蔬菜中天然色素的提取、分离和测定

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1、蔬菜中天然色素的提取、分离和测定一、目的与要求1. 进一步熟悉和掌握薄层色谱的原理。2. 掌握薄层层析法分离微量组分的操作技术。3. 了解蔬菜中主要色素的基本性质，通过色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法 及原理。二、基本原理（一）菠菜中的色素简介菠菜叶中富含多种色素成分，如叶绿素（绿色X胡萝卜素（橙黄色）和叶黄素（黄色） 等多种天然色素。叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a（C55H72O5N4Mg）和叶绿素 b（C55H7O6N4Mg）,结构见图1。二者差别仅是a中一个甲基被b中的甲酰基所取代。它们 都是毗咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。图1叶绿素a和叶

2、绿素b的结构（叶绿素a： R=CH3，叶绿素b： R=CHO）R*CH3图2。-胡萝卜素和叶黄素的结构（。-胡萝卜素：R =H，叶黄素：R = OH）胡萝卜素（C40H56，见图2）是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体，即a-, P -和 Y-胡萝卜素，其中P -异构体含量最多，也最重要。在生物体内邛-体受酶催化氧化即形 成维生素A。目前p -胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生素A使用，也可作为食 品工业中的色素。叶黄素（C40H56O2,见图2）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含 量通常是胡萝卜素的两倍。与P-胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较 小。根据这些色素在有

3、机溶剂中的溶解性,可将它们提取出来。1. 菠菜中各色素的理化性质绿色植物中的叶绿体色素在把光能转变为化学能的光和作用中起着重要作用。叶绿体色 素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括0-胡萝卜素，叶黄素，叶绿素a和叶绿素b四种色 素，它们在叶绿体中的含量比约为2： 1： 3： 1。叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化 剂。(1) 叶绿素a有四个甲基与卟吩核连接(RCH3)，蜡状蓝黑色微小晶体，熔点117120C，溶于乙 醇、乙醚、丙酮、氯仿、二硫化碳和苯，不溶于石油醚。其乙醇溶液是蓝绿色，并有深红色 火光。(2) 叶绿素b有三个甲基和一个醛基与卟吩核连接(R=CHO)，蜡状蓝黑色微小晶体，熔点12

4、0 130 C，溶于乙醇和乙醚，难溶于石油醚。乙醚溶液有亮绿色，其它有机溶剂的溶液通常是 绿色至黄绿色，并有红色荧光。可用作肥皂、脂肪、油蜡、食品、化妆品和医药用的无毒着 色剂。由绿叶用乙醇萃取而制得，也可用化学方法合成。(3) 胡萝卜素胡萝卜素有多种异构体，是四萜类化合物。a-胡萝卜素为红色结晶，熔点187C，旋光 度+385(c=0.08,苯)，溶于乙醚、苯、氯仿-胡萝卜素为红棕色结晶，熔点181C，溶于乙 醚、丙酮、苯、石油醚；Y-胡萝卜素为紫色棱形结晶，熔点177.5C，溶于苯、氯仿。a-，0- 和Y-胡萝卜素常共存于许多植物中。0-胡萝卜素含量最高，0-胡萝卜素在植物中几乎总是和 叶

5、绿素共存，含量最多的是胡萝卜、棕榈油以及多种绿叶植物。用做食物色素、保健食品， 以及作防晒化妆品成分，还可用作制造维生素A的原料。(4) 叶黄素又称胡萝卜醇，一类羟基类胡萝卜素的衍生物，以乙醚加甲醇精制，得黄色穗状物，具 金属光泽的结晶。熔点183 C，不溶于水，溶于油性溶剂，光稳定性较好，主要与叶绿素、 胡萝卜素共存于绿色植物的叶和花中。在天然黄色素中，它的价格较贵，可用于食品着色。 也有添加于禽饲料中，使禽蛋蛋黄增进黄色。2. 叶绿素的吸收光谱Tulv* * -9EC- - Ja 3叶嫁素的般枚无诺叶绿素a呈蓝绿色，叶绿素b呈黄绿色。从图3中可以看出，叶绿素a、叶绿素b的强 吸收带有两个，

6、一个在波长为630-680nm的红光区，另一个在波长为400-460nm的蓝紫光 区。（二）薄层层析（薄层色谱）薄层层析是快速分离和定性分析微量物质的一种极为重要的实验技术，具有设备简单、 操作方便而快速的特点，可用于精制样品、化合物鉴定、跟踪反应进程和柱色谱的先导（即 为柱色谱摸索最佳条件）等方面。薄层层析是将固定相支持物均匀地铺在玻片上制成薄层板，待分离的样品溶液点在薄层 一端，试样中各组分就被吸附剂所吸附，但吸附剂对不同物质的吸附能力是不同的。将薄层 板点有样品的一端浸入层析容器中，在合适的溶剂做为流动相展开剂的作用下展开。由于薄 层吸附剂（如硅胶）的毛细作用，展开剂将沿着薄板逐渐上升。

7、当溶剂流经试样时，样品中 的各组分就溶解在展开剂中。在吸附剂的吸附力和展开剂的毛细上升力作用下，物质就在吸 附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附和解析平衡。吸附力强的物质相对移动得慢一些，而 吸附力弱的物质相对移动得快一些。经过一段时间的展开，样品中各物质就彼此分开，最后 形成互相分离的斑点，称为薄层层析谱。用此法分离时几乎不受温度的影响，可采用腐蚀性 显色剂，而且可在高温下显色，特别适用于挥发性小或在较高温度下易发生反应的物质，同 时也常用来跟踪有机反应或监测有机反应完成的程度。薄层层析按分离机制不同可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析等，最常用的为吸 附薄层层析。吸附层析中样品在薄层板上经

8、过连续、反复的被吸附刑吸附及展开剂解吸附过 程，由于不同的物质被吸附剂吸附的能力及被展开剂解吸附的能力不同，放在薄层上以不同 速度移动而得以分离。1. 薄层层析的器材选择（1）基板：玻璃、塑料、金属箔，常用玻璃板。溶剂在薄层板上爬升的距离越长，化合物的分离效果越好。宽的薄层板也可用于量较 大的样品，具有12 mm厚的大板可用于501000 mg样品的分离制备。由于薄层色谱法用途非常广泛，国内外均有现成的铺有吸附剂的薄层板出售。一般实验 室中也可自己制备。（2）吸附剂吸附剂要有合适的吸附力，并且必须与展开剂和被吸附物质均不起化学反应。可用作吸 附剂的物质很多，常用的有硅胶和氧化铝，由于吸附性好，

9、适用于各类化合物的分离，应用 最广。选择吸附剂时主要根据样品的溶解度、酸碱性及极性。以下简单介绍吸附剂的几个基 本参数。 种类：常用：氧化铝（强极性）、硅胶（中强极性）不常用：硅藻土、纤维素、糖类、活性碳 符号：H无任何添加剂；G加有锻石膏（Gypsum，CaSO41/2 H2O）粘合剂；F加有荧光素（Fluorescein）CMC加有羧甲基纤维素钠（Carboxymethylcellulose）例：硅胶GF254表示硅胶中既加有煅石膏粘合剂，也加有荧光素，可以在波长254nm的紫 外光下激发出荧光粒度：目：1cm2内的筛孔数，数目越大，颗粒越小。薄层所用吸附剂颗粒较细，氧化铝为 200目，硅

10、胶为100150目。心 颗粒的平均直径，以微米表示。例如：40g的颗粒与100目相当。 活性：活化通常是加热粉末以脱去水分。化合物极性越大，它在硅胶和氧化铝上的吸附力越 强，所以吸附剂均制成活性精细粉末。吸附剂按其含水量的多少各分为五个等级：I级含水 量最少，活性最高；V级含水量最多，活性最低；但并不是活性越高分离效果越好，选用哪 种活性级别的吸附剂，要用实验的方法来确定。 酸碱性：市售氧化铝有酸性（用以分离酸性化合物）、中性、碱性（用以分离生物碱等碱性化合 物），其蒸馏水洗出液的pH值分别为4、7.5、9-10；其中以中性氧化铝应用最广，可用来 分离各种化合物，特别是那些对酸、碱敏感的化合物

11、。硅胶没有酸碱性之分。（3）展开剂在样品组分-吸附剂-展开剂三个因素中。对一确定组分，样品的结构和性质可看作是一 不变因素，吸附剂和展开剂是可变因素。而吸附剂的种类有限，因此选择合适的展开剂就成 为解决问题的关键。展开剂的选择有以下要求：a. 对待测组分有很好的溶解度。b. 能使待测组分与杂质分开，与基线分离。c. 使展开后的组分斑点圆而集中，不应有拖尾现象。d. 使待测组分的Rf值最好在0.40.5，如样品中待测组分较多，Rf值则可在0.250.75范圈 内，组分间的Rf值最好相差0.1左右。e. 不与组分发生化学反应，或在某些吸附剂存在下发生聚合。f. 具有适中的沸点和较低的粘滞度。展开剂

12、的极性是指与样品组分相互作用时。展开剂分子与吸附剂分子的色散作用、偶极 作用、氢键作用及介电作用的总和。展开剂要根据样品的极性及溶解度，吸附剂活性等因素 进行选择，总的原则是展开剂的极性能使组分的Rf值在0.5左右。常用溶剂极性次序是： 石油醚 环己烷 苯 乙醚 氯仿 乙酸丁酯 正丁醇 丙酮 乙醇 甲醇。如一种溶剂不能充分展开，可选用二元或多元溶剂系统。2. 样品的制备与点样样品必须溶解在挥发性的有机溶剂中，浓度最好是12 %。溶剂应具有高的挥发性以便 于立即蒸发。丙酮、二氯甲烷和氯仿等是常用的有机溶剂。分析固体样品时，可将2040mg 样品溶到2mL的溶剂中。在距薄层板底端约1cm处，用铅笔

13、划一条线，作为起点线。用毛 细管（内径小于1mm）吸取样品溶液，垂直地轻轻接触到薄层板的起点线上。样品量不能 太多，否则易造成斑点过大，互相交叉或拖尾，不能得到很好的分离效果。3. 展开槽与展开薄层的展开在密闭的容器即展开槽或称为层析缸中进行。合适的展开剂用量为浸及下端 薄层板，但不浸及样点；点样端向下，每次只展开一块，放在正中，以免爬斜（进而展开倾 斜）。4. 显色如果化合物本身有颜色，就可直接观察它的斑点。如果本身无色，可先在紫外灯光下观 察有无荧光斑点（有苯环的物质都有），用铅笔在薄层板上划出斑点的位置；对于在紫外灯 光下不显色的，可放在含少量碘蒸气的容器中显色来检查色点（因为许多化合物

14、都能和碘成 黄棕色斑点），显色后，立即用铅笔标出斑点的位置。常用普适性显色剂：浓硫酸、碘蒸气、 荧光素，专用显色剂：茚三酮、三氯化铁溶液等。5. Rf （比移值）的测定Rf （比移值）表示物质移动的相对距离，即展开后样品点到原点的距离和溶剂前沿到原 点的距离之比，常用分数表示。Rf值与化合物的结构、薄层板上的吸附剂、展开剂、显色 方法和温度等因数有关。但在上述条件固定的情况下，Rf值对每一种化合物来说是一个特 定的数值。当两个化合物具有相同的Rf值时，在未做进一步的分析之前不能确定它们是不 是同一个化合物。在这种情况下，简单的方法是使用不同的溶剂或混合溶剂来作进一步的检 验。通常用比移值（Rf

15、）表示物质移动的相对距离：R 色斑最高浓度中心至原点中心的距离/展开剂前沿至原点中心的距离Rf值计算示意图1. 起点线；2.展开剂前沿a,色斑最高浓度中心至原点中心的距离b,展开剂前沿至原点中心的距离物质的比移值随化合物的结构、吸附剂、展开剂等不同而异，但在一定条件下每一种化 合物的比移值都为一个特定的数值。故在相同条件下分别测定已知和未知化合物的比移 值.再进行对照，即可对未知化合物鉴别。对于不同的样品，可以选择不同的吸附剂和展开剂；可以做吸附层析，也可以做分配 层析或离子交换层析。层析谱不仅可做定性鉴定，也可以进行定量分析。每次点样所需的样 品量仅几微升到几十微升，因此它是一种高效、快速的

16、微量分析方法。本实验利用薄层层析进行菠菜中叶绿素的提取、分离和测定。三、仪器和试剂仪器：研钵，层析缸，分液漏斗试剂：硅胶G（200-300目），羧甲基纤维素钠（CMC）（0.5%），碳酸钙，石英砂，丙酮， 乙醚，石油醚，乙醇，苯，乙酸乙酯，氯化钠，无水硫酸钠。四、实验步骤1. 制板选用5.0 30.0 （cm）规格的玻璃板两块，用肥皂水洗净，用蒸馏水淋洗两次后烘干，用 时再用酒精棉球擦除手印至对光平放无斑痕。称取5g硅胶G粉于100mL烧杯中，按硅胶和水1 : 3（w/w）的比例加入0.5%CMC水溶 液，调成均匀的糊状（在平铺玻璃板上能晃动但不能流动），用倾泻法涂在干净薄层板上， 用玻璃棒均

17、匀地摊开，然后，用手托住玻璃板一头，另一头放在桌面上轻轻振敲，使硅胶浆 料均匀平整铺开，成薄厚均匀、表面光洁平整、无气泡的薄层板，厚度为0.251.0mm。水 平放置，待薄层发白近干（注意：室温放置必须使玻板干透，否则会出现断裂现象），然后 将晾干的薄层板放在烘箱中逐步升温至110C的活化30min，取出放在干燥器中冷至室温， 备用。2. 叶绿素的提取新鲜菠菜叶依次用自来水和去离子水洗净，弃除叶柄和中脉，晾干或用纱布、吸水纸 将菜叶表面的水份吸干。称取处理过的菜叶5g，剪碎放于干净的研钵中，加少量的碳酸钙 和干净的石英砂，将菜叶粗捣烂。方法一：将粗捣烂的菜叶置于带塞锥形瓶中，加入30 mL 2

18、 : 1 （v/v）的石油醚和乙醇 混合溶剂，浸没菠菜叶片，用玻棒搅动数分钟，以利于菠菜叶的细胞破裂，色素浸出。布氏 漏斗抽滤，将菠菜汁转入分液漏斗，分去水层，分别用等体积的饱和食盐水和蒸馏水洗涤两 次，以除去萃取液中的乙醇（洗涤时要轻轻旋荡，以防止产生乳化）弃去水-乙醇层，石油 醚层用无水硫酸钠干燥后滤入锥型瓶，置于暗处备用。方法二：将粗捣烂的菜叶置于带塞锥形瓶中，加入10mL去离子水、30mL丙酮，搅拌 10min,使色素溶解。抽滤滤去残渣，得深绿色叶绿素丙酮溶液。取5mL叶绿素丙酮提取液， 于60mL分液漏斗中，加入3mL乙醚萃取，弃下层丙酮溶液，得叶绿素的乙醚提取液。3. 点样取活化后

19、的层析板，分别在距一端2cm处用铅笔轻轻划一横线作为起始线。另一端距 约1cm处也划一横线作为终止线。取毛细管（直径0.5mm）插入样品溶液中取液，在暗处 距离薄板一端2cm处（以画线作为起始线）点样，将试液点成一条线，待第一次液点干后 再点一次，共重复3-5次，注意：点样时手指捏住毛细管下端，垂直点样，轻触薄层板后立即抬起。点样要轻，不 可刺破薄层。因溶液太稀或样点太小，可重复点样。但应在前次点样的溶剂挥发后，方可重 点，以防样点被溶解掉。4. 展开薄层色谱的展开，须在密闭容器中进行。将展开剂注入层析缸中，摇匀，加盖使缸内蒸气饱和10min，再将点好样的薄层板斜靠 于层析缸内壁。点样端接触展

20、开剂但样点不能浸没于展开剂中，一般展开剂浸没薄板下端的 高度不宜超过0.5cm，密闭层祈缸。将层析缸盖好，放在暗处展开，待展开剂的前沿离薄板 顶部12cm时，取出薄板平放，用铅笔或小针划前沿线位置，晾干或用电吹风吹干薄层。 从上到下依次为胡萝卜素（橙黄色）、叶绿素a （蓝绿色）、叶绿素b （黄绿色）、叶黄素 （黄色）。记下个色带中心到原点（起始线）的距离和溶剂前沿到原点的距离，计算叶绿素 a和叶绿素b的Rf值：Rf=a/b=原点至斑点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离在薄层层析中，常用Rf来表示各组分在层析谱中的位置，它与被分离物质的性质有关， 在一定条件下为一常数，其值在01之间。被分离物质间

21、的Rf值相差越大，则分离效果越 好。薄层色谱展开剂的选择主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素。溶剂的 极性越大，则对化合物的解吸能力越强，即Rf值也越大。如Rf值较大，可考虑换用一种极性较小的溶剂，或在原用展开剂中加入适量极性较小 的溶剂。相反，如原用展开剂使样品各组分的Rf值较小，则可加入适量极性较大的溶剂，如氯仿中加入适量的乙醇。常用展开剂的极性大小如下:水乙醇乙酸乙酯氯仿苯环己烷石油醚本次实验采用的以下展开剂（体积比）：（a）石油醚-丙酮-苯（2： 1.5： 2）（b）石油醚-丙酮（8： 2）（c）石油醚-乙酸乙酯（6： 4）（d）石油醚-丙酮-乙醚（3： 1： 1）（e）乙醚

22、-石油醚-丙酮-正丙醇（15： 7.5： 2.5： 0.12）5. 叶绿素a和叶绿素b的色带从玻璃板上刮下来并放在离心管中，加入5mL乙醚，振摇， 离心后得澄清蓝绿色溶液。在仪器上测定其在360700nm波长范围的吸收曲线，并与标准 谱图进行比较。五、结果与讨论填写表1，并根据各色素的颜色、分子极性与Rf值的关系、吸收光谱、荧光对分离出 的色素进行鉴定归属，讨论结构对Rf值、吸收光谱的影响。表1菠菜叶片色素色谱分析数据及归属编号颜色Rf值荧光紫外吸收nm（乙醚）文献值归属12345六、注意事项1. 从菠菜中提取叶绿素时，1 加入少量碳酸钙的作用是防止失去Mg，中和植物细胞中的酸。2 研磨只可适当，不可研磨得太烂而成湖状，否则会造成分离困难。3 方法一中水洗的目的是除去有机相中少量的乙醇和其它水溶性物质，洗涤时要轻轻振 荡，以防止产生乳化现象。2. 点样及画线时应十分小心，不要将薄层碰破。3. 测定吸收光谱时若样品量较少，可同时展开两块或三块薄板，将叶绿素斑点刮下来同时 测定。4. 叶绿素对酸、碱和光很敏感，整个实验应在中性条件和暗处（或弱光）进行，各操作步 骤应在尽可能短的时间内完成。5 .展开缸一定要密封，并随时观测展开状态。