Westernblot蛋白印迹法详细步骤

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1、Western-blot（蛋白印迹法）详 细步骤Western blot （蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液 氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套III步骤:用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎， 取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织， 研磨。 研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液 氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉 状。III 用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的 粉末盛入新的EP管中。 装有组织粉末的EP管现在液氮中保 存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于 -80C保存。注意：1研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡 纸包头，在烘箱中烘烤180C至

2、少3h以上。2. 组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后 再将组织粉末装管。3. 每种样品都最好留有副管，备用。二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000:10=100： 1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为 1:1000 （即1ml裂解液加1ul蛋白酶抑制剂） 步骤：将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到 装有组织粉末的EP管中，一般加入300500 nl左右（浓度尽量高点）。盖好盖子，在冰上裂解3040min.到时间后于4C, 12000rpm10min，取上清液转移到新的离心管中， -20C保存。注意:1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，离心 于I三w当加 入量很少时，成粘

3、稠状，有必要时应用枪头混 匀。三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：按1:15或1:30稀释待测样品，即取1 ul样品+14时水。 按下表在酶标仪中加入试剂，绘制标准 曲线。孔号0123456蛋白标 准液（P l）01246810去离子 水（Pl）10986420蛋白含 量（Pg）01246810按50体积BCA试剂A加1体枳BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。 每个标准品孔加入200 P l BCA工 作液，样品孔加入待测样品10Pl和200Pl BCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡3

4、0s, 37放置30min, 于 492nm下测定OD值。l=Ji=j 标准曲线以蛋白含量（P甘）为横 坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度 可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。 注意：1.标准曲线一般做两组，取最好的标准曲线计算。l=J2. 蛋白浓度=（蛋白含量/总体积）X 稀释倍数Pg/Pll=J3. 保证样品液中的蛋白含量相同C500ug/100ui）测取10Pl样品液中含有 50Ug蛋白。4. 样品液稀释液要再沸水浴中煮 10min （可用微波炉加热），放凉至室温后于 20C保存。四、SDS-PAGE蛋白质电泳（一）、配胶准备：凝胶液各成分、电泳板、制胶架、 梳子步骤：选择适合电泳板

5、 （0.75mm:1.0mm:1.5mm）,用自来水冲洗干净 后再用蒸馏水冲洗，将玻璃板夹入玻璃板夹， 注意底部对齐，夹好后卡到制胶架上。 首先配制分离胶（一般用12%的 SDS-PAGE分离胶），按分离胶配方配制，配胶 时最后加APS和TEMED,迅速混匀，注意减少 气泡的产生。-si!7顼III 将配好的分离胶迅速加入玻璃 板之间至梳子下约1cm处（绿色线处），不要 有气泡。灌好胶后用蒸馏水覆盖胶层，加满蒸 馏水至玻璃板顶端，以利于丙烯酰胺的聚合。 室温静置约30min至胶层与水层检出现明显界限。若室温过低可将其置于37C烘箱中。 配制浓缩胶（5%的Arcymalide 浓缩胶），混匀，注

6、意减少气泡产生。 带分离胶聚合后，倒掉上层水， 将混匀的浓缩胶沿玻璃板壁小心加在分离胶 上至较短玻璃板顶端，插好梳子，不能有气泡， 室温静置2030min至凝胶聚合。注意：1.夹好玻璃玻璃板后用水检查其 是否漏水。2.12%分离胶配方：不同体积（ml）凝胶液各成分所需体积（ml）溶液成分51015202530HO21.63.34.96.68.29.930%Arcylami de2.04.06.08.010.012.01.0M Tris-HCL(PH8.8)1.32.53.85.06.37.510%SDS0.050.10.150.200.250.3010%APS0.00.10.10.20.20.

7、355050TEMED0.0020.0040.0060.0080.0100.0123.SDS-PAGE 浓缩胶配方 （5%Arcylamide）不同体积（ml）凝胶液各成分所需体积（ml）溶液成分234568HO20.681.42.73.44.15.530%Arcylami de0.170.330.670.831.01.31.0M Tris-HCL(PH8.8)0.130.250.50.630.751.010%SDS0.00.00.00.00.00.012456810%APS0.010.020.040.050.060.08TEMED0.0010.0020.0040.0050.0060.0084

8、.配胶时加入的APS和TEMED是璃板助凝剂，应最后加入，加入后应迅速将配好的 胶灌入玻璃板之间，防止其凝固。（二）、电泳准备：电泳仪、电泳缓冲液、样品 marker1=1=步骤：取1X电泳缓冲液，待浓缩胶聚合 完全后，将胶架放入电泳槽内，将电泳缓冲液 倒满内槽，内槽电泳液灌满后电泳液自动溢出 灌满外槽，内槽电泳液低于外槽，拔出梳子， 向梳子孔内加样。 加样量为每孔8ul或10ul，如 有剩余的孔，可加入等体积的 1 X loading buffer上样缓冲液，以防止样品胶跑歪。 marker 一般点在最左侧。暖 III 将电泳槽与电泳仪连接，打开电泳 仪开关，恒压80V预电泳10min至漠酚

9、蓝前沿 到达分离胶，将电压调整到恒压120V，电泳直至漠酚蓝到达分离胶底部，注意不要让漠酚 蓝跑出分离胶。注意：1.电泳的条带依据蛋白的分子量而区 分，分子量大的蛋白跑的慢，在上端。2.电泳液可回收多利用几次，一周左暖 III暖 IIIl=jwl=Jw右。（三）、转膜准备：甲醇、转膜缓冲液、滤纸、玻璃棒、 海绵、PVDF膜或NC膜IID步骤：电泳结束后立即转膜防止蛋白分 散，剪取一张与凝胶大小相仿的PVDF膜，2 块海绵，6张滤纸。 将PVDF膜用甲醇活化约3min， 然后将膜、凝胶、海绵和滤纸放在盛有转膜缓 冲液的托盘中平衡15min。 取下凝胶用切片切取需要的部 分，两端以marker和上

10、样边缘为界，用转膜 缓冲液冲洗凝胶几次，在湿转板黑色面放置一 张海绵、三张滤纸，再放置凝胶，每一层都要 用玻璃棒赶出气泡。 从甲醇中取出活化的膜在转膜缓 冲液中浸洗一下，放在胶上，正面朝凝胶，再放三张滤纸、一张海绵，每一层用玻璃棒赶出 气泡，最后夹紧转移夹。 转移夹正极板（白色）对着电泳1=槽红色面，放入电泳槽中通电转膜，恒压72V或恒流300mA。注意：1.20KD以上的蛋白转膜时间约1h以 上，100KD的蛋白转膜时间约1.5h左右，10KD 左右的蛋白转膜时间为2030min左右。2. 转膜要在冰水浴中进行，避免体系 温度过高。3. 操作时要戴手套，用镊子夹持PVDF 膜边缘防止划伤膜或

11、染上杂蛋白。4. PVDF膜可多次曝光（8次左右），NC 膜可曝光23次。（四）、封闭准备：脱脂奶粉、TBST缓冲液步骤：转膜结束后，小心取出凝胶和膜， 可在膜上观察到预染marker的条带。 配制5%的脱脂奶粉（5g脱脂奶粉+100mlTBST缓冲液）封闭液，将膜放入盛有封闭液的容器中，室温摇床封闭1h。注意：1.可用考马斯亮蓝将凝胶染色以判断转移情况。III2.NC膜可置于丽春红染色液中，室 温下染色5min，用双蒸水洗膜至水变清，无 色蛋白条带清晰，说明染色效果好。（五）、一抗孵育准备：抗体、5%脱脂奶粉、自封袋、封口机 步骤：根据抗体说明书以适当比例用5% 脱脂奶粉稀释一抗。HDHDl

12、iiJlie 将自封袋剪去封口条，两边剪开， 封闭后的PVDF膜小心放入袋内，通常4号袋 可放置34条膜，膜与膜之间用封口机封好， 剪开。 加入配好的一抗溶液，小心排除气 泡，用封口机封口后正面朝上（与凝胶接触的 一面）在摇床上4笆过夜孵育或室温孵育 广3h。 孵育后将膜取出，一抗溶液可回收 放置-20C保存两周回收利用。 用TBST在摇床上洗膜3次，每次 5min以去除残留的一抗。（六）、二抗孵育准备：二抗、5%脱脂奶粉、自封袋、封口机步骤：用5%脱脂奶粉按二抗说明书以适 当比例稀释（1：40001:20000）。按一抗孵育的操作给洗过的膜孵育二抗。室温摇床孵育2h,孵育后将膜取 出，用TB

13、ST洗膜3次，每次5min除去残留的 二抗。五、曝光鉴定准备：显影液、定影液、自来水、发光液A、发 光液B步骤：在暗室中将定影液、显影液、自来水分 别倒入塑料盘中备用。 于一离心管中加入发光液A、发光液B 各200P1,混匀。 在暗盒内放置一层自封袋，底层可用双 面胶粘好，擦净后将漂洗后的膜正面朝上，摆 放在塑料膜上，将发光液均匀的滴在PVDF膜 上，用另一层塑料膜盖好膜，小心排除气泡。 在暗室中取出一张X光胶皮，用剪刀剪 成适当大小，根据肉眼观察到的荧光强弱调整 曝光时间，胶片一旦放上不可移动。 通过多次曝光以到达最佳效果。曝光完成后打开暗盒取出X光胶片，浸入显影液中不停摇动显影，在红光下观

14、察出现明显条带（一般约1min），立即浸入定影液中（一般约510min），以胶片透明为止，用自来水冲去残的定影液，室温下晾干，胶片保存在干燥阴凉处。注意：1.若肉眼即可观察到可见荧光，则只需压片12s，一般压片时间为510min。2.显影、定影和冲洗可在显影仪中一步进行。六、扫描及分析准备：数码相机、Photoshop、Quantity one软件步骤：选取效果较好的胶片拍照，导入计算机。 用Photoshop简单处理图片，转成 灰度模式，保存为.tif格式。 用Quantity one软件分析条带的 光密度值（灰度值）。Quantity one软件的使用：（1）选取要分析的条带框住，复制粘贴至数目比样品数多1（有一个框空白背景），方框大小不可改变。(2)分析光密度 值，将结果导入到Excel表中，计算目的蛋白 与内参蛋白的光密度比值，制成柱形图。