7新4ES胚胎干细胞

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1、胚胚 胎胎 干干 细细 胞胞王王 锋锋 王王 子子 玉玉逸夫楼逸夫楼3084 84395381南京农业大学动物胚胎工程技术中心南京农业大学动物胚胎工程技术中心动物胚胎工程之动物胚胎工程之内内 容容个体发生过程个体发生过程干细胞的概念干细胞的概念胚胎干细胞概念胚胎干细胞概念应用前景应用前景面临的问题及解决办法面临的问题及解决办法一一、个体发生过程、个体发生过程 受精受精 卵裂卵裂 受精后受精后72h 受精后受精后5-7天天精子精子+卵子卵子 合子合子 卵裂球卵裂球 桑椹胚桑椹胚 囊胚囊胚 滋养层滋养层胎盘及胎儿附属结构胎盘及胎儿附属结构囊胚囊胚 内胚层内胚层消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。

2、消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。内细胞群内细胞群 中胚层中胚层结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统 外胚层外胚层体表结构；神经系统体表结构；神经系统囊囊 胚胚ICM二、干细胞的概念二、干细胞的概念1、干细胞：、干细胞：具有自我复制的能力，在一定条件下能分具有自我复制的能力，在一定条件下能分化成各种功能细胞。化成各种功能细胞。2、分类、分类（1）全能干细胞，包括：）全能干细胞，包括：胚胎干细胞（胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES细胞）生殖干细胞（细胞）生殖干细胞（embryonic germ cells,EG细胞）细胞）具

3、有全能性，能够分化成所有细胞类型，具有全能性，能够分化成所有细胞类型，进一步形成机体进一步形成机体的任何组织和器官。的任何组织和器官。（2）多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，）多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力。但却失去了发育成完整个体的能力。（3）专能干细胞：只能向一种或密切相关的两种类型的）专能干细胞：只能向一种或密切相关的两种类型的细胞分化。细胞分化。干细胞是一种能够分裂成与自身一致的细胞或几种特殊分干细胞是一种能够分裂成与自身一致的细胞或几种特殊分化的细胞型的细胞。化的细胞型的细胞。动物体内干细胞的正常作用是在发育的过程中可提供不同动物

4、体内干细胞的正常作用是在发育的过程中可提供不同的细胞型的细胞型,以生长成不同的组织和器官。它们也提供替代以生长成不同的组织和器官。它们也提供替代细胞以修复身体不同部分的损伤。细胞以修复身体不同部分的损伤。干细胞疗法就是利用已特殊分化的干细胞干细胞疗法就是利用已特殊分化的干细胞,通过特殊的途径提供细胞去替代那些在退通过特殊的途径提供细胞去替代那些在退行性过程和损伤中失去的细胞。行性过程和损伤中失去的细胞。使用未分化干细胞也存在畸胎瘤和其他肿使用未分化干细胞也存在畸胎瘤和其他肿瘤形成的风险。瘤形成的风险。目前人干细胞的主要来源或者潜在来源如下目前人干细胞的主要来源或者潜在来源如下:胚泡胚泡,可以提

5、供多能干细胞可以提供多能干细胞;胎儿组织胎儿组织,可以提供多能或者专能干细胞可以提供多能或者专能干细胞;脐带血脐带血,可以提供专能干细胞可以提供专能干细胞;成人组织成人组织,可提供专能干细胞或单能干细胞。可提供专能干细胞或单能干细胞。三、胚胎干细胞三、胚胎干细胞1 1、概念、概念胚胎干细胞胚胎干细胞 (embryonic stem cells,ESC)(embryonic stem cells,ESC)是一种从是一种从早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞经分离、体外培早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞经分离、体外培养、克隆等得到的具有发育全能性的细胞。养、克隆等得到的具有发育全能性的细胞。ESES细胞可

6、不断保持增殖而不分化且在连续培养后仍细胞可不断保持增殖而不分化且在连续培养后仍能具有发育成三个胚层的潜能。能具有发育成三个胚层的潜能。这种细胞具有与早期胚胎相似的分化潜能和正常二这种细胞具有与早期胚胎相似的分化潜能和正常二倍体核型，因此兼有早期胚胎卵裂球及体细胞的某倍体核型，因此兼有早期胚胎卵裂球及体细胞的某些特性。些特性。ESES细胞的全能性（细胞的全能性（totipotentytotipotenty），是指），是指ESES细胞在细胞在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力，即各种组织的发育潜力，即ESES细胞发育成完整动物细胞

7、发育成完整动物体的能力体的能力。其实质是细胞基因组中决定蛋白质编。其实质是细胞基因组中决定蛋白质编码的所有基因按一定的时空顺序依次表达。码的所有基因按一定的时空顺序依次表达。ESES细胞是能在体外大量增殖的全能性细胞细胞是能在体外大量增殖的全能性细胞，可以，可以为细胞的遗传操作和细胞分化研究提供丰富的实为细胞的遗传操作和细胞分化研究提供丰富的实验材料。验材料。ESES细胞全能性的检测方法是以细胞全能性的检测方法是以胚胎干细胞进行细胚胎干细胞进行细胞核移植胞核移植。如果。如果ESES细胞能和去核的细胞融合发育细胞能和去核的细胞融合发育成重构胚，而且经过胚胎移植，重构胚能发育形成重构胚，而且经过胚

8、胎移植，重构胚能发育形成个体，则表明成个体，则表明ESES细胞具有全能性。细胞具有全能性。例如，将绵羊的类例如，将绵羊的类ESES细胞注射到去核卵母细胞中，细胞注射到去核卵母细胞中，获得重构胚。重构胚经过胚胎移植，有活的羔羊获得重构胚。重构胚经过胚胎移植，有活的羔羊产生，证明了绵羊的类产生，证明了绵羊的类ESES细胞具有发育全能性。细胞具有发育全能性。2 2、ESES细胞研究发展史细胞研究发展史19811981年，英国剑桥大学的年，英国剑桥大学的EvansEvans和和KaufmanKaufman用囊胚用囊胚内细胞团内细胞团(ICM)(ICM)建立小鼠建立小鼠ESES细胞系细胞系1998199

9、8年美国年美国ThomsonThomson从人的体外受精囊胚中分离从人的体外受精囊胚中分离得到了得到了ESES细胞。同年约翰霍普金斯大学的细胞。同年约翰霍普金斯大学的ShamblottShamblott等从人的等从人的PGCPGC细胞中分离得到人的全能细胞中分离得到人的全能性干细胞。性干细胞。人人ESES细胞的分离成功给人类的基因治疗和器官移细胞的分离成功给人类的基因治疗和器官移植打下了基础。植打下了基础。其他动物只获得了类其他动物只获得了类ESES细胞。细胞。19991999年年1212月，美国月，美国科学科学杂志公布了当年世界科学进展杂志公布了当年世界科学进展的评定结果，干细胞的研究成果列

10、在举世瞩目耗资巨大的的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。20022002年年3 3月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们首次利月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。目前已有报导目前已有报导ESES细胞能在适当条件下分化为细胞能在适当条件下分化为心肌细胞，胰心肌细胞，胰岛细胞，血管内皮细胞，肝细胞等。岛细胞，血管内皮细胞，肝

11、细胞等。1.1.衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞；衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞；2.2.永生化永生化(immortal)(immortal)；3.3.能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；4.4.有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；5.5.能参与胎儿所有组织的发育过程；能参与胎儿所有组织的发育过程；3 3、胚胎干细胞的性质、胚胎干细胞的性质4 4、胚胎干细胞系的建立过程、胚胎干细胞系的建立过程4.1 概述概述4.2 胚胎干细胞的分离胚胎干细胞的分离酶消化后培养酶消化后培养免疫方法去处滋养层细胞免疫方法去处

12、滋养层细胞流式细胞仪分离法流式细胞仪分离法4.3 培养条件：培养条件：(1)特殊的培养液：用特殊的培养液：用DMEM培养液，其中胎牛培养液，其中胎牛血清的浓度和质量很重要，加非必须氨基酸；血清的浓度和质量很重要，加非必须氨基酸；-巯基乙醇。巯基乙醇。(2)以人或胚鼠的成纤维细胞为以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养层细胞饲养层细胞。(3)必须加入必须加入LIF，抑制细胞分化。抑制细胞分化。早期胚胎及早期胚胎及PGCsPGCs的培养的培养将早期胚胎或将早期胚胎或PGCsPGCs置于饲养层或条件培养基上，置于饲养层或条件培养基上，在在5%CO5%CO2 2、37373939度条件下进行培养。度条件下进行培

13、养。培养液一般为培养液一般为DMEEM+15%FCSDMEEM+15%FCS。培养液中可添加多培养液中可添加多种细胞因子或分化抑制物，如种细胞因子或分化抑制物，如LIF.EGF.IGF.3-LIF.EGF.IGF.3-巯巯基乙醇等。基乙醇等。传传 代代进行体外培养时，当进行体外培养时，当ICMICM增殖后或增殖后或PGCsPGCs出现出现ESES样克隆样克隆后即可传代。后即可传代。ESCESC的增殖速度很快，小鼠的增殖速度很快，小鼠ESCESC每每7 78h8h倍增一次倍增一次;猪类猪类ESCESC每每20h20h倍增一次倍增一次;羊类羊类ESCESC，每每404050h50h倍增一次倍增一次

14、;牛类牛类ESCESC每每181824h24h倍增一次。倍增一次。传代时一般是用胰酶传代时一般是用胰酶EDTAEDTA消化，再用微吸管或拨针将消化，再用微吸管或拨针将其打散成单个细胞，然后移入新的饲养层上，培养几其打散成单个细胞，然后移入新的饲养层上，培养几天后，即可出现新的克隆点，在其分化之前可以再进天后，即可出现新的克隆点，在其分化之前可以再进行传代。行传代。5.5.胚胎干细胞的鉴别胚胎干细胞的鉴别（1 1）细胞形态与结构）细胞形态与结构 ESES细胞形态表现为胞体小、泡状、核大细胞形态表现为胞体小、泡状、核大 (核核质比高质比高)、细胞聚集成集落生长、细胞聚集成集落生长（鸟巢状）、（鸟巢

15、状）、细细胞排列紧密、无细胞界限、能连续稳定传代且不胞排列紧密、无细胞界限、能连续稳定传代且不分化。分化。（2 2）细胞功能）细胞功能（3 3）细胞表面的特殊标志：）细胞表面的特殊标志：AKPAKP阳性阳性（4 4）细胞内特异基因的表达）细胞内特异基因的表达胚胎干细胞检测指标胚胎干细胞检测指标(1)(1)细胞内碱性磷酸酶活性高细胞内碱性磷酸酶活性高(2)(2)端粒酶活性高端粒酶活性高(3)(3)不被不被Hoechst33342 Hoechst33342 和和Rhodamine123Rhodamine123染色染色(4)(4)细胞膜表面有特殊的标记：细胞膜表面有特殊的标记：SSEA-3,SSEA

16、-4,SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81TRA-1-60,TRA-1-81。(5)(5)能分化成三个胚层的细胞，将能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植胚胎干细胞植 入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤(6)(6)可诱导分化为各种成体干细胞可诱导分化为各种成体干细胞ICM细胞细胞 EG细胞细胞 来源来源 附置前早期胚胎附置前早期胚胎内细胞团内细胞团 早期胎儿生殖嵴早期胎儿生殖嵴原始生殖细胞原始生殖细胞 形态学形态学 直径一般为直径一般为1215m直径一般直径一般1518m胰岛素样生长因胰岛素样生长因子受体子受体(Insulin-likerec

17、eptor,Igf2r)基因甲基化状态基因甲基化状态 印记基因印记基因Igf2r包包含含1个母系甲基化个母系甲基化位点和位点和1个父系非个父系非甲基化位点甲基化位点 印记基因印记基因Igf2r两两个位点均处于非个位点均处于非甲基化状态甲基化状态 体内分化体内分化 形成畸胎瘤形成畸胎瘤 不形成不形成 6.6.两种来源的两种来源的ESES细胞的区别细胞的区别7.ES细胞的诱导分化细胞的诱导分化干细胞诱导分化的常用方法干细胞诱导分化的常用方法（1 1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，如如VGEFVGEF、bFGFbFGF 、DMSODMSO和和RARA等等（2

18、2）将）将ESES细胞与特定的细胞共培养细胞与特定的细胞共培养 （3 3）将某种分化诱导因子的基因转入）将某种分化诱导因子的基因转入ESES细细 胞内胞内 四、四、ES细胞的应用前景细胞的应用前景胚胎干细胞（胚胎干细胞（ESES）成为当今生命科学和生物技术）成为当今生命科学和生物技术研究的热点。这与它具有研究的热点。这与它具有“发育全能性发育全能性”的神奇的神奇功能密切相关。功能密切相关。干细胞是未分化的原始细胞。其中，全能干细胞干细胞是未分化的原始细胞。其中，全能干细胞能分化成人体能分化成人体200200多种细胞类型，形成机体的任何多种细胞类型，形成机体的任何细胞、组织和器官。细胞、组织和器

19、官。倘能掌握其分化发育的规律，在人工条件下定向倘能掌握其分化发育的规律，在人工条件下定向分化为所需的细胞、组织乃至器官，就可以用来分化为所需的细胞、组织乃至器官，就可以用来治疗目前还难以或无法治愈的帕金森氏病、早老治疗目前还难以或无法治愈的帕金森氏病、早老性痴呆、白血病、糖尿病性痴呆、白血病、糖尿病等顽症，并且解决十分等顽症，并且解决十分紧缺的组织和紧缺的组织和器官移植的来源问题器官移植的来源问题吗？吗？进一步，与克隆技术相结合，运用体细胞核转移进一步，与克隆技术相结合，运用体细胞核转移技术来得到技术来得到ESES，还能解决细胞治疗以及组织和器，还能解决细胞治疗以及组织和器官移植的免疫排异难题

20、。官移植的免疫排异难题。1.1.胚胎干细胞研究的意义胚胎干细胞研究的意义 ESES细胞特有的生物学特性细胞特有的生物学特性,决定了其在生物学领域有着不决定了其在生物学领域有着不可估量的应用价值。可估量的应用价值。在进行在进行ESES细胞建系和定向分化细胞建系和定向分化的同时的同时,以以ESES细胞为材料，细胞为材料，在在核移植、嵌合体、转基因动物核移植、嵌合体、转基因动物研究等方面也进行了广研究等方面也进行了广泛的尝试泛的尝试,已经充分体现出已经充分体现出ESES细胞在细胞在加快良种家畜繁育、加快良种家畜繁育、生产转基因动物、哺乳动物发育模型、基因和细胞治疗生产转基因动物、哺乳动物发育模型、基

21、因和细胞治疗等方面有着广阔的应用前景。等方面有着广阔的应用前景。近几年来，近几年来，胚胎工程技术、基因工程技胚胎工程技术、基因工程技术、组织工程技术与术、组织工程技术与ESES细胞细胞研究的结合已研究的结合已经成为现实，将使相关的基础学科研究以经成为现实，将使相关的基础学科研究以及医药业、畜牧业等发生重大变化，走向及医药业、畜牧业等发生重大变化，走向一个新的时代。一个新的时代。2.2.胚胎干细胞的用途胚胎干细胞的用途为在细胞和分子水平研究研究哺乳动物早期胚胎为在细胞和分子水平研究研究哺乳动物早期胚胎发育规律提供了良好的材料和方法，是基因功能发育规律提供了良好的材料和方法，是基因功能研究的有效手

22、段。研究的有效手段。细胞分化机制，细胞癌变机理细胞分化机制，细胞癌变机理用于新药的发现、筛选及安全性实验用于新药的发现、筛选及安全性实验：如药物机：如药物机理及毒性实验理及毒性实验重要的临床价值，可作为组织移植、细胞治疗和重要的临床价值，可作为组织移植、细胞治疗和基因治疗的细胞来源：基因治疗的细胞来源：制造细胞、组织和器官；制造细胞、组织和器官；人人ESES定向诱导分化为人体器官；生产用于人类器定向诱导分化为人体器官；生产用于人类器官移植的动物器官：无免疫排斥；猪可以作为人官移植的动物器官：无免疫排斥；猪可以作为人异种器官移植的器官供体来源。异种器官移植的器官供体来源。生产克隆动物：由于生产克

23、隆动物：由于ESES细胞是具有全能性、细胞是具有全能性、未分化的细胞，因此是制作未分化的细胞，因此是制作克隆动物很好克隆动物很好的核供体的核供体。生产转基因动物：建立转基因细胞系，抗生产转基因动物：建立转基因细胞系，抗病育种；药用蛋白病育种；药用蛋白ESES细细胞胞可可作作为为基基因因打打靶靶的的靶靶细细胞胞，经经打打靶靶引引入入定定点点整整合合外外源源基基因因，提提高高转转基基因因动动物物的的整整合合率率和和表表达效果。达效果。ESES细细胞胞也也可可进进行行基基因因敲敲除除，获获得得基基因因敲敲除除动动物物，如猪可以作为人异种器官移植的器官供体来源。如猪可以作为人异种器官移植的器官供体来源

24、。在在发发育育生生物物学学基基础础研研究究中中，利利用用ESES细细胞胞研研究究细细胞胞分化的机埋分化的机埋，有助于阐明细胞分化调节的机制。，有助于阐明细胞分化调节的机制。ESES细细胞胞的的多多能能性性可可以以在在一一定定培培养养条条件件下下转转化化为为特特定定的的细细胞胞。试试验验证证明明，体体外外诱诱导导小小鼠鼠ESES细细胞胞的的分分化化，可可形形成成内内脏脏卵卵黄黄囊囊、心心肌肌层层，也也可可以以得得到到神神经元样细胞和成纤维样的细胞。经元样细胞和成纤维样的细胞。使使人人的的ESES细细胞胞与与猪猪等等动动物物的的胚胚胎胎结结合合，可可得得到到人人-猪猪嵌嵌合合体体动动物物，由由于于

25、ESES细细胞胞具具有有全全能能性性，可可分分化化形形成成不不同同胚胚层层，包包括括某某些些器器官官，这这样样的的器器官官与与人人的的器器官官具具有有相相同同的的免免疫疫特特性性，因因此此它它不会对人产生排异反应。不会对人产生排异反应。人人的的ESES细细胞胞也也可可在在体体外外定定向向诱诱导导培培养养，生生产产人人的的肌肌肉肉、神神经经和和造造血血细细胞胞的的细细胞胞组组织织，在在治治疗疗人人的的某些疾病上有重要的应用价值。某些疾病上有重要的应用价值。科科学学家家们们一一直直试试图图诱诱导导各各种种干干细细胞胞定定向向分分化化为为特特定定的的组组织织来来替替代代那那些些受受损损的的体体内内组

26、组织织，比比如如把把产产生胰岛素的细胞植入生胰岛素的细胞植入糖尿病患者糖尿病患者体内。体内。科科学学家家们们已已经经能能够够使使猪猪ESES细细胞胞转转变变为为跳跳动动的的心心肌肌细细胞胞，使使人人ESES细细胞胞生生成成神神经经细细胞胞和和间间充充质质细细胞胞，并并能能使使小小鼠鼠ESES细细胞胞分分化化为为内内胚胚层层细细胞胞。这这些结果为细胞和组织替代疗法开辟了道路。些结果为细胞和组织替代疗法开辟了道路。目目前前，科科学学家家已已成成功功分分离离到到人人ESES细细胞胞，而而体体细细胞胞克克隆隆技技术术为为生生产产患患者者自自身身的的ESES细细胞胞提提供供了了可可能。能。治疗性克隆：体

27、细胞核移植治疗性克隆：体细胞核移植（SCNTSCNT）去核卵细胞去核卵细胞 +体细胞核体细胞核 克隆克隆 囊囊胚胚 分离内细胞群分离内细胞群 ESES细胞细胞把把患患者者体体细细胞胞移移植植到到去去核核卵卵母母细细胞胞中中形形成成重重组组胚胚，把把重重组组胚胚体体外外培培养养到到囊囊胚胚，然然后后从从囊囊胚胚内内分分离离出出ESES细细胞胞，获获得得的的ESES细细胞胞使使之之定定向向分分化化为为所所需需的的特特定定细细胞胞类类型型 (如如神神经经细细胞胞、肌肉细胞和血细胞肌肉细胞和血细胞)，用于替代疗法。，用于替代疗法。这这种种核核移移植植法法的的最最终终目目的的是是用用于于干干细细胞胞治治

28、疗疗，而而非非得得到到克克隆个体，科学家们称之为隆个体，科学家们称之为“治疗克隆治疗克隆”。生殖性克隆生殖性克隆2.ESES细胞研究的伦理问题细胞研究的伦理问题ESES研究也引发了当前最为激烈而敏感的伦理之争。研究也引发了当前最为激烈而敏感的伦理之争。主要围绕两个问题而展开：主要围绕两个问题而展开：一是如何看待胚胎。一是如何看待胚胎。ESES主要有三个来源：主要有三个来源：（1 1）（自然和人工）流产的胚胎；）（自然和人工）流产的胚胎；（2 2）辅助生殖剩余的胚胎；）辅助生殖剩余的胚胎；（3 3）通过体细胞核转移术得到的胚胎。）通过体细胞核转移术得到的胚胎。不管哪一个来源，提取不管哪一个来源，

29、提取ESES必定会损毁胚胎。于是，必定会损毁胚胎。于是，胚胎是不是生命，是不是人，研究胚胎是不是生命，是不是人，研究ESES是不是是不是“毁毁灭生命灭生命”、“杀人杀人”，很自然地成为争论的焦点。，很自然地成为争论的焦点。国内认为：与国内认为：与“胚胎胚胎”的生命相比，的生命相比，“人人”的生的生命具有优先权，可以杀死胚胎来救命具有优先权，可以杀死胚胎来救“人人”的生命。的生命。另一焦点在于，是否必然滑向另一焦点在于，是否必然滑向生殖性克隆。生殖性克隆。20032003年年1010月，联合国大会以月，联合国大会以8080票赞成、票赞成、7979票反对、票反对、1515票弃权票弃权的表决结果，将

30、的表决结果，将禁止人的克隆生殖国际公约禁止人的克隆生殖国际公约推迟一年。推迟一年。世界各国都表示反对生殖性克隆，为什么这一国际公约通不世界各国都表示反对生殖性克隆，为什么这一国际公约通不过呢？因为过呢？因为7979个国家认为治疗性克隆必然滑向生殖性克隆，个国家认为治疗性克隆必然滑向生殖性克隆，主张二者同时禁止。主张二者同时禁止。治疗性克隆是治疗性克隆是ESES研究的主要目的。封杀治疗性克隆，实际上研究的主要目的。封杀治疗性克隆，实际上就是要封杀就是要封杀ESES研究。研究。ESES细胞技术的发展方向细胞技术的发展方向ESES细胞维持自我更新和定向分化的分子机理细胞维持自我更新和定向分化的分子机

31、理ESES细胞治疗技术的研究细胞治疗技术的研究ESES细胞作工具探讨基因功能和个体的发生发育细胞作工具探讨基因功能和个体的发生发育ESES细胞治疗中的免疫排斥问题细胞治疗中的免疫排斥问题治疗型克隆技术治疗型克隆技术分离分离ESES细胞新途径的研究细胞新途径的研究用用ESES细胞生产转基因家畜细胞生产转基因家畜 ESES细胞具有可以无限地传代增殖，而且不改变细胞具有可以无限地传代增殖，而且不改变其基因型和表现型的特点。其基因型和表现型的特点。如果以如果以ESES细胞作为核供体细胞作为核供体进行核移植进行核移植,可以在短可以在短时间内获得大量时间内获得大量基因型和表现型基因型和表现型完全相同的个体

32、。完全相同的个体。而且用而且用ESES细胞与胚胎进行细胞与胚胎进行嵌合嵌合克隆动物克隆动物,可以解可以解决哺乳动物远缘杂交的困难决哺乳动物远缘杂交的困难,生产出生产出珍贵的动物珍贵的动物,也也可以进行可以进行异种动物克隆异种动物克隆,有助于保护珍惜野生动物。有助于保护珍惜野生动物。ESES细胞与动物克隆细胞与动物克隆尽管体细胞克隆与尽管体细胞克隆与ESES细胞克隆相比有着易细胞克隆相比有着易于取材的特点，但是体细胞克隆也存在着于取材的特点，但是体细胞克隆也存在着不少缺点，如生理和免疫缺陷，目前体细不少缺点，如生理和免疫缺陷，目前体细胞克隆还不能完全代替胞克隆还不能完全代替ESES细胞克隆。细胞

33、克隆。ESES细胞作基因载体细胞作基因载体 目前常用的生产转基因动物的方法是向受精卵中注射目前常用的生产转基因动物的方法是向受精卵中注射DNADNA，外源基因的整合、表达和筛选工作是在个体水平上进外源基因的整合、表达和筛选工作是在个体水平上进行的，不仅工作繁琐，周期长成功率低，产生的后代的遗传行的，不仅工作繁琐，周期长成功率低，产生的后代的遗传性状也常出现分离；性状也常出现分离；而利用而利用ESES细胞作为基因载体，得到基因整细胞作为基因载体，得到基因整合的细胞，将载体合的细胞，将载体ESES细胞直接进行核移植细胞直接进行核移植或者通过与胚胎嵌合获得嵌合动物，或者通过与胚胎嵌合获得嵌合动物，E

34、SES细细胞在嵌合体中分化发育成全能性的生殖细胞在嵌合体中分化发育成全能性的生殖细胞，即可以得到携有目的基因的转基因动胞，即可以得到携有目的基因的转基因动物。物。因为一个优良的因为一个优良的ESES细胞系不仅可以用于各种目的细胞系不仅可以用于各种目的基因转化，用各种方法将外源基因转化，用各种方法将外源DNADNA导入细胞，而且导入细胞，而且外源基因的整合数目、位点、表达程序以及稳定外源基因的整合数目、位点、表达程序以及稳定性等都可以在细胞水平上进行加工，筛选，在很性等都可以在细胞水平上进行加工，筛选，在很大程度上加快了动物遗传工程的进程。大程度上加快了动物遗传工程的进程。改善改善ESES细胞的

35、体外培养条件，建立更有效更简便细胞的体外培养条件，建立更有效更简便的获得的获得ESES细胞的方法。细胞的方法。定向诱导分化成特定类型细胞，用于临床疾病的定向诱导分化成特定类型细胞，用于临床疾病的治疗，并解决免疫排斥和潜在的致肿瘤的问题。治疗，并解决免疫排斥和潜在的致肿瘤的问题。成体干细胞的横向分化的能力以及与胚胎干细胞成体干细胞的横向分化的能力以及与胚胎干细胞的比较，的比较，成体干细胞能否替代胚胎干细胞？成体干细胞能否替代胚胎干细胞？嵌合体实验和克隆动物实验嵌合体实验和克隆动物实验是将是将ESES细胞与正细胞与正常的胚胎融合制作嵌合体或将常的胚胎融合制作嵌合体或将ESES细胞作为核细胞作为核供

36、体进行核移植，产生克隆动物后代。这两供体进行核移植，产生克隆动物后代。这两者是检验者是检验ESES细胞的最有效、最有说服力的方细胞的最有效、最有说服力的方法。法。人的人的ESES细胞可以高水平地表达端粒酶活性细胞可以高水平地表达端粒酶活性，二倍，二倍体的人体细胞不表达端粒酶，并且随着年龄的增体的人体细胞不表达端粒酶，并且随着年龄的增长端粒变短，而在组织培养达到一定增殖寿命时，长端粒变短，而在组织培养达到一定增殖寿命时，就开始衰老。就开始衰老。与此相反，端粒酶在生殖系和胚胎组织中都有很与此相反，端粒酶在生殖系和胚胎组织中都有很高的活性。高的活性。ESES细胞中的高水平端粒酶活性证实了细胞中的高水

37、平端粒酶活性证实了它的寿命将超过体细胞。它的寿命将超过体细胞。ESES细胞系的分离效率低细胞系的分离效率低ESES细胞定向诱导分化的理论和技术水平低：细胞定向诱导分化的理论和技术水平低：随机的，运气。随机的，运气。解决胚胎来源有限的途径：解决胚胎来源有限的途径：未成熟卵的体外成熟未成熟卵的体外成熟避免免疫排斥的方法避免免疫排斥的方法（1 1）Knock-out Knock-out 胚胎干细胞的组织相胚胎干细胞的组织相 容性抗原容性抗原（2 2）Knock-in Knock-in 受者的组织相容性抗原受者的组织相容性抗原（3 3）与同一来源的造血干细胞一同移植）与同一来源的造血干细胞一同移植（4

38、 4）受者的体细胞核移植）受者的体细胞核移植胚胎嵌合技术研究概况胚胎嵌合技术研究概况嵌合体嵌合体 (chimera)(chimera)一词源于古希腊神话，其一词源于古希腊神话，其意是指狮头、羊身、龙尾等部分拼凑起来意是指狮头、羊身、龙尾等部分拼凑起来的怪兽。的怪兽。中国的中国的“龙龙”：九似：九似 图腾图腾在生物学上是指同一个体中，基因型相异在生物学上是指同一个体中，基因型相异的细胞或组织混合存在的状态。的细胞或组织混合存在的状态。天然嵌合体？骡子：不是。是杂种骡子：不是。是杂种1.定义嵌合体动物是指由两种或两种以上具有不同遗传嵌合体动物是指由两种或两种以上具有不同遗传性的细胞系组成的聚合胚发

39、育成的个体。性的细胞系组成的聚合胚发育成的个体。在卵裂期甚至受精卵期所形成的嵌合体为在卵裂期甚至受精卵期所形成的嵌合体为原发性原发性嵌合体嵌合体(成体中每个器官都有两种类型的细胞）成体中每个器官都有两种类型的细胞）。胚胎发育的晚期，通过组织移植或嫁接等方法所胚胎发育的晚期，通过组织移植或嫁接等方法所形成的部分组织或器官的嵌合称为形成的部分组织或器官的嵌合称为次生性嵌合次生性嵌合。2.2.囊胚显微注射法生产嵌合体囊胚显微注射法生产嵌合体用显微操作技术将供胚的全部内细胞团注入除去用显微操作技术将供胚的全部内细胞团注入除去部分内细胞团的受胚囊胚腔中，或将供胚的部分部分内细胞团的受胚囊胚腔中，或将供胚

40、的部分内细胞团注入受胚的囊胚腔中，也可以向受胚囊内细胞团注入受胚的囊胚腔中，也可以向受胚囊胚腔中（或卵周间隙）注入胚腔中（或卵周间隙）注入1616细胞至桑甚胚的卵细胞至桑甚胚的卵裂球、胚胎干细胞或已分化的细胞，使其发育为裂球、胚胎干细胞或已分化的细胞，使其发育为嵌合胚胎的方法即为囊胚注入法。嵌合胚胎的方法即为囊胚注入法。囊胚腔注射法嵌合体获得率最高囊胚腔注射法嵌合体获得率最高3.3.嵌合体技术在动物生产中的应用嵌合体技术在动物生产中的应用(1)人工制造有特殊经济价值的个体 对水绍、狐狸、绒鼠等毛皮动物，利用胚胎嵌合体技术可以获得用交配或杂交法不能获得的毛皮花色类型。(2)种间移植 用于分析胎儿与母体的相互关系，如将斑马的受精卵，移植到马体内生产斑马（拯救珍稀濒危动物）。(3)可作为外源基因的导入方法 把外源目的基因先导入干细胞，再通过胚胎干细胞介导法将目的基因转入胚胎，这是转基因动物生产中基因导入的一种重要手段。(4)生产移植器官人兔胚胎嵌合体：将来发育成某种特定器官，如能克服免疫排斥反应，有望用于器官移植。