生物分离工程复习纲要

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1、第一章：绪论1、 生物分离工程概念回收生物产品分离过程的原理与方法，即从发酵液、酶反应液、动植物细胞培养液中分离、纯化生物产品的过程。2、 生物分离工程研究的内容目标产品及其基质的性质。根据产品及基质选择适宜的分离纯化技术(基本技术原理；基本方法；基本设备)。第二章：发酵液预处理1、 发酵液预处理的目的除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于后继各步操作；改变发酵液的物理性质和降低溶液的粘度；尽可能使产物转入便于以后处理的相中。（除去悬浮颗粒、改善滤液的性状、方便后续步骤）2、 凝集与絮凝凝集(coagulation)作用是在某些电解质作用下，如中性盐作用下，使扩散双电层的排斥电位降低，破坏

2、胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。（机理：中和粒子表面电荷；消除双电层结构；破坏水化膜）（通过电解质破坏胶体分散状态）絮凝(flocculation)：指在某些高分子絮凝剂存在下，在悬浮粒子之间产生架桥作用，而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程。（物理高分子物质的桥联作用）3、 高价态无机离子的去除Ca2+去除：一般用草酸的钠盐生成草酸钙；Mg2+去除：加入三聚磷酸钠，从而形成三聚磷酸钠镁络合物；Fe3+去除：加入黄血盐(亚铁氰化钾) 。4、 固液分离的主要方法a) 过滤（垂直过滤（死过滤）；错流过滤）b) 离心第三章：细胞分离技术1、 细胞破碎的方法（了解原理）机械法：主要利用高压、研磨

3、、超声波等方法产生剪切力达到破碎细胞壁的目的。热量的产生是该法的一个缺点。高压匀浆的原理：从高压室（几百个大气压）压出的细胞悬浮液速度可达几百米每秒，高速喷出的浆液喷射到静止的撞击环上，细胞在高速造成的剪切力，碰撞力和高压到常压的变化等作用下，造成细胞破碎。珠磨法的原理：细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎。超声波破碎法的原理：液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。非机械法：主要通过酶反应，化学溶胞，改变渗透压等方法

4、破坏细胞壁和细胞膜达到细胞破碎的目的。酶解法：利用酶促反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。渗透压冲击法：介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。冻结-融化：将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。化学法：用酸碱及表面活性剂处理，可以使蛋白质水解，细胞溶解或使某些组分从细胞内渗漏出来。2、 包涵体形成的可能原因包涵体的形成主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的 。（1）表达量高：原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，

5、二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 （2）氨基酸含硫过高：重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。（3）环境不适合：重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 （4）异源蛋白：由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。第四章：沉淀技术1、 维持蛋白质胶体稳定的因素蛋白质分子表面的水化层；蛋白质分子间的静电斥力2、 盐析的原理，盐析与变性的关系原理：亲水性大于蛋白质破坏水化层；带电离子中和蛋白质表面电荷盐析与变性的关系：盐析

6、是可逆的，变性是不可逆的3、 低盐浓度下，蛋白质溶解度与离子强度的关系向蛋白质的纯水溶液中加入电介质后，蛋白质将吸附盐离子，而形成扩散双电层，导致蛋白质的溶解度增大，发生盐溶。4、 高浓度盐溶液中，蛋白质溶解度与离子强度的关系。由于盐的水化作用，其将争夺蛋白质水化层中的水分子，使蛋白质表面疏水区脱水而暴露，增大它们之间的疏水性作用。蛋白质溶解度与盐浓度的关系（1）cohn经验式 ： S蛋白质溶解度，mol/L；I离子强度（c:离子浓度；Z:离子化合价）含义：盐浓度为0时（纯水中溶解度），蛋白质溶解度的对数值。（与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关）Ks含义： Ks盐析常数（与蛋白质和无机盐

7、的种类有关，与温度、pH值无关）。盐析公式局限性：虽然Cohn公式能够描述盐析状态下蛋白质的溶解度，但它不能体现低盐浓度（盐溶状态）下蛋白质的溶解度。5、 盐析法分离蛋白质的两个步骤 分级，Ks分级Ks盐析法：在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法；Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。盐析法：在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析；盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。6、 有机溶剂沉淀的原理降低了溶质的介电常数（削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、核酸等带电粒子

8、之间的作用力，因相互吸引而聚合沉淀）；破坏水化膜（由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层，使蛋白质沉淀）。7、 常用于沉淀蛋白质的有机溶剂乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广。8、 等电点沉淀原理在低离子强度下，调节pH值至等电点，蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。第五章：萃取技术1、 概念理解萃取相：大部分溶质转移到萃取剂中，得到的溶液。

9、萃余相：被萃取出溶质后的料液。分配常数：一定T、P下，溶质在两个互不相溶的溶剂中分配，平衡时，溶质在两相中浓度之比为常数，该常数称为分配常数。活度：表示化学反应速度的物理量。分配系数：萃取过程中常用溶质在两相中的总浓度之比表示溶质的分配平衡，该比值称为分配系数。萃取因素：萃取分率：萃取相中溶质与总溶质的质量比：萃余分率：萃余相中溶质与总溶质的质量比：2、 pH与弱电解质在有机相和水相中的分配系数之间的关系，从中能得到哪些与弱电解质萃取操作相关的结论弱酸性溶质分配平衡：有机相中溶质浓度与水相中总溶质浓度及pH之间的关系：表观分配系数与溶剂和水相及pH之间的关系：例：用醋酸丁酯从pH为2.5的发酵

10、液中萃取苄基青霉素，在0，pH2.5时测得K=30，Kp=10-2.75。求两相中浓度相等时的pH值。解：根据公式得K0=30（1+102.5-2.75）=47当苄基青霉素在两相中浓度相等即K表=1时，pH4.4时，苄基青霉转移到丁酯相称为萃取；pH4.4时，苄基青霉素又从丁酯相转移到水相,称为反萃取。表观分配系数=1即苄基霉素在醋酸丁酯相与水相中的浓度相等，其pH=4.4。 弱碱性溶质分配平衡：对于弱碱性电解质，有机相中溶质浓度与水相中总溶质浓度及pH之间的关系。K0/(110pKpH )3、 多级错流与多级逆流萃取的计算（计算题）利用乙酸乙酯萃取发酵液中的放线菌素D，pH=3.5时，k=5

11、7，料液流速450L/h，萃取剂流量39L/h，计算采用三级错流萃取和三级逆流萃取的萃取因素E和理论收率各为多少？ 单级萃取的萃取因子：E = 57*39/450 = 4.94多级错流萃取：多级逆流萃取：某厂青霉素提取工艺采用两级逆流萃取。已知浓缩倍数为1.5，萃取时溶液的pH为2，假定各级萃取的效率为90，试求理论得率4、 超临界萃取原理利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。在超临界状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。（超临界流体萃取是利用超临界流体具有的类似气体的扩散

12、系数，以及类似液体的密度（溶解能力强）的特点，利用超临界流体为萃取剂进行的萃取单元操作）5、 超临界流体的特点介于液体与气体之间，溶解能力与液体接近，扩散系数接近于气体。密度随压力微小变化而显著变化，相应的溶解性质发生变化。分离物质多于一种时，可以逐步降压而使物质分步析出。第六章：膜分离过程1、 膜形态结构按孔径大小：微滤膜、超滤膜、反渗透膜、纳滤膜按膜结构：对称性膜、不对称膜、复合膜按材料分：合成有机聚合物膜、无机材料膜、金属膜2、 渗透与反渗透渗透：膜两侧压力相等，在浓差的作用下作为溶剂的水分子由浓度低的一侧向浓度高的一侧透过，这种现象称为渗透。反渗透：利用反渗透膜选择性只能通过溶剂（通常

13、是水）而截留离子物质的性质。以膜两侧静压差为推动力，克服渗透压，使溶剂通过反渗透膜实现对液体混合物进行分离的过程，操作压差一般为1.510.5MPa，截留组分为小分子物质。3、 微滤，超滤，纳滤以及反渗透四种膜分离过程的特点，应用（1）微滤（MF）：概念：以多孔细小薄膜为过滤介质，压力差为推动力，使不溶性物质得以分离的操作。特点：孔径分布范围在0.0510m之间；操作压力0.05-0.5MPa。应用：除去水/溶液中的细菌和其它微粒；除去组织液、抗菌素、血清、血浆蛋白质等多种溶液中的菌体；除去饮料、酒类、酱油、醋等食品中的悬浊物、微生物和异味杂质。（2）超滤（UF）：概念：以多孔细小薄膜为过滤介

14、质，但孔径更小，为0.0050.05m，分离推动力仍为压力差的膜分离过程。特点：适合于分离酶、蛋白质等生物大分子物质；截断分子量一般为6000到50万，操作压0.2-0.6MPa。 应用：蛋白、酶、DNA的浓缩；脱盐/纯化；清洗细胞、纯化病毒；除病毒、热源。（3）纳滤（NF）：概念：是一种介于反渗透和超滤之间的压力驱动膜分离过程。特点：纳滤膜的截留率大于95%的最小分子约为nm，故称之为纳滤膜。从结构上看纳滤膜大多是复合膜，即膜的表面分离层和它的支撑层的化学组成不同。其表面分离层由聚电解质构成。应用：小分子量的有机物质的分离；有机物与小分子无机物的分离；溶液中一价盐类与二价或多价盐类的分离；盐

15、与其对应酸的分离。（4）反渗透（RO）：原理：利用反渗透膜选择性只能通过溶剂（通常是水）而截留离子物质的性质。以膜两侧静压差为推动力，克服渗透压，使溶剂通过反渗透膜实现对液体混合物进行分离的过程。概念：当对水溶液施加一个大于其渗透压的外界压力时，水将通过反渗透膜流向膜的另一侧。特点：操作压差一般为1.510.5MPa，截留组分为小分子物质。应用：海水和苦咸水脱盐制饮用水；制备医药、化学工业中所需的超纯水；用于处理重金属废水；用于浓缩过程，不会破坏生物活性，不会改变风味、香味。第七章：吸附与离子交换1、 吸附类型及作用力物理吸附: 分子间引力（吸附剂和吸附物通过分子力（范德华力）产生吸附。分子被

16、吸附后一般动能降低,故吸附是放热过程。物理吸附是可逆的，没有严格的选择性。）化学吸附: 化学键合力(吸附剂和吸附物发生化学反应而进行吸附。反应放出大量的热量，选择性强，吸附后较稳定，不易解吸。)离子交换吸附:库仑力(利用离子交换树脂作为吸附剂，将溶液中的待分离组分，依据其电荷差异，依靠库仑力吸附在树脂上，然后利用合适的洗脱剂将吸附质从树脂上洗脱下来，从而达到分离的目的。离子交换反应是可逆的。)2、 离子交换树脂的结构离子交换树脂是一种不溶于酸、碱和有机溶剂的网状结构的高分子化合物，非常稳定。其由三部分构成：具有三维空间立体结构的网络骨架（R）；联接在骨架上的活性基团；活性基团所带的相反电荷的活

17、性离子（可交换离子）【网络骨架、功能基团、活性离子】3、 离子交换树脂的分类合成材料和方式：按树脂骨架的主要成分：聚苯乙烯型、聚丙烯酸型等；按聚合的化学反应：共聚型、缩聚型活性基团：阳离子交换树脂(cation exchange)（含酸性基团）；阴离子交换树脂(anion exchange)（含碱性基团）4、 离子交换树脂的选择a）强碱物质 选弱酸树脂 洗脱容易 弱碱物质 选强酸树脂，不能用弱酸树脂 弱酸树脂所成的盐易水解，吸附困难。中等碱性物质强/弱酸树脂都可以，根据交换容量选择。b）* 弱酸或弱碱树脂 选盐型树脂较好。 盐型树脂电离度大，H型和OH型解离度小。 * 强酸、强碱树脂 都可以，

18、但应考虑生化物质稳定性。第八章：色谱分离技术1、 色谱分离原理当流动相流过固定相时，由于物质在两相间的分配情况不同，（吸附-解吸-吸附-解吸），经过多次差别分配而达到分离，或者说，易分配于固定相的物质移动速度慢，易分配于流动相中的物质移动速度快，因而得到逐步分离。2、 色谱分离方法分类按溶质分子与固定相相互作用机理：吸附层析（范德华力，氢键，静电力，共价力）；分配层析（溶质在两相间分配系数不同）；凝胶过滤（分子大小与形状）根据固定相形状分类：柱层析：将基质填装在管中形成柱形，在柱中进行色谱分离；薄层层析：将基质在玻璃或塑料等光滑表面铺成一薄层，在薄层上进行色谱过程；纸层析：以滤纸作为基质。根据

19、流动相分类：气相色谱；液相色谱；超临界流体色谱根据色谱原理：吸附、亲和、离子交换、分配、凝胶过滤、疏水等3、 吸附色谱分离技术的原理根据物料中各组分对固定相(吸附剂) 的吸附程度不同，以及其在相应的流动相(溶剂)中溶解度的差异来实现。经反复的吸附解吸再吸附再解吸的过程，达到分离目的。无化学键引入，只存在相对较弱的氢键力、范德华力和偶极力相互作用。4、 凝胶过滤色谱原理凝胶色谱又称分子筛过滤、排阻层析等，依据是多孔的载体对不同体积和不同形状分子的排阻能力的不同，从而对混合物进行分离。凝胶是一种多孔网状结构的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致。大分子：物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程

20、短，移动速率快，先被洗出。小分子：物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱。5、 亲和层析原理利用生物体内存在的特异性相互作用的分子对而设计的层析方法。生物体内相互作用的分子对：（1）酶底物或抑制剂；（2）抗原抗体；（3）激素受体；（4）糖蛋白与凝集素；（5）生物素生物素结合蛋白等。6、 离子交换色谱中洗脱采用的方法与原理方法：改变洗脱液的pH；改变离子强度；当被分离物组分复杂用一种方法往往分离效果不理想时，可同时改变pH及离子强度。原理：利用物质的电荷和层析载体的电荷间的相互作用，进而达到分离纯化的目的。7、 软水和无盐水的制备软水的制备：利用钠

21、型磺酸树脂除去水中的钙离子和镁离子等碱金属后即可制得软水。无盐水的制备：将原水通过氢型强酸性阳离子交换树脂和羟型强碱或弱碱性阴离子交换树脂的组合，经过离子交换反应，将水中所有的阴、阳离子除去，从而制得纯度很高的无盐纯水。第九章：离心技术1、 离心力与相对离心力离心力：在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力，其大小等于离心加速度2r 与颗粒质量m的乘积。F=ma=m2r相对离心力（RCF） ：实际离心力转化为重力加速度的倍数。RCF=F离心力/F重力 =m2r/mg=2r/g 2、 RCF与转速和离心半径的关系（计算）已知某一离心机的转子半径为25cm，转速为1200rpm时

22、，相对离心力为多大。某发酵生产分离用的离心机转鼓直径为0.9m，转速为1800rpm，现用一台转鼓直径为0.15m的实验离心机模拟上述分离操作，其转速应取多大。3、 三种超离心方法（了解各自应用）（1）差速离心法：它利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同。通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。（2）速率区带离心法：物质大小差别较大，密度相近。是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。梯度液在取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。（3）等密度离

23、心法：密度差别较大，大小相近。样品铺在梯度液顶上或混合,离心开始后, 梯度液受离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度。最后粒子进入到p=m，此时dx/dt为零粒子不再移动，粒子形成纯组分的区带。第十章：结晶与干燥1、 结晶过程实质溶质分子凝聚成固体，分子有规律地排列在一定晶格中。结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相的过程。形成新相（固体）需要一定的表面自由能。因此，溶液浓度达到饱和溶解度时，晶体尚不能析出，只有当溶质浓度超过饱和溶解度后，才可能有晶体析出。实质上，在饱和溶液中，晶核是处于一种形成溶解再形成的动态平衡之中，只有达到一定的过饱和度以后，晶核才能够稳定存在。2、 物料中水

24、分的类型结合水:存在于细小毛细管中和细胞中的水分,结合力强,难除去 非结合水:润湿、粗大毛细管、物料孔隙中的水份, 结合力弱,易除去平衡水：物料中的水分与湿空气处于动态平衡状态时所含的一定量不可除去的水分 (平衡水分与物料性质空气状态有关) 自由水：包括全部非结合水和部分结合水， 干燥过程中可除去自由水,不能除去平衡水。3、 湿空气性质，湿度与相对湿度湿空气的性质：水蒸汽分压（大气是空气和水汽的混合物，称为湿空气，空气中水蒸气分压愈大，水分含量就愈高）湿度（是湿空气含水量的绝对值，不能用于分辨湿空气的吸湿能力）相对湿度（可以说明湿空气偏离饱和空气的程度，能用于判定该湿空气能否作为干燥介质，值与越小，则吸湿能力越大）湿度：它以湿空气中所含水蒸汽的质量与绝对干空气的质量之比表示。相对湿度：在一定温度及总压下，湿空气的水汽分压与同温度下水的饱和蒸汽压之比的百分数，称为相对湿度，用符号表示。7