脂肪氧化酶的提取

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1、重组酶对小麦面粉面团和面包品质的影响酶工程实验室，食品科学与技术学院，南京农业大学，南京210095，中国公关 摘要：纯化的重组脂氧合酶（的安娜-rLOX）是细胞外产生的枯草芽孢杆菌和随后 研究中使用的面包。在面粉的性质的变化，在面团和面包用酶处理的试验研究。 添加的安娜-rLOX后，白度（L *）的小麦面粉的改进与类似的与过氧化苯甲酰 的添加可以实现。面团颜色的L*的安娜-rLOX治疗样品高于过氧化苯甲酰，和 b *急剧下降，在第一个2.5小时与面粉混合后。同时，加强或强化小麦面团处 理效果的安娜-rLOX的面团流变学和扫描电子显微镜测定面筋。纹理质量和结 构参数的显示性能改进包括酶处理过的

2、面包屑色，比容，弹性，咀嚼性，硬度。 与对照相比，酶处理面包体积增大16.8%，面包高度增加10.3%，和特定的体积 增加了 18.2%。这是重组酶在面包中应用的第一次报告，并提供了依据未来的生 物技术应用的安娜-rLOX面包。1简介面包是最重要的食品在世界各地。对改善面包的质量，一些化学物质作为添加剂 在面包制作过程中，如过氧化苯甲酰用于改进用于面团强度的颜色和漠酸钾改 进。然而，它们的残留水平提示健康问题，许多消费者不需要人工或合成添加剂 可用于烘焙（该& ;戴维斯，1996 ；黑川纪章等人，1990）。作为一种很好的选 择，酶已引起研究人员的关注（阿尔伯托等人，2002； lams

3、al &法比昂，2009） 来代替化学添加剂。例如，在添加木聚糖酶（Jiang等人。，2005），淀粉酶（基 姆等人。，2006），和脂肪酶（moayedallaie等人。，2010），取得了改善 doughhandling性能和/或面包质量。脂氧合酶（LOX）已经在几个面粉食品相关 的应用产品（怀特海等人。，1995）。它催化区域选择性和立体选择性多不饱和脂 肪酸（PUFA）双加氧氢过氧化物这就能够cooxidize脂溶性色素和硫醇组（凯西 等，1999。）。大豆粉的添加和/或LOX在面包制作过程中提高面团流变学特性， 面包体积和颜色（junqueira等人。，2008； ribot

4、ta等人。，2004）。工业应用程 序通常使用天然植物材料或提取物如大豆粉，但这些材料通常包含多种酶，这可 以减少饱和脂肪酸的可用性作为底物，氢过氧化代谢产品，从而降低LOX活性（休 斯等人。，1998。纯酶的使用可能会增加脂肪酸的催化作用，与获得纯化的酶的 最佳方式是通过微生物发酵，用从克隆基因的酶的表达（凯西等人。，1999）。在 我们以前的研究中，我们成功地表达LOX基因枯草芽孢杆菌从鱼腥藻7120 （通 常被视为一个安全的主机）的方法，和纯化的重组酶（的安娜- rLOX）活性对小 麦蛋白（Zhang等人。，2012）。据我们所知，没有使用报告重组鲑鱼面包。本研 究的总体目标被评估的安娜

5、-rLOX面粉的面团和影响面包性质的变化2。材料和方法2.1。的安娜-rLOX，面粉和化学品重组脂氧合酶（的安娜-rLOX）是由胞外生产脂氧合酶从鱼腥藻7120枯草芽孢 杆菌，并通过DEAE-Sephacel纯化，Sephadex G-100柱和一个2毫升竦-NTA琼 脂糖柱（pruibest指控，上海，如前所述，（中国）张某等人。，2012）。制备用于确定LOX活性衬底混合27p L纯亚油酸，25p L吐温-20和8毫升去离 子水。溶液中加入1.1毫升的0.5 M NaOH澄清稀释至50毫升磷酸盐缓冲液（pH 6）。LOX活性在35C分光光度法测定在234 nm处的吸光度的增加超过3分钟。

6、反应混合物含磷酸盐缓冲液2.97 mL，20p L底物溶液10p L酶解。一个单位的LOX活性的定义为在234 nm处的吸光度增加每分钟0.001 （kermasha &metche, 1986）。在本研究中所用的面粉新鲜碾碎扬麦13在中 国江苏省。面粉萃取65.18%，含蛋白质12.9% （GB/T 5511 - 2008）,灰分0.8% （GB5009.4-2010）, 14.8%的水分（GB 5009.3-2010）和无内源性 LOX 活性。制 备后，面粉是储存在密封的在4C.面粉袋是不设防的，不包含任何其它添加剂。 估计多酚氧化酶的程序（PPO）活性是小麦面粉中描述的方法安德森

7、和莫里斯（2001）。定义了一个单位的PPO活性作为一个改变0.001吸光度（475）在一个 1厘米的路径单元/分钟/ g在475 nm处。扬麦13号PPO的活性为137 U /分钟 /克避免面粉的自然氧化漂白的可能性，每碾磨面粉样品只用了 10天。亚油酸 （l1376-1g）是从西格玛奥德里奇购买（St.路易斯，莫）。所有其他化学品包括 过氧化苯甲酰和漠酸钾的分析级和在中国购买。十酵母是从当地市场购买和使用 作为一个在面包制作过程中启动。2.2。的安娜-rLOX在面粉中的应用和颜色测量的的安娜-rLOX冷冻干燥的真空冷冻干燥（labconco，日本）。酶和小麦 flourweremixed

8、一起孵育在25C 4小时控制面粉是相同的方式处理，但在过 氧化苯甲酰存在下。应用率分别为10 U/g和20 U /克面粉过氧化苯甲酰的安 娜-rLOX和150p克/克。面粉色泽的变化（黑/白，黄/蓝，红/绿）是随后的 48小时使用亨特Lab色度系统（比色计cr410，柯尼卡美能达，日本；L * = 100 / 0白色/黑色，土A* =红/绿色，与土B *二黄/蓝）。L *和b *与面粉变色的。2.3。的安娜-rLOX应用过程中面团的制备由面粉在面团的最佳水吸收水平的粉质仪测定（法54-21，AACC，1983）。的安娜-rLOX （10 U/g，20 U/g），过氧化二苯甲酰（150 p g/

9、g）和漠酸钾 （50p克/克）被应用于面粉之前doughmaking。所有的ingredientswere在混合碗一 jhmz-200mixer （东福德，北京，中国）4分钟。完全混合面团成型 和表面盖上一个透明的塑料包装，以防止地壳的形成。颜色测量是每小时4小时。 面团保持在内阁保持在30和85%之间的相对湿度C测量。2.4。用的安娜-rLOX治疗面团流变学参数采用了的安娜-rLOX治疗面粉混合行为一种电子粉质仪（Brabender，杜伊斯堡， 德国）equippedwithmixing300克面粉的碗（方法54-21， AACC）。水的吸收， 发展时间，稳定时间、粉质质量度，软化数的测定。

10、2.5。扫描电子显微镜该doughwas冻结、冻十的方法一样，以前描述（steffolani等人。，2010）。图 像被使用扫描电子microscopewith 6千伏的加速电压。显微照片采取了 X1000 倍。2.6。烘烤和烘焙特性试验2.6.1。加工程序用于面包改良14611-2008wasGB/T。面包的配方由小麦面粉（200克），白糖（20 克），盐（2克），干酵母（3克），和最佳的混合时间和水由面粉和面仪分析测定 吸收。此外，通过添加不同的添加剂，分别制备这些面包（2%大豆粉，50p g/g 漠酸钾，150p g/g过氧化苯甲酰和20 U / g的安娜-rLOX）。所有的成分混合 在

11、碗里的针式和面机一200混频器（东福德）以104的速度5转。生面团然后 在发酵内阁在30 C和85%的相对湿度（RH） 90分钟，冲了两次在55分钟和 80分钟发酵开始后。将面团分成两张同样尺寸和成型使用的模塑jcxz-95 （东福 德）。然后他们两次发酵45分钟，烤的在220C炉15分钟2.6.2。比体积面包冷却2小时，然后具体的体积（立方厘米/克）用位移法测定油菜籽（GB / t20981-2007）。2.6.3。面包屑的颜色测量一片面包（20毫米厚）是用来衡量屑颜色。至少三的读数和使用thecie Lab颜 色表记录下来，包括L （亮度），a* （红色-绿色），和b * （黄色-青）值。

12、计 算了猎人的价值 如下：2.6.4。TPA 参数面包屑质地剖面分析（TPA）参数的测定利用TA-XT2纹理分析仪（稳定的微系统， 萨里，英国）配备纹理专家v.1.20软件。一个直径50毫米铝合金圆柱探针（模 型P/50R）是用于压缩测试和结果表示在牛顿（N）。五片从中间剪开（20毫米 厚）每个面包和五个纹理测量了每种类型的面包。每片进行了压缩双循环下以下 条件：十字头速度，1毫米/秒，最大变形，40%。硬度，胶着性，咀嚼性和弹性 从力-距离图计算了面包屑。五片分析和报告每点平均值。2.7。统计分析数据分析采用方差分析方法适用使用Tukey的规范范围试验分离（SAS研究所， 公司，1990）在

13、P0.05建立的意义。3。结果与讨论3.1。漂白的安娜-rLOX对小麦粉的影响面粉的颜色成分的变化（L*和b*值）在48小时内都呈现在图1。的安娜-rLOX 治疗最初的样品显示增加白度（L*值）在第一个24小时，和美白效果非常相似， 即使被添加到面粉中过氧化苯甲酰（图1a）。黄度（b *值）急剧减少，在第一 个12小时的酶添加后。然而，然后B *的anarlox一处理过的面粉与对照相比， 增加成反比面粉过氧化苯甲酰治疗（图1b）。这可能是由于PPO在面粉为他人所 描述的（范妮等人。，2006）。在第一个12小时，类胡萝卜素的活性的安娜-rLOX 消化（数据未如图所示）。随着贮存时间的延长，其活

14、性降低的安娜-rLOX，在 面粉多酚氧化酶开始发挥作用，该LED的面粉变成棕色。因此，治疗详细的安娜 -rLOX在漂白粉在一定程度上有效的。的漂白作用，它是与以前报道的一致结 果（lamsal和法比昂，2009），考虑到变化的酶的来源。3.2。的的安娜-rLOX对面团的影响3.2.1。漂白的安娜-rLOX面团的影响在颜色成分的变化（L *和 b *）在5 h的两个面团系统如图2所示。的的安娜- rLOX治疗面团的L *值均高于对照，并与20 U / g的安娜-rLOX样品是最好的 （图2A）。然而，随着蛋白质在表面氧化多酚氧化酶催化的面团，面团往往失去 白度随时间。黄度（b *值）的的安娜-r

15、LOX （10 U和20 U/g）-在第一个2.5 小时处理面团下降，和的20 U / g的安娜-rLOX治疗的样本是最低的14.6 次3小时（图2B）。然而，较长的时间，B*逐渐增加，除了以过氧化苯甲酰（lamsal 样品和法比昂，2009）。这可能是对的安娜-rLOX和多酚的共同作用的结果 氧化酶（kotber等人。，2001）。同时，过氧化苯甲酰可能导致多酚氧化酶的 someinhibition，从而限制了外观黄色。3.2.2。混合面团的安娜-rLOX治疗行为混合反应得到的面粉加的安娜-rLOX变化控制的预期（图3和表1）。当用的安娜-rLOX，吸水率，开发时间和稳定时间逐渐增加，软化的

16、程度下降， 与面粉的粉质质量数改进。与对照相比，开发时间和10 U / g的安娜-rLOX治 疗可增加面团的稳定时间分别为1.8和2.1分钟，表明一个更长的最大阻力混合 和增强面团的稳定性。软化减少度，occurredwhen flourwas详细的安娜-rLOX 治疗进一步面筋改良指示。此外，20 U/g anarlox一处理面团呈现更好的面团 的强化作用。然而，治疗与漠酸钾样品相比没有变化与控制。lagrain指出，漠 酸钾是一个缓慢的氧化剂在打样和小而不是扮演更重要的角色该doughmaking 阶段（lagrain等人。，2007）。这是蛋白质网络（面筋）发展出的力量到面团的 粉质的宽

17、度表明。一些研究人员注意的最重要的因素是形成二硫键面筋发展过程 组（贾斯廷，巴龙和瓦尔特，2006。据报道，LOX添加分子氧饱和脂肪酸（Huang 等人。，2006）。这个过程是伴随着采用过氧化物和氢过氧化物的形成，它可以氧 化面筋蛋白forminter -巯基和分子内二硫键债券。在这项研究中，值得注意的 是，蛋白膜强烈时形成的面团是由安娜LOX treatedflour。这一结果与强化效 果的依据葡萄糖氧化酶（博内特等人。，2006）。3.2.3。处理后的面团的安娜-rLOX SEM结果所有不同的面团样品的微观结构显示图4。如其他地方，大豆粉处理（ribotta等人。，2004）和漠酸钾（海

18、曼等人。， 1998）（图4b，C），增加蛋白质网络与对照相比（图4A）。当面粉用的安娜-rLOX 治疗（图4D，E），结构更连续和接近，表明一个强大的形成越来越多的电阻网 络。它与食品相关 的应用程序中有面包，和工业 应用中经常使用的 大豆 powderhowever，这些材料通常包含多个化合物可降低LOX活性（休斯等人，1998； ribotta等人。，2010）。同时，该的安娜- rLOX是一种纯化的酶，从而避免任何 污染这可能会影响酶活性的化合物。基于SEM图像，面团用20 U / g的酶显示 强壮的抗网络比从10 U / g的增加。3.3。烘烤试验结果3.3.1。面包卷的不同处理的样

19、品表现出的整体效果面包片的外观（图5）。有一个显着的体积 改进当面粉用20 U / g的安娜-rLOX治疗。的烤面包的体积，高度和不同样品 的特定体积表2中列出的。与对照相比，酶处理面包体积增大16.8%，面包高度 增加10.3%，和具体的体积增加了 18.2%。这些结果是一致的用面包质构特性如 下。类似的结果发表通过哈罗斯等人。（2002）的人报告说，lowinitial硬度 获得一个高的面包体积的后果。此外，不同的ANA液氧补充（10 U/g，30 U/g） 也在焙烧试验研究（数据未显示），但他们的面包体积的影响不好为20 U/g和 LOX加。这可能是由于使用面团具有较强的（30 U /

20、g的安娜-rLOX此外）或 弱（10 U / g添加面筋的安娜-rLOX）可以导致小面包体积的可怜的打样和烤 箱的弹簧（1987佩恩，夜莺，和krattiger，）。3.3.2。面包屑的颜色面包屑的颜色是一个重要的属性，有助于消费者偏好。如表3所示，大豆粉的添 加，然而，使胶粉颜色暗棕色，因为颜色的大豆粉本身。在一个显着减少的黄色 面包屑时指出，过氧化苯甲酰添加。这一结果可以由事实解释了刚磨面粉 足够的颜料使典型的黄色类胡萝卜素（从颜料）和过氧化苯甲酰是其降解能力 类胡萝卜素（伊达尔戈等人。，2010）。在这项研究中，该anarlox一处理的样品 导致明度略有增加面包，作为的安娜-rLOX能降

21、解类胡萝卜素色素（数据未显 示）（范妮等人。，2006）。因此，的安娜-rLOX可以一个有用的过氧化苯甲酰生 物替代品。3.3.3。面包的纹理在先前的研究表明，junqueira之间的良性互动面包的质量和弹性，韧性，硬度， 胶着性和咀嚼性降低面包品质相关（junqueira等人。，2007）。在小麦 flourincreased面包质构特性的安娜-rLOX存在。如图6所示，弹性的面包的 安娜-rLOX治疗显著高于其他样品。当的安娜-rLOX增加，硬度，胶着性和 面包的咀嚼性明显降低相比控制，大豆粉和漠酸钾处理的面粉。在以前的研究中， LOX加入面团，增加形成二硫键的数量提高了的能力面团保持气体

22、。这支持了这 一观点，二硫键增加债券提高面包纹理（孝和叶，2004）。强化或强化小麦面团 的治疗效果详细的安娜-rLOX测定面团流变学和扫描电子面筋基质镜。的纹理 和结构质量的酶显示出改进的性能参数处理面包包括面包屑的颜色，比容，弹性， 咀嚼性，和硬度。4。结论在这项研究中，的安娜-rLOX由枯草芽孢杆菌菌株的应用在面包制作过程。结 果表明，白度小麦面粉和面团进行改进，增强效应面团的安娜-rLOX治疗证实， 和面包结果表明，在纹理和结构的质量明显提高。这些研究结果应该为未来提供 依据面包制作过程技术应用的安娜-rLOX。致谢这项工作是由国家自然科学基金资助中国（31071605； 31201423），中国的“863 高技术计划”（2012aa022207），江苏科学技术支持计划省（be2011390），科技 支撑计划苏州市（sn201105），和一个由优先资助的项目江苏高等教育机构的学 术程序的开发（RAPD）。我们感激发健民周，粮油质量控制和江苏省深加工实验 室，南京财经大学，帮助我们与粉质仪烘烤试验。