 异 的 基 础 遗 传 学 基 础 染 色 体 断 裂 与 重 组 非 整 倍 体 、 四 倍 体 产 生 染 色 体 结 构 变 异 的 一 般 不 能 正 常 生 长 染 色 体 畸 变 中 出 现 的 双 着 丝 粒 染 色 体 在 细 胞 分 裂 后 期 如 不 能 被 拉 断 ， 就 会 在 两 核 之 间 形 成 染 色 体 桥 ， 出 现四 倍 体 。 体 细 胞 变 异 的 基 础 遗 传 学 基 础 非 正 常 有 丝 分 裂 非 整 倍 体 体 细 胞 变 异 的 基 础 分 子 遗 传

8、学 基 础 碱 基 突 变 DNA序 列 的 选 择 性 扩 增 与 丢 失 抗 除 草 剂 草 甘 磷 ， 3-烯 醇 丙 酮 酸 莽 草 酸 -5-磷 酸 合 成 酶 转 座 子 活 化 DNA甲 基 化 突 变 的 类 型 及 应 用 自 发 突 变 (spontaneous mutation) 离 体 培 养 再 生 植 株 的 自 发 变 异 比 自 然 条 件下 的 变 异 高 得 多 ， 一 般 可 高 出 几 百 倍 诱 导 突 变 (induced mutation) 物 理 诱 变 化 学 诱 变 复 合 因 子 诱 变 转 座 子 插 入 诱 变 诱 变 剂物 理 诱 变

9、 剂 化 学 诱 变 剂X, , ,射 线 及 紫 外 线 碱 基 类 似 物 诱 发 染 色 体断 裂 的 物 质烷 化 剂DNA复 制 中 ， “ 以 假乱 真 ” ， 如 5-溴 尿 嘧啶 (BU)、 2-氨 基 嘌 呤 等 带 有 不 稳 定 烷 基 ，能 改 变 DNA的 化 学 结构 。 甲 基 磺 酸 乙 酯 马 来 酰 肼 丝 裂 霉 素 转 座 子 插 入 诱 变 转 座 子 体 系 -玉 米 的 Ac/Ds系 统 Ac（ Activation， 意 为 活 化 ） 。 相 当 于 一 个 显性 因 子 ,它 位 于 9号 染 色 体 长 臂 上 ,Ac与 Ds （ Diss

10、ociation， 意 为 离 异 ） 隔 开 一 段 距 离 ,但却 能 遥 控 指 挥 Ds(Ds是 不 稳 定 的 ， 它 可 以 从 染色 体 的 一 个 位 点 跳 到 另 一 个 位 点 ) 转 座 子 作 用 ： 既 可 直 接 将 外 源 基 因 带 入 细 胞内 获 得 新 性 状 ， 又 可 以 独 立 插 入 通 过 其 转 座功 能 诱 导 变 异 。 转 座 子 插 入 诱 变 操 作 过 程 采 用 基 因 转 化 的 方 法 将 Ac/Ds导 入 受 体 细 胞 通 过 体 细 胞 培 养 或 再 生 植 株 的 自 交 或 侧 交 使Ac因 子 切 除 ， 由

11、于 转 座 子 插 入 的 随 机 性 ，即 可 在 切 除 Ac的 植 株 中 筛 选 出 不 同 变 异 。 成 果 ： 已 在 苜 蓿 （ 颜 色 改 变 ） 、 马 铃 薯 、番 茄 、 甘 蓝 等 多 种 植 物 上 获 得 可 利 用 的 体细 胞 变 异 植 株 。 突 变 体 的 应 用 创 造 育 种 中 间 材 料 或 直 接 筛 选 新 品 种 在 全 世 界 50多 个 国 家 中 ， 已 培 育 出 1000多 个 由直 接 突 变 获 得 的 或 由 这 些 突 变 体 杂 交 而 衍 生 的品 种 通 过 体 细 胞 诱 变 选 育 的 谷 类 作 物 品 种 中

12、 ， 品 质得 到 不 同 程 度 改 良 的 占 34.3 。 抗 病 ， 占 诱 变 品 种 的 1/4 耐 盐 抗 除 草 剂 耐 寒 耐 旱 突 变 体 的 应 用 遗 传 研 究 用 于 基 因 功 能 鉴 定 突 变 DNA序 列 用 于 分 子 标 记 发 育 生 物 学 研 究 用 于 建 立 器 官 发 育 模 式 分 析 鉴 定 一 些 基 因 的 表 达 与 植 物 发 育 的 关系 在 烟 草 、 玉 米 中 均 通 过 质 体 突 变 体 分 离 鉴 定 了与 植 物 叶 绿 体 发 育 的 基 因 突 变 体 的 应 用 生 化 代 谢 途 径 研 究 根 据 需

13、要 建 立 某 一 代 谢 途 径 中 每 一 个 调 节点 的 突 变 体 。 烟 草 硝 酸 还 原 酶 缺 失 突 变 体 cnx和 nia 具 有 实 用 性 的 突 变 体类 型 应 用抗 氨 基 酸 及 类 似 物 突 变 体 高 赖 氨 酸 水 稻 突 变 体抗 病 突 变 体 烟 草 抗 野 火 病 突 变 体抗 除 草 剂 突 变 体 烟 草 抗 “ 毒 莠 定 ” 突 变 体耐 盐 突 变 体 烟 草 已 选 择 出 抗 盐 突 变 体（ 1%2%NaCl)抗 金 属 离 子 突 变 体 抗 汞 、 铜 、 铝抗 逆 突 变 体 抗 旱 、 抗 低 温营 养 缺 陷 型 突

14、 变 体 银 杏 赖 氨 酸 营 养 缺 陷 型 突 变 体 筛 选方 法直 接 选 择 法 间 接 选 择 法 绿 岛 法正 选 择 法 负 选 择 法 直 接 选 择 法 正 选 择 法 ： 用 一 种 含 有 特 定 物 质 的 选 择 培 养 基 ， 在 其 上只 有 突 变 的 细 胞 能 够 生 长 ， 非 突 变 细 胞 不 能生 长 ， 从 而 直 接 筛 选 出 突 变 体 的 办 法 。 小 麦 幼 胚 愈 伤 组 织 -1.4%NaCl N6培 养 基 小 麦 耐 盐 系 。 900个 甘 薯 胚 性 细 胞 系 -射 线 -2.0%NaCl=22个 抗 盐 愈 伤 组

15、织 直 接 选 择 法 负 选 择 法 （ 富 集 选 择 法 ， 又 称 浓 缩 法 ） ： 在 特 定 培 养 基 中 ， 让 正 常 细 胞 生 长 繁 殖 ，突 变 体 细 胞 受 抑 制 不 分 裂 呈 休 眠 状 态 ， 然 后 用 一 种 能 毒 害 正 常 生 长 细 胞 ， 而 对 休眠 细 胞 无 害 的 药 物 淘 汰 正 常 细 胞 ， 再 用 正 常 培 养 基 恢 复 突 变 体 生 长 。 该 方 法 主 要 应 用 于 营 养 缺 陷 型 突 变 体 筛 选 。 间 接 选 择 法 间 接 选 择 法 是 一 种 借 助 于 与 突 变 表 现 型 有 关 的性

16、 状 作 为 选 择 指 标 的 筛 选 方 法 。 当 缺 乏 直 接 选 择 表 型 指 标 或 直 接 选 择 条 件 对细 胞 生 长 不 利 时 ， 可 考 虑 采 用 间 接 筛 选 法 如 脯 氨 酸 （ Pro）锦 橙 珠 心 悬 浮 细 胞 -射 线 -高 浓 度 Pro 细胞 内 Pro含 量 提 高 一 倍 耐 寒 愈 伤 及 植 株 。 抗 病 突 变 体 的 筛 选 也 常 常 用 间 接 筛 选 的 策 略 。 绿 岛 法 绿 岛 法 是 利 用 已 分 化 组 织 进 行 筛 选 和 鉴 定 的方 法 。 对 于 抗 病 毒 突 变 体 、 抗 除 草 剂 突 变

17、 体 的 筛 选 ，可 以 采 用 “ 绿 岛 法 ” 。 这 种 方 法 最 早 用 于 抗 除 草 剂 ， 叶 片 大 面 积 枯黄 ， 仅 有 少 量 抗 除 草 剂 突 变 细 胞 组 织 仍 保 持绿 色 ， 取 这 部 分 材 料 则 成 为 很 小 的 绿 岛 ， 因而 形 象 地 称 之 为 “ 绿 岛 法 ” 。 单 倍 体 烟 草 植 株 - -射 线 -除 草 剂 -叶 片 部分 变 黄 -取 出 绿 色 部 分 -愈 伤 组 织 =耐 除 草 剂的 单 倍 体 植 株 =二 倍 体 突 变 体 筛 选 程 序预 处 理预 培 养（ 悬 浮 或 平 板 ）诱 发 突 变（

18、 平 板 培 养 ）高 抗 高 产 细 胞 株 选 择（ 平 板 培 养 ）愈 伤 组 织 增 殖或 再 生 植 株 突 变 体 鉴 定 小 结 离 体 培 养 中 体 细 胞 变 异 发 生 是 普 遍 的 ，但 具 有 局 限 性 ， 变 异 的 程 度 可 以 通 过 培养 类 型 和 条 件 进 行 控 制 。 体 细 胞 变 异 可 自 发 产 生 也 可 通 过 理 化 因子 诱 导 产 生 。 利 用 体 细 胞 变 异 可 直 接 培 养 品 种 也 可 作为 生 物 学 相 关 研 究 的 基 础 材 料 。 将 离 体 培 养 技 术 与 诱 变 技 术 相 结 合 ， 可以 提 高 变 异 频 率 ， 增 加 变 异 选 择 的 基 础材 料 ， 丰 富 遗 传 资 源 。 思 考 题1 体 外 培 养 的 变 异 有 何 特 点 ？2 哪 些 因 素 会 影 响 培 养 物 的 遗 传 变 异 ？3 体 细 胞 无 性 系 变 异 的 诱 导 和 选 择 方 法 。4 体 细 胞 无 性 系 变 异 的 应 用 途 径 。