动植物基因组denovo常见问题

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1、动植物基因组de novo常见问题基础知识1、什么是基因组de novo测序？答：对某一物种进行高通量测序，利用高性能计算平台和生物信息学方法 在不依赖于参考基因组的情况下进行组装，从而绘制该物种的全基因组序 列图谱。2、普通基因组的定义？答：单倍体，纯合二倍体或者杂合度0.5%，且重复序列含量50% , GC 含量为35%到65%之间的二倍体。3、复杂基因组的定义？答：杂合率0.5%，重复序列含量50% ,GC含量处于异常的围（GC 含量V 35%或者GC含量65% =的二倍体，多倍体。诺禾致源对二倍体复杂基因组进一步细分为微杂合基因组（0.5% V杂合率V 0.8%=、高杂合基因组（杂合率

2、0.8%）以及高重 复基因组（重复序列比例50%）。4、怎么查询基因组的大小？答：查询植物基因组大小的:data.kew.org/cvalues/CvalServlet?querytype=2查询动物基因组大小的：genomesize./search.php。5、基因组的项目周期?6、基因组承诺的组装指标?10答：简单基因组：contig N5020K , scaffold N50500K复杂基因组：contig N5020K , scaffold N50300K。样品要求1、动植物基因组测序对取样有什么要求？答：植物：需要黑暗无菌条件下培养的黄化苗、组培苗，基因组样本量500 gg1mg，越

3、多越好。选择纯合或杂合度尽可能小的样品（杂合度v 0.5% ）。动物：应选取肌肉、血液等含脂肪较少的部位取样，尽量选择同 一个体取样，以减少个体差异性对后续拼接的影响。基因组样本量 500 gg1mg越多越好。样本的性别决定模式是XY型，则尽量选择雌性个体（XX型），如果是ZW型，则尽量选择雄性个体（ZZ型）。2、全基因组测序对 DNA 样本有什么要求？答：（1）样品需求量（单次）：小片段文库，A3四；2Kb5Kb大片段文库，20四；10Kb20Kb大片段文库，60四；完成全基 因组测序样 品 DNA 量需求约为 500 gg1mg ;（2）样品浓度：对于小片段文库，50ng/此 对于2Kb5

4、Kb大片段文库， 150ng/对于10Kb20Kb大片段文库，150ng/出；（3）样品纯度：0D260/280=1.82.0;无蛋白质、RNA污染或肉眼可见杂质污染；（4）样品质量：基因组完整。如需建立 5Kb 的插入片段文库，则电泳结果，基因组DNA主带23Kb ;脉冲场电泳结果，基因组DNA主 带 40Kb 。文库构建1 、 基因组测序的文库构建及测序策略？ 答：简单基因组： 180bp、 500bp、 2K、 5K、 10K; PE100 测序； 测序深 度一般为 100-150X ;复杂基因组：180bp、300bp、500bp、2K、5K、10K、20K;PE100 测序；测序深度

5、一般为 200-300X。2、 DNA Fragment 文库的定义、用途及实验流程？答：(1)定义：将基因组或大片段DNA随机打断成v 800bp的小片段(主要 为 200bp、 300bp、 500bp 等)，加上特定接头做成 DNA 文库后直接对 DNA片段进行单末端(Single-End )或者双末端(Paired-End )测序，不需要克隆到细菌中，可以获得大量的DNA序列信息。(2) 用途：DNA Fragment文库制备的整个过程只需2天，单末 端测序长度可达100bp，双末端为200bp。该技术测序通量高，可在全基因 组水平上最大限度的、完整的获取基因组及多态性信息。广泛地应用

6、于基因组的 de novo 测序、基因组重测序、 BAC 测序和 长片段 PCR 产物测序等。(3) 实验流程：基因组DNA随机打断1DNA 片段的末端修复4将加入到DNA片段的3 实端在 DNA 片段的末端加上特定接头4PCR扩增连上接头的DNA片段I文崖检测DNA在cRt的成筱扩增1上机测序J| 生物信息分析3、DNA mate-pair文库的定义、用途及实验流程？答：(1)定义：首先将基因组DNA随机打断到特定大小(2-20kb );然后经末 端修复，生物素标记和环化等实验步骤后，再把环化后的DNA分子打断成 400-600bp的片段并通过带有链亲和霉素的磁珠将带有生物素标记的片段 捕获

7、。这些捕获的片段再经末端修饰和加上特定接头后建成大片段文库，不 需要克隆到细菌中，直接在Illumina测序仪上进行测序。通过大片段文库构 建，从而获得基因组中较大跨 度(2-20kb )片段两端的序列。(2) 用途：DNA Mate-pair文库制备的整个过程需要5天，这种从较大跨度两端所获得的序列对基因组de novo项目的组装和 基因组结构变异发掘具有非常重要的作用。(3) 实验流程：基因组DNA精机打断特定大小片段X末端貌夏1生物点标记荻得来自片段两湍3缶0网p的DKA片段修济、加搔头LFCK扩瘫上接头的DNA片段i文庠觑DNA在岛上的成簇扩堵i上机刻 J?1生物信舄分析信息分析1、什

8、么是 Read、Contig、Scaffold ?答：Read :测序读到的碱基序列片段，测序的最小单位；Contig :由 reads通过对overlap区域拼接组装成的没有gap的序列段；Scaffold :通过 pair ends 信息确定出的 contig 排列，中间有 gap。2、 什么是 N50 , N70 , N90 ?答：把组装出的contigs或scaffolds从大到小排列，当其累计长度 刚刚超过全部组装序列总长度50%时，最后一个contig或scaffold的大小即为N50的大小，N50对评价基因测序的完整性有重要意义；N70和N90的计算方法与N50类似，只是百分数变

9、为70%或90%3、普通基因组的解决方案？答：诺禾采用白主升级的SOAPdenovoll进行普通基因组组装。组装流程(图1)包括：(1) 构建不同长度的插入片段文库(2)构建 de Brujin 图；化简de Brujin图；(4) 构建 contigs ;(5) 构建 scaffolds ;(6) 补 gaps ;诺禾致源的技术升级包括：(1) 开发了新的序列纠错模块，降低测序错误对组装的影响；(2) 在contigs组装步骤，开发了 Step K连接模块，以混合 拼接算法连接contigs，从而提升原始的contigs长度；(3)在 scaffolds 组装步骤，开发了 ctg dista

10、nce evaluation模块，更精确地评估contigs间的距离；同时开发了 scafconstruction模块，以新的连接单位来组装scaffold ,从而提升scaffolds的连接准确率及长度图1基因组de novo测序及拼接组装流程经过以上几步，最终简单基因组的组装结果至少应达到contigN5020K , scaffold N50300K。4、复杂基因组（二倍体杂合）的解决方案？答：针对复杂基因组中二倍体杂 合基因组，诺禾致源开发了 NOVOheter软件，成功实现了二倍体杂合基因 组组装。与SOAPdenovo相比，NOVOheter软件组装二倍体杂合基因组 的技 术创新主要

11、体现在以下几个方面：(1) 通过高深度测序(200-300X )将基因组上的杂合和纯合区域 分开；(2) 利用 reads 信息和 PE 关系连接杂合位点，延长原始 contigs : 在杂合 部分间距离较短的情况下，利用 reads 信息将杂合位点连接起 来，若杂合部 分间距离较长时，利用 Pair-End 关系连接杂合位点(所 以需要加入更多类型 的小片段文库，以连接不同距离的杂合位点)， 从而提高了 contigs 的长度 为后续组装打下基础(图 3);图 3 基于 NOVOheter 软件构建 contigsa：利用深度信息区分杂合部分（覆盖度为n）和纯合部分（覆盖度为 2n）;b :

12、若杂合部分的距离较短（如 60bp ），则可利用 reads 信息将杂 合位点连接起来；c： 若杂合部分的距离较长（如 400bp ），则利用 Pair-End 关系， 将杂合位 点连接起来；d :得到杂合 contigs 。注：图中不同颜色的点表示杂合位点。分区域构建scaffolds同样利用contigs深度信息区分纯合contigs和杂 合 contigs ;利用 Pair-End 关系将纯合 contigs ,杂合 contigs 分别组装成 scaffolds ;最后将相邻的纯合 contigs 和杂合 contigs 进行连接，构建更长的 scaffolds。5、如何评价组装结果？

13、 答：常染色体区的覆盖度：评价基因组常染色体区的覆盖度，可以用BAC或者是Fosmid序列来评估；把已公布或者客户提供的BAC或fosmid克隆序列作为Refrence,将拼接完成的基因组序列map回 已知的 BAC或者fosmid序列上，检查拼接的序列对已知序列的覆 盖度到什么水平。基因区的覆盖度：评价基因区的覆盖度,可以用 EST 序列或者 是转 录组序列来评估；把已公布或者客户提供的EST 或转录组序列作为query序列map到拼接完成的基因组序列上，检查拼接序列对已知序 列的覆盖度是达到什么水平。6、影响基因组组装的因素？ 答：基因组的重复序列和杂合度，是否污染以及基因组的倍性情况。7、基因组项目的标准生物信息分析的容？ 答：基因组项目的标准生物信息分析的容如下：(1) 数据处理；(2) 基因组组装：基因组评估：基因组大小、GC含量、复杂序列、杂合度评;组装：数据纠错；Contig、Scaffold组装；Gap填充；组装 质量分析、评估和结果统计;(3) 基因组注释：重复序列注释；基因预测；基因组功能注释；非 编码 RNA 注释；(4) 比较基因组学分析：基因家族鉴定；基因组共线性分析；全基因组复制分析(动物： WGAC ;植物： WGD); 正选择基因的鉴定及功能分析；基因家族的扩增收缩分析； 系统发育分析；物种分化时间估。