一种新型优化的肝组织羟脯氨酸含量测定方法的建立

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1、一种新型优化的肝组织羟脯氨酸含量测定方法的建立 目的 建立一种可信度、敏感度高，适合于微量组织羟脯氨酸含量的测定方法胃酶酸解法。方法 在组织、重量、氧化时间、显色温度、样品中盐浓度及对二氨基苯甲醛（PDAB）一定的条件下，对胃酶法和传统盐酸水解法进行了比较。结果 在相同条件下，传统方法测得HYP含量为0.0451.547g/ml，平均值为0.7789g/ml；胃酶酸解法测得羟脯氨酸含量为2.9554.500g/ml，平均值为3.921g/ml，两者比较差异有显著性（P0.01）。结论 胃酶酸解法的可信度、敏感度均优于传统方法，其更适合于微量组织羟脯氨酸的测定。 羟脯氨酸;胃酶酸解法 Estab

2、lishment of a new and grading-up assay method of HYP in hepatic tissueXIU He-Ming，GUO Zheng-Rong，XU Zheng.Bethune International Peace Hospital of PLA， Shijiazhuang 050082, China Objective To establish a assay method of hydroxyproline suited for microcomponent with high degree of confidence and sensi

3、tiveness.Methods The two methods of gastric enzyme method and traditional acidification method are compared under the same condition of tissue， weight， oxidize time， coloration temperature， salinity in the sample and para-diaminobenzaidehyde（PDAB）.Results At the same condition，the content of HYP mea

4、sured by traditional method is between 0.0451.547g/ml，the mean value is 0.7789g/ml；the content of HYP measured by gastric enzyme method is between 2.9554.500g/ml，the mean value is 3.921g/ml. The results was statistically significant difference（P0.01）.Conclusion The gastric enzyme method is better th

5、an the traditional method in degree of confidence and sensitiveness，and it is more suited for microcomponent. hydroxyproline;gastric enzyme acidification method 羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）是一种非必需氨基酸，是机体胶原蛋白的主要成分之一，几乎所有的HYP都存在于胶原中，被认为是胶原中的特征性氨基酸。因此，HYP含量的测定已成为衡量机体胶原含量的一个重要指标，寻求一种合理、优化的HYP含量的测定方法已成为众多学者关注

6、的焦点。目前，人们多使用传统的盐酸水解法测定HYP的含量，由于传统方法对组织要求量比较大，水解不够彻底等缺点限制了其广泛应用。近年来许多的学者对HYP的测定条件进行了多方面、多层次、多途径的研究，同时也深入的探讨了不同测定方法。虽然在时间、试剂用量、所需器材等方面有了很大的改进，但对其测定方法的研究欠缺，仍未能找到一种方便、快捷、可靠性高的测定方法。笔者对HYP含量测定方法进行了仔细的研究，对传统方法的缺点进行了改进，在标本重量、氧化时间、显色温度、样品中盐浓度及对二氨基苯甲醛（PDAB）一定的条件下，对两种方法进行了比较，探索出一条更为先进、稳定可靠的HYP含量检测方法。现报告如下。1 材料

7、与方法1.1 主要实验材料1.1.1 羟脯氨酸标准品 北京鼎国生物技术发展中心（进口分装）。1.1.2 胃蛋白酶 北京中杉生物技术有限公司 （进口分装）。1.1.3 氯胺T 天津市光复精细化工研究所。1.1.4 对二氨基苯甲醛（PDAB） 天津市博迪化工有限公司。1.1.5 酶标仪 美国VERSAmax。1.1.6 微量电子天平 瑞士METTLer AE260。1.2 试剂配制1.2.1 标准HYP储存液（1mg/ml） 称取100mg HYP标准品，用0.1mol/L盐酸溶解并定容至100ml，置棕色瓶于4保存。1.2.2 标准HYP应用液（25g/ml） 取标准HYP储存液（1mg/ml）

8、2.5ml，双蒸水定容至100ml，4保存，可用23周。1.2.3 0.1mol/L柠檬酸缓冲液pH 6.0 0.3g柠檬酸和3.25g柠檬酸钠加双蒸水溶解并定容至100ml。1.2.4 0.05mol/L氯胺T溶液 1.41g氯胺T用少量甲醇溶解并定容至100ml。1.2.5 10对二氨基苯甲醛（PDAB） 10g PDAB用少量甲醇溶解并定容至100ml。1.2.6 3.15mol/L高氯酸溶液 70高氯酸27ml加双蒸水至100ml。1.2.7 40NaOH溶液 40gNaOH双蒸水溶解并定容至100ml。1.2.8 0.5胃蛋白酶溶液 0.5g胃蛋白酶加少量0.2mol/L盐酸溶解并定容至100ml。1.3 组织样品 本实验组织样品为肝硬化大鼠肝组织（Wistar大鼠由河北医科大学动物实验中心提供），肝硬化模型用0.03硫代乙酰胺（TAA）喂饲5个月制备1，经病理检查证实为肝硬化后，用25硫苯妥钠腹腔麻醉后开腹摘取肝右叶，80保存备用。