《分子生物学改造》PPT课件.ppt

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1、蛋白质分子的生物学改造 蛋白质在生命现象中具有重要作用，在医药、轻工 等行业也具有重要作用，如胰岛素、枯草杆菌蛋白 酶等； 天然生物材料中蛋白质含量较少； 基因克隆技术克隆基因，在宿主细胞中可表达特定 蛋白质（重组蛋白）； 多数天然蛋白质的理化特性不能适应于工业用途 ; 利用现代 分子生物学技术 ，改变克隆基因中的特定 基因，即可表达出适合于商业用途的蛋白质。 在体外，通过碱基取代、插入或缺失的方法， 使基因 DNA序列中的某个特定碱基发生改变， 从而改变蛋白质的结构，称为 蛋白质工程。 通过蛋白质工程，人们可以随心所欲地改变 蛋白质的结构及其理化性质和生物学功能。 例如，我们可以利用蛋白质工

2、程改变酶的 Km、 Vmax，酶促反应的最适温度、最适 pH值、 酶促反应的特异性以及酶蛋白的稳定性等。 蛋白质工程的主要技术之一是 定点突变技术 . 一、定点突变 利用分子生物学技术，在体外通过 碱基取代、插入 或缺失 可以使基因 DNA序列中任何一个 特定的碱基 发生改变 。这种体外特异性改变某个碱基的技术， 称谓 定点突变（ site directed mutagenesis）。 定点突变 具有简单易行、重复性高等优点，现已发 展成为基因操作的一种技术。这种技术不仅适用于 基因结构与功能的研究，还可通过改变基因的密码 子来改造天然蛋白质。 二、基因定点突变的意义 用于研究基因的结构与功能

3、； 通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质， 使其更符合人们的需要。如酶蛋白的改造以 及新型疫苗或药物的开发。 如枯草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是 由于催化部位的 丝氨酸 (Ser221)邻近的 甲硫 氨酸 (Met222)易被氧化成硫氢化物，若以其 他氨基酸取代 Met222，则可提高酶的氧化稳 定性而又不影响其催化活性。这是结构分析 和定点突变改造蛋白质的成功范例。 枯草杆菌蛋白酶可作为洗涤剂的添加剂，但由于其 只能水解 苯丙氨酸 (Phe)羧基 所形成的肽键，底物 作用范围过窄而限制了洗涤剂的高效性，若用带正 电荷的 赖氨酸 (Lys)取代位于活性中心 166位的 甘氨 酸 (Gly)

4、，所获得的突变酶不仅能水解苯丙氨酸 (Phe) 羧基所形成的肽键，而且可以水解酸性氨基酸 谷氨 酸 (Glu)所形成的肽键，使其底物作用范围拓宽，因 而可能成为最高效的洗涤剂添加酶，这是定点突变 改变蛋白质生物学活性的成功例子。 加入二硫键增加蛋白质的稳定性 蛋白质分子中两个半胱氨酸残基上的巯基 （ SH）之间氧化脱氢即形成二硫键（ ）。二硫键的数量与蛋白质的稳定性 有关，增加蛋白质分子中的二硫键，可提高 蛋白质分子的热稳定性、有机溶剂稳定性和 酸碱稳定性。 在一项研究中，通过寡核苷酸定点突变构建 了 T4溶菌酶的六种变异体 ,比较了它们的活性 . T4溶菌酶和 6种设计的变体特性 酶 氨基酸

5、的位置 二硫键的数目 相对活性 Tm 3 9 21 54 97 142 164 (%) ( ) wt Ile Ile Thr Cys Cys Thr Leu 0 100 41.9 pwt Ile Ile Thr Thr Ala Thr Leu 0 100 41.9 A Cys Ile Thr Thr Cys Thr Leu 1 96 46.7 B Ile Cys Thr Thr Ala Thr Cys 1 106 48.3 C Ile Ile Cys Thr Ala Cys Leu 1 0 52.9 D Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys 2 95 57.6 E Ile C

6、ys Cys Thr Ala Cys Cys 2 0 58.9 F Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys 3 0 65.9 wt：野生型 T4溶菌酶； pwt:假野生型酶； A F：六种设计的半胱氨酸 变体； Tm:熔点温度 将 Asn和 Gln转换成其他氨基酸 当蛋白质暴露于高温时 : 天冬酰胺（ Asn） 天冬氨酸 (Asp) + NH3 谷氨酰胺 (Gln) 谷氨酸 (Glu) + NH3 导致肽链折叠的局部的改变 ,可能影响其活性。 如酵母的 丙糖磷酸异构酶 是由两个相同的亚基组成的二聚体， 每个亚基都含有两个 Asn残基，均位于两个亚基相互接触的 表面上，可能与该酶

7、的热稳定性有关。 若将两个 Asn全部换成 Asp，则变体酶即使在常温下也不稳 定，而且酶活性也大为降低； 而将 2个 Asn分别换为 苏氨酸 (Thr)和 异亮氨酸 (Ile)，其半衰 期则延长。 酵母菌磷酸丙糖异构酶及其变体的热稳定性 氨基酸位点 酶 14 78 半衰期（ min） 野生型 Asn Asn 13 变体 A Asn Thr 17 变体 B Asn Ile 16 变体 C Thr Ile 25 变体 D Asp Asn 11 酶的稳定性以在 100 时半衰期或者失活率来表示。 半衰期越长酶越稳定 减少游离 Cys残基的数目 在利用 DNA重组技术表达外源基因时，常常 会遇到这种

8、情况：外源蛋白的表达量很大， 但其生物活性却很低，即外源蛋白的 比活性 很低。 利用蛋白质工程技术减少游离的半胱氨酸 （ Cys）残基数目，以减少蛋白错误折叠的 可能性，从而可以提高蛋白质的生物活性。 例如： 当人 -干扰素基因（ -IFN）在大肠杆菌中表 达时，尽管其表达量很高，但其比活性只及天然蛋 白质的 10%。 DNA序列分析显示， -IFN所编码的蛋白质有三个 Cys残基，其中 2个形成分子内 二硫键， 而另一个游 离的 Cys可能涉及到 -IFN分子间 二硫键 的形成，导 致二聚体的产生，使单聚体含量减少，活性降底。 将 -IFN分子中的游离 Cys残基用 Ser来取代，因为 Cy

9、s与 Ser分子结构相似，前者有一个 S原子，而后 者是一个 O原子，减少了二聚体的形成，提高了活 性蛋白质的得率。 增加酶的活性 用定点突变技术不仅可以提高蛋白质的稳定 性，还可以提高酶的活性。要改变酶的活性， 需要一个详细描述了酶的活性位点的图谱。 有了这样的资料，研究者们即可推测酶与底 物的亲和程度，并利用定点突变技术对蛋白 质进行改造，提高酶的活性。 天然和突变酪氨酰 -tRNA合成酶活性 酶 Kcat(s-1) Km(mmol/L) Kcat/Km(s-1mol-1) Thr-51 4.7 2.5 1.860 Ala-51 4.0 1.2 3.200 Pro-51 1.8 0.019

10、 95.800 改变酶的特异性 突变葡萄球菌核酸酶与含 -SH寡核苷酸结合示意图 三、定点突变原理 （一） M13DNA寡核苷酸突变 基因工程中 ,噬菌体 是一种常用的基因载体 ,其中又以 M13 和 为最常用。 M13噬菌体是一种环形 DNA，基因组大小为 6.4kb，在颗粒 中包装的仅是 正链的 DNA，有时也称为 感染型单链 DNA(single stranded DNA, ssDNA) 。 当感染型单链 M13噬菌体感染大肠杆菌后，在菌体内借助宿 主的酶系统先把 ssDNA复制为双链（ dsDNA），称为 复制 型（ replication form,RF） M13（ RF- M13）

11、 。 广泛用于 DNA序列分析和噬菌体表面展示系统（ phage display)和单链核酸的制备 。 四、定点突变的常用方法 1.基本原理 再使用化学合成的 含有突变碱基 的寡核苷酸短片段 作引物，启动 M13单链 DNA分子进行复制，随后这 段寡核苷酸引物便成为新合成的 DNA子链的一个组 成部分。 因此所产生的新链便具有已发生突变的碱基序列 ,将 其转入细胞后 ,经过不断复制 ,即可获得突变的 DNA 分子 ,再经表达即可获得改造后蛋白质 . 为了使目的基因的特定位点发生突变，所设计的寡 核苷酸引物的序列除了所需的突变碱基外，其余的 则与目的基因编码链的特定区段完全互补。 2.突变过程

12、1)合成含有目的 基因的正链 DNA； 2)合成含有特殊 突变碱基的引物； 3）制备异源双链 DNA； 4）富集和转化双 链 DNA分子； 5）筛选突变体并鉴定 （二） Kunkel定点突变法 体外 DNA合成往往是不完全的，所以部分合 成的 DNA分子必须通过蔗糖密度梯度离心除 去 ,获得纯化的突变 DNA。 理论上来说， DNA是半保留复制的，应用寡 核苷酸定点突变时，所形成的噬菌体中携带 突变基因的应为一半。但实际上，由于技术 上的原因通常只有 1-5%的噬菌斑含有突变基 因的噬菌体。 具体步骤： 将待突变的基因克隆入 M13 DNA载体上，导入具有 dUTP酶 （ dut）和 N-尿嘧

13、啶脱糖苷酶 （ ung）双缺陷的大肠杆菌 （ dut-， ung-）菌株 中。 Dut缺陷 导致细胞内 dUTP水平 上升 ，并在 DNA复制时，部分 取代 dTTP进入 DNA新生链中。 又由于 ung缺陷 使掺入 DNA的 dUTP残基不能除去 。由这种大 肠杆菌菌株产生的 M13单链 DNA大约有 1%的 T被 U所取代 ， 然后进行 DNA定点突变。 双链 DNA导入正常的大肠杆菌 中，其尿嘧啶 N-糖基化酶除去 DNA链上的尿嘧啶碱基。 结果原来的 M13模板链被降解， 只有突变链因不含 U，被保留下 来。这种方法产生的 M13噬菌体 中含有突变 DNA的比例大大增 加。 （三） P

14、CR定点突变 Polymerase Chain Reaction （ PCR）是一 种体外酶促合成特定 DNA片断的技术，是根 据人类的需要对复杂生命过程的一种简单化 的模拟。 PCR技术的原理是 DNA半保留复制。 Kari.B.Mullis首创。 PCR进行寡核苷酸 定点突变的示意图 1、重叠延伸 PCR （ OE-PCR） 首先设计两个 PCR反应以产生两个含 突变位点的 DNA片段，随后将上述两个 PCR产物混合，二者通过 末端互补区结合 并在适宜的温度下 互为引物延伸 得到完 整的含突变的基因，对第一次 PCR产物进 行纯化处理可显著提高突变效率 2、大引物 PCR法 （ megap

15、rimer PCR ) 先设置一个 PCR反应产生一个含突变的 DNA 片段，然后再以此 DNA片段作为引物与原模板 退火进行 PCR扩增得到含突变的完整的基因。 因为作为引物使用的 DNA片段较通常的引物要 大许多甚至有上百碱基，所以命名为大引物 PCR法。 大引物 PCR 定点突变技术路线 （圆点指突变位点） 3、环状突变 PCR 法 定义：以整个带有目的基因的质粒为模板，用突变剂 进行扩增，最后产生环状的带有目的突变的质粒。 方法： 两个引物反向、紧邻但没有重叠区，扩增产物是平 末端的线性 DNA，需用 T4连接酶环化处理。 以 Stratagene公司开发的定点突变试剂盒为代表， 两个

16、引物也是反向的并且其 5端有 l5个碱基以上的 重叠区，扩增产物为带黏性末端的线性 DNA，可自 行环化。 环状突变 PCR 法 环状突变 PCR 法 通过特殊氨基酸的改变提高蛋白的稳定性 例： 葡萄糖异构酶 （ Glucose isomerase） 用双引物法对葡萄糖异构酶基因进行了体外定点 诱变，以 Pro138替代 Gly138，在酶比活相近的情况下， 突变型葡萄糖异构酶的 热半衰期比野生型长一倍 ， 最 适反应温度提高 1012C。 据分析，可能由于 Pro138替代 Gly138引入的一个 吡咯环刚好能够填充 Gly138附近的空洞，使突变蛋白 的空间结构更具刚性，从而提高了酶的热稳

17、定性。 通过引入 二硫键 提高蛋白的稳定性 蛋白质分子中两个半胱氨酸的巯基之间氧化脱氢即 形成二硫键。二硫键的数量与蛋白质的稳定性有关，增 加蛋白质分子中的二硫键，可以提高蛋白质分子的热稳 定性、有机溶剂稳定性和酸碱稳定性。 通过改变活性中心附近的氨基酸提高酶的催化活性 应用举例：大肠杆菌碱性磷酸酶 E.coli Alkaline phosphatase: Mutation of D101S Wild Type D101S Asp101 Ser101 二、编码基因 随机 突变和重组 易错 PCR（ Error prone PCR） DNA改组（ DNA shuffling） 易错 PCR（ e

18、rror-prone PCR） 是指通过改变 PCR 反应条件来调整 PCR反应中 突变的频率 ,降低聚合 酶固有的突变序列倾向性 ,提高突变谱的多样性 ,使 得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因 中 ,从而得到随机突变的 DNA群体 ,最后用合适的载 体克隆突变基因。 连续易错 PCR (sequential error prone PCR)策略。 即将一次 PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次 PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。 方法： 增加 MgCl2浓度到 7mM,稳定非互补的碱基配对 增加聚合酶量到 5U,促使在错配碱基处继续延伸反应 降低一种 dNTP的量 （降至

19、 1 -10） .在缺乏正确核 苷酸时 ,聚合酶经短暂停留后 ,会插入另外 3种可用核苷 酸的一种 加入次黄嘌呤 dITP来代替被减少的 dNTP,能与 C、 T、 A配对 缓冲液中另加 0.5mmol/L MnCl2, Mn2+能降低聚合酶 对模板的特异性 增加 dCTP和 dTTP的浓度到 1mM，促进错误掺入 使用 突变 DNA聚合酶 如 Mutazyme GC AT 易错 PCR(epPCR) DNA改组 （ DNA Shuffling） 又称 DNA“洗牌” ,或 DNA体外随机拼接技术 , 它依赖 PCR,又不完全等同于传统的 PCR技术 , 所以 ,DNA体外随机拼接又称为 有性

20、 PCR。 指 DNA分子的体外重组，是基因在分子水平 上进行 有性重组 (Sexual Recombination)。通过 改变单个基因 (或基因家族， gene family)原有 的核苷酸序列，创造 新基因 ，并赋予表达产 物以 新功能 。 DNA shuffling体外基因突变一般过程如下 (1)获得目的基因 :选择一组分别具有一系列所 需性状的基因序列作为重组的亲本 ,亲本之间 有序列同源性 ( 60%).亲本可以是经随机诱 变得到的一组有益突变体 ,或天然存在的基因 家族 .常用的有两种方法。 为了增加突变率采用 PCR扩增目的基因回收 为了增强保真性，可以采取抽提含有目的基 因的

21、质粒，通过酶切回收。 (2)基因酶切回收 :采用 DNase I消化基因 DNA 得到 10-50 bps或 100-300 bps的片段，酶切过 程中用 Mn2+能提高保真性 3倍左右。 (3)无引物 PCR:切割的 DNA片段通过相互间的 同源随机互补并互为引物 ,经 PCR扩增 ,获得大 量随机组合的新 DNA突变体 .为确保得到高保 真性的片段，应在较高的温度下复性。 同标准 PCR,先对 dsDNA进行热变性 ,退火时单 链片段与足够长度互补序列的其它单链配对 , 形成 3或 5突出端 ,聚合酶延伸 3凹端 .反复循 环，随着循环数增加 ,片段的平均长度也增加 , 最后达到 DNA亲

22、本序列的原始长度 . (4)有引物 PCR:将无引物 PCR产物作适当稀释， 作为模板进行 PCR，加入特定两侧引物进行最 后的 PCR扩增 ,便可获得全长基因的 PCR产物。 (5)目的突变基因的获得 :回收目的片段克隆到 载体上，转化选择所需的突变了的目的基因。 如筛选抗性基因、高酶活基因等 DNase 处理 无引物 PCR 片段重装配 3 3 5 5 3 5 5 3 5 5 3 3 5 5 3 3 反复循环 有引物 PCR 克隆 筛选 DNA Shuffling技术能模拟生物的基因在数百万 年间发生的分子进化过程，并能在短期的 实验循环中定向筛选出特定基因编码的酶蛋白 活性提高成千上万倍

23、的功能性突变基因。 项目 进化速度 进化对象 进化 周期 影响对象 突变效率 常规定向 进化 缓慢 进化 整个基因 组 多年 完整基因 组 高 DNA Shuffling 快速 进化 特定基因 / 操纵子 /病 毒 几天 部分基因 组 低 DNA Shuffling与常规定向进化的比较 实例 : 1994年，美国的 Stemmer采用单个基因的 DNA Shuffling和回 交技术，在大肠杆菌中使编码 -内酰胺酶的 TEM-I基因的抗生 素抑制活性 (MIC)从 0. 02ug/mL提高到 640ug/mL,即提高了 32, 000倍。次后，他们又相继选取了绿色荧光蛋白基因 (gfp)和 -

24、 半乳糖昔酶基因 (lac) (1997)用 DNA Shuffling技术模拟并加速了 分子进化过程。筛选获得了酶活性大幅度提高的突变株 1996年， Moore等亦采用该技术对降解污水中有机污染物的 对硝基苄基酯酶基因进行了定向模拟分子进化研究。 1998, Crameri等采用 4个不同来源的先锋霉素基因混合进行异 源基因组的 DNA Shuffling，使单一循环的 MIC活性提高了 270- 540倍。而同时只用单一基因进行的实验仅提高了 8倍。 交错延伸重组（ staggered extension process， StEP） 将 DNA Shuffling技术进一步改进的 DN

25、A体外 重组技术 核心技术 :有性 PCR,在一个反应体系中以 2个以 上有一定序列同源性的 DNA片段为模板进行 PCR反应 ,通过 变换模板 机制实现 DNA序列的 重新组装 交错延伸重组的一般过程如下 (1)获得目的基因 :选择两个以上有一定序列同源性的分 别具有优良性状的亲本基因作为 PCR模板 省去用 DNase 将 DNA切割成片段及片段纯化步骤 ,简 化了程序 (2) 短暂 PCR反应 在每轮循环中 ,退火和延伸反应控制在 短暂的时间 (5s),引物先在一个模板链上延伸 ,只能合成出 很短的新生链 .经变性的新生链再作为引物与体系内同 时存在的不同模板退火后继续进行短暂的延伸 ,

26、此过程 反复进行 ,直到产生全长的基因 ,得到间隔地含不同模板 序列的杂交 DNA分子 . (3)两端引物 PCR:加入两端引物作标准 PCR反应 , 扩增全长的杂交 DNA链。 (4)目的突变基因的获得 :回收目的片段克隆到 载体上，从得到的 DNA文库中选择或筛选得到 性状优化的基因 随机引发重组 （ random-priming recombination， RPR ） 原理 :用一套随机引物与模板配对延伸 ,产生互 补于模板不同位点的短 DNA片段混合物 ,由于 碱基的错配和错误引发 ,这些短的 DNA片段中 也会有少量点突变 ,在随后的 PCR反应中 ,这些 短的 DNA片段互为引物

27、重新组装产生全长的基 因 模板 :一条 DNA单链或 cDNA 随机引发重组的一般过程如下 (1)随机引发合成短 DNA片段混合物 :以变性 DNA为 模板 ,加入随机引物 ,用大肠杆菌 DNA聚合酶 Klenow 片段进行延伸反应 ,得到长短不一的新生 DNA片段 (50-500bp) (2) 过滤、纯化 DNA片段混合物 去除模板、长的新 生 DNA片段、小的新生 DNA片段（ 30bp），蛋白 质和引物 . (3)无引物 PCR.新生 DNA片段互为引物 ,重新组装产 生全长的杂交 DNA链 (4)标准 PCR 加入特异的两端引物 三、基因融合和基因剪接 1利用基因融合技术表达外源基因的

28、缘由 2基因融合的策略与蛋白质分子嵌合体 3蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接 利用基因融合技术表达外源基因的缘由 外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶 降解 通过与特异蛋白质或特异的结构域形成 融合蛋白 ，利于快 速回收、纯化 融合蛋白可以体外切割去除融合部分，可以获得天然蛋白 通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，可以避免外源蛋白在 细胞内形成 包涵体 基因融合是对基因进行改造的手段，广泛用于蛋白质结构 功能的研究 基因融合的策略 将重组基因直接剪接于适当的 信号肽 之后 将外源基因本身按 阅读框架 自我融合。对 一些小肽的稳定表达、表达产物的活性非 常重要 目标蛋白在与其融合的蛋白伙伴序列的 C

29、端 或 N端融合 为蛋白质的表达和纯化提供方便 研究蛋白质的定位及移动 控制蛋白质固定的空间取向 构建具有双催化活性的融合蛋白或融合酶 防止外源蛋白被宿主的蛋白水解酶降解 改变胞内溶解性：硫氧还蛋白， GST 蛋白表达的空间定位：信号肽 接头（ linker）的设计 长度：过长对蛋白裂解敏感，免疫原性 增加；过短影响蛋白折叠 常用非极性的疏水氨基酸：构象广泛， 有利于运动；体积小有利于堆积 单链抗体（ scFv） 生化反应常常需要多酶顺序催化来进 行，称为顺序酶反应（ Sequence enzyme reaction）。大量的研究表明，通过基因融 合构建具有 双酶活力的融合蛋白 ，可有效 提高

30、顺序酶反应的总转化效率。 N-terminal C-terminal FAD 黑曲霉葡萄糖氧化酶 (Glucose oxidase,GOD) N-terminal C-terminal 曲霉糖化酶 (Glucoamylase,GA) GOD subunit GOD subunit GA GA GLG fusion enzyme Linker peptide Schematic process of the fusion enzyme formation Translated fusion peptide chains Expressed fusion enzyme (Ser-Gly) 融合蛋白

31、技术的应用可以使蛋白质的表达与纯化 方便地进行。一般来说，将目标蛋白编码基因与一段 被称为 “ 亲和尾 ” （ Affinity tail）的编码序列相连接， 这段 “ 亲和尾 ” 可以与亲和层析柱上的配基特异地结 合， 使目标蛋白可以用亲和层析的方法快速而简便地 纯化出来。 融合蛋白标签 含配体溶液 收集目的蛋白 洗下未结合的蛋白 混合蛋白样品 平衡液 带有配体的树脂 珠（或胶粒） 融合标签的功能 蛋白 纯化 蛋白质的 检测 和定向固定 体内生物事件的 可视化 提高重组蛋白质的 产量 增强重组蛋白质的可溶性及稳定性 融合蛋白 报告分子 将易于检测的蛋白质与目的分子融合表 达，可显示目标分子的

32、存在和定位，广 泛应用于启动子分析、监控转基因及其 表达、细胞的信号转导与药物的 筛选 绿色荧光蛋白 （ Green fluorescent protein, GFP) 是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内 的生物发光蛋白。其内源发光基团在受到紫外或蓝光 激发时，可高效发射绿光，且无需底物和辅因子。 GFP可作为一种 “ 荧光标签 ” 被用来研究目标蛋白的 定位及移动情况。 GFP的不同颜色 Green-GFP blue-BFP Cyan-CFP Red-RFP Yellow-YFP 各色荧光蛋白对细菌的标记 The diversity of genetic mutations is

33、 illustrated by this San Diego beach scene drawn with living bacteria expressing 8 different colors of fluorescent proteins. 2008年，科学家将多种色彩的荧 光蛋白质植入细菌的 DNA分子结 构中。在细菌体内植入荧光蛋白 可以观测这些细菌的生命机理是 如何运行的。 脑内连接 这张图片出自杰夫 利 希曼 (Jeff Lichtman) 之手，展现了大脑内 的连接，图片中美丽 的“彩虹”就是神经 系统网络。 连线 杂志网站曾于 2007年 刊登这张图片。 神经干细胞 这张不

34、太拥挤的图像表 明 干细胞是如何在空间 排列自己的 。神经干细 胞的 细胞核 被染为了 绿 色 ，另一种细胞 星 细胞 则表现为 红色。 荧光鱼 在约克镇科技公司将荧 光鱼引入市场后不久， 荧光蛋白便迅速在商业 上得到应用。在美国， 读者可以在加利福尼亚 以外的任何一个州购买 到荧光鱼。 (来源：新 浪科技 /孝文 ) GFP在肿瘤发病机制研究中的应用 GFP 是一个分子量较小的蛋白 , 易与其他一些目的基因形成融合 蛋白且不影响目的基因产物的空 间构象和功能。 GFP 与目的基 因融合 ,将目的基因标记为绿色 , 即可定量分析目的基因的表达水 平 ,显示其在肿瘤细胞内的表达 位置和量的变化

35、,为探讨该基因 在肿瘤发生、发展中的作用及其 分子机制提供便利条件。 荧光绒毛 2008年绿色荧光蛋白成为 诺贝奖的大赢家。这张图 片就是用诺贝尔奖技术炮 制的小肠绒毛图片，小肠 绒毛是凸出于小肠的细小 手状结构，具有吸收食物 营养的功能。 科学家将红 色荧光蛋白标记导入小肠 绒毛细胞中，展现出带有 荧光标记的小肠绒毛 。 真皮成纤维细胞 成纤维细胞 制造胶原蛋白，在 体内充当脚手架的作用，支持 其它细胞呆在适当的位置，同 时让其它化学物质“沐浴”这 些细胞。 图像中的这些细胞来自 人体皮 肤 ，被用于研究病毒是如何透 过皮肤入侵人体的。 为帮助了解这些病毒壳在做 什么，科学家让它和绿色荧光

36、蛋白结合，从而使它呈现为 绿 色 。 成纤维细胞的肌动蛋白被 染为了 红色 ， DNA则为 蓝色 。 应用举例二： 有机磷水解酶（ Organophosphorus hydrolase, OPH）能够降解许多种有机磷农药。将 GFP基因与 OPH基因的 5端融合，构建 GFP-OPH融合基因 ，并将 其在大肠杆菌中表达。经 IPTG诱导后，绿色荧光直接 可见，融合蛋白同时保持了 OPH 和 GFP的生物活性。 此外，由于 GFP的荧光强度与 OPH活力成正比，还可 通过荧光强度的检测对 OPH进行定量分析。 控制某一代谢途径的相关基因 , 紧密连锁地排列在一起 . Lac operon I p

37、 o Z Y A operon I:调控基因 P:启动子 O:操纵基因 乳糖代谢的条件 E. coli: “This is my favorite!” 乳糖 半乳糖 葡萄糖 如何利用乳糖 E. coli: “I need lactose permease, -galactosidase, and transacetylase.” 何时利用乳糖 E. coli: “I will use lactose only when there is no glucose and there is lactose.” Glucose + Lactose + Glucose Lactose Glucose L

38、actose + 乳糖操纵子的结构 P ro m o t e r Op e ra t o r la c Z la c Y la c A The lac operon 大肠杆菌乳糖操纵子 乳糖操纵子控制模型的主要内容： Z、 Y、 A基因的产物由同一条多顺反子的 mRNA分子所编码； 启动区 P位于阻遏基因 I与操纵区 O之间； 操纵区是 DNA上的一小段序列，是阻遏物结合 的位点； 当阻遏物与操纵区结合时， lac mRNA的转录起 始受到抑制； 诱导物通过与阻遏物结合，改变其三维构象， 使之不能与操纵区结合，使 lac mRNA能够合成。 乳糖操纵子 乳糖存在但是葡萄糖不存在的情况 Repr

39、essor Promoter LacY LacA LacZ Operator CAP Bindin g Repressor Repressor mRNA Hey man, Im constitutive CAP cAMP Repressor Repressor X This lactose has bent me out of shape CAP cAMP CAP cAMP Bind to me Polymerase RNA Pol. RNA Pol. Yipee ! 蛋白质剪接 原理 ：由蛋白质内含肽所介导。是一个 蛋白质翻译后的加工过程，它由一系列 分子内的剪切 -连接反应组成。 蛋白质内

40、含肽 是一个蛋白质前体中的多 肽序列，可以催化自身从蛋白质前体中 断裂，使两侧的蛋白质外显子连接成成 熟的蛋白质。 利用内含肽载体致力生物合成 C-S酯 键肽链或 N-半胱氨酸肽链 内含肽介导的异源蛋白质体外连接 用反式剪切技术实现蛋白质体内、体 外连接 双内含肽介导的蛋白质自身环化及蛋 白多聚体的生成 内含肽的应用 intein 胰岛素的研发史 自 18世纪至今，在诸多研究者不断进取的努力 下，胰岛素的研究经历了五个阶段： 发现胰岛素 得到胰岛素 了解胰岛素 合成胰岛素 改造胰岛素 与胰岛素研究相关的诺贝尔奖项 1923- F.G. Banting 医学奖 J.J.R.Macleod 生理学

41、奖 1958- Frederick Sanger化学奖 1977- Rosalyn Yalow 生理学或医学奖 The Nobel Prize 95 胰岛素的研究发展史 改造胰岛素 胰岛素的蛋白质空间结构对维持其生物活性有很 重要的意义，人工合成的胰岛素制剂受此影响在 皮下注射后需有一定的解离时间才能发挥效力， 故治疗时需提前 20-30分钟注射胰岛素。 糖尿病人需要更接近生理状态、使用方便的胰岛 素制剂。 利用基因重组技术，修饰胰岛素的氨基酸组合： A 1 B 1 21 30 28 27 27 28 lispro 基因合成的人胰岛素类似物 优泌乐 赖脯胰岛素 A 1 B 1 21 30 天门

42、冬氨酸 赖氨酸 glulisine 谷氨酸 赖氨酸 谷赖胰岛素 基因重组的速效人胰岛 素类似物，直接以单体 胰岛素的形式入血，能 够在注射后被迅速吸收， 注射 10分钟后即可起效。 与长效胰岛素联合应用， 模拟基础、餐时胰岛素 治疗，血糖更易控制， 低血糖发生率低 。 人胰岛素类似物 基因重组的速效 人胰岛素类似物 的预混制剂，具 有餐时注射起效 快，灵活方便的 特性。 A 1 B 1 21 30 天门冬氨酸 脯氨酸 aspart 诺和锐 门冬胰岛素 诺和锐 30特充 速效胰岛素 几十年来 ,胰岛素注射器 已经有了很大的改进。许 多品牌厂商制造胰岛素专 用注射器 ,针头经过特殊 处理 ,因而注

43、射时不感到 疼痛 ,而且针眼很小。注 射器针筒上直接标有胰岛 素单位 (IU)，注射几个单 位胰岛素只要按标记抽取 , 不需换算。 一次性注射器 一种利用高压将胰岛素 “喷”入皮下的装置， 无需针头，加之其经久 耐用，常给惧怕针头的 儿童使用。但此装置价 格较贵，拆洗安装过程 较繁琐，喷射时局部压 力较大，尚未广泛推广 使用。目前高压注射器 多用于人群计划免疫和 多人集中注射的情况。 高压无针注射仪 胰岛素笔是一种形如钢 笔的专用注射装置 ,将 胰岛素液储存于笔中 , 使用前调好剂量旋钮 , 患者自己注射方便易行。 胰岛素笔配有专用笔盒 , 可随身携带 ,更方便于 旅行出差时使用。 笔上配有触感式剂量调 整旋纽 ，也能适用于 眼睛不方便的患者。 胰岛素笔 胰岛素泵是目前最方便、最现 代化的注射方式，可以自动定 时定量地注射胰岛素，能较好 模拟生理性胰岛素分泌，可以 准确控制胰岛素的输入剂量， 并能经导管连续不断按需要将 胰岛素输入患者皮下。随着技 术的发展，胰岛素泵越发小巧， 功能亦不断完善，目前的胰岛 素泵仅重约 100克 ,如一台寻呼 机大小，携带方便。 胰岛素泵