固相膜免疫测定课件

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1、催化的反响式为催化的反响式为DH2+H2O2D+2H2O,DH2+H2O2D+2H2O,何者习惯上何者习惯上被称为底物被称为底物 ()()经与经与HRPHRP反响后反响后,再用再用H2SO4H2SO4终止反响后呈终止反响后呈 ()A.A.橙黄色橙黄色 B.B.棕黄色棕黄色 C.C.黄色黄色 D.D.蓝色蓝色3 3、目前、目前ELISAELISA中应用最广泛的底物是中应用最广泛的底物是A.OPD B.TMB C.5-ASA A.OPD B.TMB C.5-ASA D.ABTS D.ABTS ABB双抗体夹心法是双抗体夹心法是 ()()A.A.酶标记特异抗体用于抗原的检测酶标记特异抗体用于抗原的检

2、测B.B.先将待测抗原包被于固相载体先将待测抗原包被于固相载体C.C.标记一种抗体可检测多种抗原标记一种抗体可检测多种抗原D.D.能用于半抗原的测定能用于半抗原的测定E.E.属竞争结合测定属竞争结合测定5.5.捕获法主要用于何种物质的测定捕获法主要用于何种物质的测定 ()()AA6 6、以下哪种方法用一种标记物可检测多种被测物、以下哪种方法用一种标记物可检测多种被测物 ()()双抗体夹心法双抗体夹心法 竞争法竞争法间接法间接法 捕获法捕获法E.E.放射免疫测定法放射免疫测定法7.7.关于关于ELISAELISA竟争法竟争法,正确的选项是正确的选项是()()A.A.用于检测抗原用于检测抗原 B.

3、B.被测物与酶标记物的免疫活性各不相同被测物与酶标记物的免疫活性各不相同 C.C.被测物多那么标记物被结合的时机少被测物多那么标记物被结合的时机少 D.D.待测管的颜色比参照管的淡表示被测物量少待测管的颜色比参照管的淡表示被测物量少E.E.结合于固相的酶标抗原量与样品中被测抗原量成结合于固相的酶标抗原量与样品中被测抗原量成正比正比CC1.1.每个亲和素能结合多少个分子的生物素每个亲和素能结合多少个分子的生物素A.1 B.2 C.3 D.4 A.1 B.2 C.3 D.4 2.2.生物素分子中与亲和素结合的主要部位是生物素分子中与亲和素结合的主要部位是 ()()A.A.噻吩环噻吩环 B.B.咪唑

4、酮环咪唑酮环 C.C.苯环苯环 D.D.羰基羰基 3.3.在用生物素标记酶时在用生物素标记酶时,酶活性会降低的是酶活性会降低的是A.HRP B.A.HRP B.葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 C.-Gal D.AP ()C.-Gal D.AP ()BD第十一章第十一章固相膜免疫分析技术固相膜免疫分析技术l掌握：掌握：免疫印迹试验免疫印迹试验l熟悉：熟悉：胶体金免疫技术的方法胶体金免疫技术的方法学种类与原理学种类与原理l了解：了解：胶体金与免疫金的制备、胶体金与免疫金的制备、其他膜载体免疫分析技术其他膜载体免疫分析技术第二节第二节 免疫层析试验免疫层析试验免疫层析试验原理：免疫层析试验原理：以以NCN

5、C膜等为固相载体，样品溶液借膜等为固相载体，样品溶液借助毛细作用在层析条上泳动，同时样品助毛细作用在层析条上泳动，同时样品中的待测物与层析材料上待测物的受体中的待测物与层析材料上待测物的受体抗原或抗体发生高特异性、高亲和抗原或抗体发生高特异性、高亲和性的免疫反响，层析过程中免疫复合物性的免疫反响，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域，被富集或截留在层析材料的一定区域，通过目测或仪器检测标记物，在短时间通过目测或仪器检测标记物，在短时间内得到直观的实验结果。内得到直观的实验结果。l毛细作用l是指浸润液体在细管里升高的现象和不浸润液体在细管里降低的现象第二节第二节 免疫层析试验免疫

6、层析试验免疫层析试验分为：免疫层析试验分为：胶体金免疫层析试验胶体金免疫层析试验ICAICA荧光免疫层析试验荧光免疫层析试验GICAGICA 二、二、测定模式测定模式一胶体金免疫层析试验一胶体金免疫层析试验l1、双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原l2 2、竞争法测小分子抗原、竞争法测小分子抗原l3 3、间接法测抗体、间接法测抗体 l胶体金免疫层析试胶体金免疫层析试验验A AG GC CB B双抗体夹心法测大分子抗原双抗体夹心法测大分子抗原阳性，阳性，2个条带个条带l胶体金免疫层析试验胶体金免疫层析试验A AG GC CB B竞争法测小分子抗原阴性，竞争法测小分子抗原阴性，2个条带个条带 三三

7、 技术要点技术要点操作要点：操作要点：1 1将试剂条标记线一端浸入待测标本中将试剂条标记线一端浸入待测标本中2-2-5s,5s,或在标本加样处加一定量待检标本或在标本加样处加一定量待检标本,平放平放于水平桌面上于水平桌面上2 2在在5-205-20分钟内观察结果分钟内观察结果结果判断结果判断 夹心法：阴性夹心法：阴性:1:1条棕红色指控条带条棕红色指控条带 阳性阳性:出现出现2 2条棕红色条带条棕红色条带 无棕红色无棕红色条带出现为试剂失效条带出现为试剂失效竞争法：阴性竞争法：阴性:出现出现2 2条棕红色条带。阳性条棕红色条带。阳性:1:1条条棕红色指控条带棕红色指控条带 第三节第三节 免疫渗

8、滤试验免疫渗滤试验1 1 原理原理在硝酸纤维素膜为载体并包被了抗在硝酸纤维素膜为载体并包被了抗原或抗体的渗滤装置中，依次滴加原或抗体的渗滤装置中，依次滴加标本、免疫金及洗涤液，因微孔滤标本、免疫金及洗涤液，因微孔滤膜贴置于吸水材料上故溶液流经渗膜贴置于吸水材料上故溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体快速滤装置时与膜上的抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用，到达检测目结合并起到浓缩作用，到达检测目的。的。2 2 方法类型方法类型双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原间接法测特异性抗体间接法测特异性抗体三、试剂盒组成和技术要点三、试剂盒组成和技术要点 渗滤装置渗滤装置胶体金标志物胶体金标志物洗涤液洗涤液

9、AgAg参照品参照品技术要点：技术要点：1 1、平放反响板，于小孔内滴加含待测、平放反响板，于小孔内滴加含待测AgAg标本标本1-21-2滴，与膜上的滴，与膜上的AbAb反响而结合在膜上反响而结合在膜上2 2、于小孔内滴加胶体金标记、于小孔内滴加胶体金标记AbAb试剂试剂1-21-2滴，滴，使胶体金标记使胶体金标记AbAb与结合在膜上的与结合在膜上的AgAg反响反响3 3、于小孔内滴加洗涤液、于小孔内滴加洗涤液2-32-3滴，待完全渗入，滴，待完全渗入，洗去未结合的胶体金标记洗去未结合的胶体金标记AbAb。4 4、结果观察：、结果观察：阳性阳性 膜中央有淡红色或红色斑点膜中央有淡红色或红色斑点

10、 第四节第四节.斑点酶免疫吸斑点酶免疫吸附试验附试验 (Dot-ELISA)(Dot-ELISA)l技术要点：技术要点：l1 1、抗原包被、抗原包被 NC NC膜吸附力强，膜吸附力强，包被后封闭。包被后封闭。l2 2、抗原抗体反响、抗原抗体反响 抗原抗体反抗原抗体反响后再加二抗响后再加二抗l3 3、确定酶结合物最正确稀释、确定酶结合物最正确稀释度度l阴性样品不显色，阳性显色最阴性样品不显色，阳性显色最强时的酶结合物稀释度强时的酶结合物稀释度l4 4、显色反响、显色反响 lpHpH值时反响最灵敏值时反响最灵敏l强阳性蓝黑色斑点强阳性蓝黑色斑点 l弱阳性淡绿色半点弱阳性淡绿色半点l方法学评价：方法

11、学评价：l1 1、NCNC吸附力强，吸附力强，l灵敏度较灵敏度较ELISAELISA高高6 68 8倍；倍；l2 2、可同时检测多种抗体；、可同时检测多种抗体；l3 3、操作简便不需特殊仪器设备、操作简便不需特殊仪器设备l4 4、吸附抗原抗体或已有结、吸附抗原抗体或已有结果的果的NCNC膜可长期保存，不影响膜可长期保存，不影响期活性。期活性。第五节第五节.免疫印迹试验免疫印迹试验 immunoblot test,IBTimmunoblot test,IBTl免疫印迹试验免疫印迹试验将凝胶电泳的高分辨率与抗原抗体将凝胶电泳的高分辨率与抗原抗体反响的高特异性结合反响的高特异性结合.又称又称West

12、ern Western blot.blot.是检测蛋白质特性、表达及是检测蛋白质特性、表达及分布的一种最常用的方法。分布的一种最常用的方法。l蛋白免疫印迹试验蛋白免疫印迹试验l重组免疫印迹试验重组免疫印迹试验 二二 Western blot Western blot技术要点技术要点:1.1.抗原印迹与包被抗原印迹与包被SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳电转移电转移 2.2.抗原抗体反响抗原抗体反响 间接法间接法3.3.检测检测lSDS-PAGESDS-PAGEl 抗原等蛋白样品经抗原等蛋白样品经SDSSDS处理处理后带阴电荷，在聚丙烯胺凝胶中后带阴电荷，在聚丙烯胺凝胶中从阴极

13、向阳极泳动，分子量越小，从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段别离效泳动速度就越快。此阶段别离效果肉眼不可见只有在染色后才果肉眼不可见只有在染色后才显出电泳区带显出电泳区带 l电转移电转移l 将在凝胶中已经别离的条将在凝胶中已经别离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压低电压100V100V和大电流和大电流1-2A1-2A，通电，通电45min45min转移即可完成。转移即可完成。此分阶段别离的蛋白质条带肉眼此分阶段别离的蛋白质条带肉眼仍不可见。仍不可见。l酶免疫定位酶免疫定位l 将印有蛋白质条带的硝酸将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜依次与特异性抗体和酶

14、纤维素膜依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，参加能形成标第二抗体作用后，参加能形成不溶性显色物的酶反响底物，使不溶性显色物的酶反响底物，使区带染色。阳性反响的条带清晰区带染色。阳性反响的条带清晰可辨，并可根据可辨，并可根据SDS-PAGESDS-PAGE参加的参加的分子量标准，确定各组分的分子分子量标准，确定各组分的分子量。量。免免 疫疫 印印 迹迹 法法 l三方法学评价：三方法学评价：l1 1、特异性强、特异性强l2 2、吸附蛋白能力强、吸附蛋白能力强l3 3、可同时检测多种抗体、可同时检测多种抗体l4 4、膜条的重复检测应用、膜条的重复检测应用第六节第六节 影响固相膜免疫试验的主要因素影响固相膜免疫试验的主要因素一一 试剂方面试剂方面二二 标本方面标本方面三三 实验过程实验过程第七节第七节 固相膜免疫分析技术的临床应用固相膜免疫分析技术的临床应用 激素、自身免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤、激素、自身免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤、心血管疾病、过敏原和毒品。心血管疾病、过敏原和毒品。