菌种传代与复苏

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1、菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备， 菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、 微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要 的基础工作。菌种代号国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F域CMCC(B)，CMCC-中国医学菌种 保藏中心，、，B代表细菌，F代表真菌。金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63501 白色念珠菌 CMCC(F)98001 黑曲霉 CMCC(F)98003传代和接种菌种冻干粉复苏把冻干菌

2、种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支， 移入接种室或净化台。先用砂轮将冻干菌种安甑瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒， 稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在 火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而 炸裂。取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在 火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液， 分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养 肉汤及营养琼脂斜面

3、进行培养。菌种斜面传代操作培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名及菌种编 号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净 工作台。点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环 烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰 上旋转烧灼，右手无名指，小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环深入管内先在近壁的 琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种环，并将菌种管口 移至火焰旁。堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面一支，照上述操作打开棉塞，将接

4、种环 深入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜 面的表面上。取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼 灭菌。菌种的培养与保存大肠杆菌35-37摄氏度培养48小时金黄色葡萄球菌30-35摄氏度培养48小时枯草芽孢杆菌30-35摄氏度培养48小时 白色念珠菌23-28摄氏度培养7天 黑曲霉 23-28摄氏度培养7天将培养物管自培养箱取出后放入冰箱（2-8摄氏度）保存，一般2个月转种一次。菌悬液的制备取上述培养好的菌种斜面移入接种室或净化工作台，放置室温后，用接种环取菌苔少 许接种至营养肉汤中（lOml/支，已灭菌），将已接

5、种毕的细菌管置35-37摄氏度培养18-24 小时，取出备用。一般于冰箱中保存可用两周。取上述培养好的营养肉汤菌悬液（浓菌液）1ml，加到9ml%无菌氯化钠溶液混匀，为 10-1，再取另一只刻度吸管吸取10-1菌液1ml加到无菌氯化钠溶液中混匀，为10-2.以 此类推，稀释至含活菌数在50-100个。用平板计数。此稀释菌液用于试验后加阳性对照，可在一周内使用。记录传代和接种使用后，应做好菌种传代接种记录。菌悬液制备后，应做好菌液制备使用记录。依据：中国药典2010年版二部及菌种使用说明书1. 标准菌的来源标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（China Medical cultur

6、ecollection ,CMCC）提供的冷冻干燥菌种（0代）或由上级药检部门已接种好的菌种斜面（3 代）。黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。中 国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签CMCC（B）代表细菌（bacteria）,CMCC（F）代表真菌（fungi）每种菌具有固定的代号。2. 标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安甑装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌 种附有的相关资料。接收菌种时应检查安甑的数量和名称，和每一支安甑的完整性。在相应 的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等

7、。在菌种安甑及 菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、 有效期至。新购入的0代原始菌种储存于一20C，有效期为三年。从上级药检部门购买的已 接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。储存于28 C,有效期为3个月。3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球培养基改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门 菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。改良马丁培养基:用

8、于白色念珠菌复苏、复壮.操作步骤：a. 打开洁净工作台。b. 在安甑的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。c. 用一小砂轮在安甑的上部划一条线，用手轻轻将安甑掰开（开启安甑时必须小心，因 为安甑遇热时可能会破裂）。d. 以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取ml到安甑中。e. 轻轻地旋转安甑以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。f. 用无菌吸管将安甑内菌液全部转接到相应的液体培养基。g. 根据安甑上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度 30 35C，培养1824小时；真菌培养温度2328C，培养35天。观察是否浑浊，浑浊说 明菌种复苏生长；若不浑浊

9、，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天， 若仍未浑浊，灭菌处理。h. 黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体12滴滴在改良马 丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置2328C培养57天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色 泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。确认后用含有 （ml/ml） 的吐温-80的无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。i. 取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。以无 菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/f分装于冻存管。每个菌 种制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为

10、质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液 20ml。以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻 存管。制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确 认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代 号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。j. 储备菌种管制备成功，储存于一20C，有效期为三年。菌种确认用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板上，或相应的宜于该 细菌生长的鉴别平板上，划

11、线分离出单个菌落。然后在3035C下培养23天；同样的方 法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板，并在2328C下培养7天；培养后，观察其菌落形 态，应符合该菌种形态特征。污染处理假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明或操作有污染或菌种不纯。将此被污染了 的培养物灭菌处理。可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为第四代。并重新制备 储备菌种管菌种的传代与保藏将菌种接种至一新鲜培养基上，每萌发一次即称为一代，因此，当原始菌种复溶并转至 新培养基内生长，即认为已传代一次，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷 冻干燥的原始菌种开启后转种后为第1代，直到第3代为工作菌种。菌种的传代次数（自原

12、 始菌种冻干粉起）不得超过5代。菌种的传代保藏过程项下标准菌的复苏为传第一代，复壮为第二代。传第三代时取1支冻存管自然解冻， 将其转接斜面菌种作为工作用菌种。此时，工作用菌种为第3代。工作用菌种，分为两类： 一类用于定期传代（W3），一类用于实验用（S3）。定期传代用菌的传代其操作步骤如下（斜面接种法）：（1）从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟。（2）将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一 并移入洁净工作台，打开紫外灯照射一小时。（3）关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接 种棒后端，将接种环烧红约30秒，随后将

13、接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。(4) 右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻 轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少 量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。(5) 塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面(或改良马丁琼脂斜面)一支， 照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从底部向 上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。(6) 取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火 焰上烧灼灭菌。(7) 将已接种好的细菌管置3

14、035C细菌培养箱培养2224h，真菌管置2328C 真菌培养箱最多培养7天。当工作用菌种传代代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种， 如：(W3)可直接转接为(W4)。按上述程序操作，直至(W4)转为(W5)为止，需重新 接种，旧的工作菌种进行销毁。菌种斜面的培养、保藏条件及时间菌种培养条件及时间培养基保存条件及时间大肠埃希菌(CMCC(B)44102)30 35C22 24h营养琼脂培养基2C8 C保存3个月金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)30 35C22 24h营养琼脂培养基2C8 C保存3个月枯草芽孢杆菌(CMCC(B)63501)30 35C22 24h

15、营养琼脂培养基2C8 C保存3个月铜绿假单胞菌(CMCC(B)10104)30 35C22 24h营养琼脂培养基2C8 C保存3个月乙型副伤寒沙门菌(CMCC(B)50094)30 35C22 24h营养琼脂培养基2C8 C保存3个月生孢梭菌(CMCC(B)64941)30 35C22 24h营养琼脂培养基2C8 C保存3个月白色念珠菌(CMCC(F)98001)2328C最多7天改良马丁琼脂培养基2C8 C保存3个月黑曲霉(CMCC(F)98003)2328C最多7天改良马丁琼脂培养基2C8 C保存3个月短小芽孢杆菌(CMCC(B)63602)3035C2224h营养琼脂培养基2C8 C保存3个月注：菌种斜面1次/周观察状态是否正常。菌种的使用及销毁每次进行菌种复活时，只能复活一个菌种。如果要复活其他菌时，应对所用物品重新消毒灭菌。每次操作，都应进行记录。菌种管上应贴有牢固的标签。标明菌种名称、菌种代号、代 次、传代人、编号和传代日期、贮存条件、有效期至等。废弃菌种及实验用品废弃物的处理：121C高压蒸汽灭菌30分钟。并对操作过程进行 记录。