核酸外切酶辅助的信号放大策略在生化分析中的应用进展

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1、核酸外切酶辅助的信号放大策略在生化分析中的应用进展文立;徐凤州;何晓晓;王柯敏;何定庚;卿太平;邹振【摘要】 As an important member of tool enzymes, exonuclease is a kind of hydrolytic enzymes without strict base sequence dependent. In recent years, by taking advantage of different hydrolysis ways of exonuclease and nanotechnology, cycle effect of enzy

2、me digestion, aptamer, non Watson- Crick base pairing system by metal ions, fluorescent nucleic acid probes, electrochemical methods etc. , a series of exonuclease-assisted signal amplification strategies have been developed, which played a very key role in improving the sensitivity of detection met

3、hods. Therefore, exonuclease has been widely used in high sensitive detection of nucleic acids, proteins, ions, small molecules and so on. To understand it better and apply it well in the future, the application progress of exonuclease-assisted signal amplification strategies in biochemical analysis

4、 has been summarized in this review.%作为工具酶重要成员之一的核酸外切酶是一类无严格碱基序列依赖 性的水解酶。近年来，通过利用核酸外切酶水解方式的差异性与纳米技术、酶切循 环效应、核酸适配体技术、金属离子稳定的非沃森-克里克碱基配对系统、核酸荧 光染料探针技术、电化学方法等相结合，发展了一系列核酸外切酶辅助的信号放大 技术，对于提高生化分析检测方法与技术的灵敏度起到了非常关键的作用，已广泛 应用于核酸、蛋白质、离子和小分子等物质的高灵敏检测。为了更好地理解和应用 核酸外切酶辅助的信号放大策略，本文对核酸外切酶发展的信号放大策略在生化分 析中的应用进展进行了综

5、述。【期刊名称】分析化学 【年倦),期】2015(000)011【总页数】9页(P1620-1628)【关键词】分析检测工具酶信号放大核酸外切酶评述【作者】文立;徐凤州何晓晓;王柯敏何定庚卿太平邹振【作者单位】化学生物传感与计量学国家重点实验室，湖南大学生物学院，湖南大 学化学化工学院，生物纳米与分子工程湖南省重点实验室，410082长沙化学生 物传感与计量学国家重点实验室，湖南大学生物学院，湖南大学化学化工学院，生 物纳米与分子工程湖南省重点实验室，410082长沙;化学生物传感与计量学国家 重点实验室，湖南大学生物学院，湖南大学化学化工学院，生物纳米与分子工程湖 南省重点实验室，41008

6、2长沙;化学生物传感与计量学国家重点实验室，湖南大 学生物学院，湖南大学化学化工学院，生物纳米与分子工程湖南省重点实验室， 410082长沙;化学生物传感与计量学国家重点实验室，湖南大学生物学院，湖南 大学化学化工学院，生物纳米与分子工程湖南省重点实验室，410082长沙;化学 生物传感与计量学国家重点实验室，湖南大学生物学院，湖南大学化学化工学院， 生物纳米与分子工程湖南省重点实验室，410082长沙化学生物传感与计量学国 家重点实验室，湖南大学生物学院，湖南大学化学化工学院，生物纳米与分子工程 湖南省重点实验室，410082长沙【正文语种】中文快速、准确、灵敏地检测生化样品中的离子、分子、

7、核酸、蛋白等对疾病的预防诊 断、环境监测、食品监控等具有十分重要的意义。通常，实际生化分析样品中仅存 在痕量靶物质，因此高灵敏度和高准确性一直是分析检测方法的改进目标。针对这 一需求，除了直接发展高灵敏的方法外，放大检测法能降低分析方法或传感器的设 计难度以及对专业大型仪器的依赖。根据放大的对象，放大检测法可以简单分为三 类:靶标放大策略、探针放大策略和信号放大策略1。靶标放大策略通常是通过 定的手段特异性复制靶标，使其达到常规方法可以检测的水平。如经典的靶标放 大策略聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction , PCR)可以实现108 109倍的靶标放大2 ;探针放

8、大策略，靶标的量不变，探针序列被不断放大，如 滚环放大技术(Rolling circle amplification , RCA)，它可以实现 103 104 倍左 右的信号增强3。相对于靶标放大策略和探针放大策略，信号放大策略有更多的可选性，如近年来发 展的通过杂交链式反应、工具酶、酶联催化反应、纳米材料等生物及化学方法放大 分析与传感器界面的响应信号，可特异性地提高检测信号，降低背景及噪音信号， 对于提高生化分析检测方法与技术的灵敏度起到了非常关键的作用49。在 这些信号放大策略中，基于工具酶(如聚合酶、连接酶、限制性内切酶、切割内切 酶、核酸外切酶、核糖核酸酶等)辅助的信号放大技术，由于

9、具有操作简便、灵敏 度和特异性高、反应条件温和、反应时间相对较短等优点，近年来在生化分析方面 的得到了迅速发展。尤其是利用核酸酶水解方式的差异性与纳米技术、酶切循环效 应、核酸适配体技术、金属离子稳定的非沃森-克里克碱基配对系统、核酸荧光染 料探针技术、电化学方法等相结合发展的一系列核酸酶辅助的信号放大技术，已广 泛应用于核酸、蛋白质、离子和小分子等物质的检测10-14。基于核酸酶辅 助的信号放大策略主要有两大类，一是序列依赖性的限制性内切酶或切割内切酶辅 助的信号放大策略，另一类是无序列依赖性的核酸外切辅助的信号放大策略。从核SSE 朝梃蟠K-堀四 邮(ox U)SBS意朝梃 p 0X0 Y

10、 oxmssifiiHsiissE、sisl HhBfBA oxanAss念朝梃些 i。邑 i 圈s意朝梃定鉴-KS、旺姓M职聪。SEg(d s N 、d 芝 NP ZQ 、rns、(s$_=u。邑圈s念险晅圈s意朝梃SMSSSgi-CN。瑜 ,ttsn啪Ksslgii*、islfi?ssiis 晅ttK权长*症旺回gLmH旧咀旧B、唳座晅号服回何蚣辰巨、S水担旺 HSKSSSfiHo, m)-Lnf mNasp 曰 s$pnuoxLU(=ouLlj)曰ss念朝梃(pu d 泉)m JLn(pu HO，m)-LnJrn-opq pucusCDss-unuoxCD U&EM0 SPU& 一区*

11、s I 一q 仪也埋彩MHSS念朝梃m卅隹 If I*。朝加梃abLns&s、皿、-LnJrnss、Na 。旧 底IH巨Iws、旺回&钦旧蚣旱iHttH媪展权长、留旺回巨wteBH7R。旺 SS5 ZQ S 凶K同、US平齐末端或凹陷末端)3J5(3-OH Flush or concave end at the end)入核酸外切 酶入 Exonuclease dsDNA 53(5-P end)2-12 bp 的寡核苷酸片段 2-12 bp Oligonucleotide fragments 5-单核苷酸+单链寡核苷酸片段5- Mononucleotide + single oligonucl

12、eotide fragments 5-单核苷酸+单链寡核 苷酸片段 5-Mononucleotide + single oligonucleotide fragments T7 核酸外 切酶 T7 Exonuclease dsDNA 53(5-OH end or 5-P end)5-单核苷酸+单链 寡核苷酸片段 5-Mononucleotide + single oligonucleotide fragments 3核酸外切酶辅助的信号放大策略在生化分析中的应用3.1核酸检测核酸是组成生命体的最主要生物大分子之一，是细胞内携带遗传信息的物质，它控 制着蛋白质的合成和有机体细胞的机能，在生物的生

13、长、发育、繁殖、遗传和变异 等生命活动中占有极其重要的地位1618。核酸序列中如果出现一个或几个 核苷酸的取代、缺失或插入等微小的改变，都将引起基因突变或多态性，导致遗传 病或其他疾病的出现19,20。因此，对人体的血液、组织及体液等样品中特 定基因序列和与遗传疾病相关的单碱基突变的检测分析，在分子生物学、疾病早期 诊断与治疗、发病机理研究以及药物筛选等方面都具有重大意义2125。最早的核酸检测方法是基于核酸杂交原理的分析方法，主要包括有Southern印迹 杂交、Northern印迹杂交和原位杂交等26-28。然而当靶标序列浓度很低 时，这种直接杂交技术的检测效果比较差，灵敏度低，大大限制了

14、其广泛应用。随 着生物技术的不断发展，一些新型的放大检测技术不断涌现。如体外扩增技术29-31、酶联催化反应32,33、脱氧核酶催化34,35、核酸酶辅 助等36-39。其中，核酸外切酶辅助的靶标循环技术应用尤为广泛40 - 44。2010年，Zuo等41使用分子信标作为信号探针，发展了一种核酸外切酶B辅 助的靶标循环信号放大技术用于DNA的高灵敏检测。实验原理如图2所示，在分 子信标的5端标记荧光团，与5端平齐的3端中间位置标记淬灭基团（分子信标3 端有7个碱基的突出序列用于抵抗核酸外切酶B的水解），形成发夹后，荧光基团 和淬灭基团距离非常近，从而使荧光基团的荧光被淬灭。当目标DNA存在时，

15、分 子信标被打开形成能被核酸外切酶B水解的3平末端，核酸外切酶山沿双链的 35方向逐步切除单核苷酸，并释放出荧光基团。而同时释放的目标DNA能与 另一个分子信标杂交，引起酶切循环信号放大，这种方法对DNA的检出限达到 20 amol/L。相比昂贵的核酸探针标记，免标记的方法更简便、廉价。基于类似的原理，Xu等42 利用入核酸外切酶辅助的信号放大作用设计了一种超灵敏的电化学传感器。 通过铁氰根离子在靶标存在与否情况下与电极的远近，表现出不同的电化学阻抗来 特异性检测乳腺癌基因BRCA1。此外，Kong等43将核酸外切酶辅助的靶标 循环与金纳米颗粒联用，实现双重放大免标记检测DNA，该方法检出限可

16、以达到 0.6 pmol/L。除了对样品中DNA的检测外，RNA尤其是microRNA（miRNA）（被视为一种新型 的肿瘤标志物）的检测也非常重要。Wang等44利用电化学方法，结合T7核 酸外切酶的循环放大作用，设计了一种超灵敏检测miRNA的方法。其原理如图3 所示:首先将能与miRNA互补的DNA探针的3端修饰于金电极表面，此时由于 表面覆盖有大量DNA使得阻抗信号较大。当加入miRNA之后，miRNA与 DNA探针形成双链，在T7核酸外切酶的作用下，修饰在金电极上的DNA探针 从5端开始被水解，同时释放出的靶标miRNA能与下一个捕获探针杂交，实现 循环放大。最后，金电极表面的DNA

17、探针被剪切掉，导致电化学阻抗信号降低， 进而实现miRNA的高灵敏检测。此外，核酸序列中如果出现一个或几个核苷酸的改变，都将引起基因突变，导致遗 传或其它疾病的出现。其中单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms , SNPs)占所有多态性的90%以上，是频率最高、信息含量最多的一种变异，也是 最多见的遗传变异类型45,46，如镰刀形红细胞贫血、B-地中海贫血、囊性 纤维化病以及肿瘤等47,48。由于单核苷酸多态性通常只是核酸序列中一个 核苷酸改变，类似非靶标核酸的存在，因此针对核酸检测的一些方法也被用于与遗 传疾病相关度较高的单碱基突变的检测分析。2014

18、年，Wu等49 利用分别标 有荧光基团和淬灭基团分子探针来特异性检测单核苷酸多态性。最近，Wu等50 为了避免分子探针双标效率低，费用昂贵等缺点，结合金颗粒和核酸外切酶B设计了一种比色方法，用于区分单碱基错配。图1 5种主要核酸外切酶的基本特性简图(A核酸外切酶I(Exo I);B核酸外切酶 W(Exo;C核酸外切酶m(Exo m);D入核酸外切酶(入exo);E T7核酸外切酶(T7 exo)Fig.1 Basic characteristics diagram of severalexonucleases.A.exonuclease I (Exo I);B.exonuclease VD(E

19、xoVD);C.exonuclease in (Exo B);D.入 exonuclease (入 Exo);E.T7 exonuclease (T7 Exo)图2基于核酸外切酶n辅助的信号循环放大方法检测DNA的原理图41 Fig.2 Schematic illustration of Exo in-assisted signal amplification system for DNA detection 41 3.2蛋白质检测蛋白质是基因表达的最终产物，是细胞内各类代谢和调控等生命功能的执行者，也 是致病因子、药物对机体作用的最重要的靶标分子。人类的绝大多数疾病都是由蛋 白质表达异常引起

20、的，蛋白的表达指示了细胞的生理和病理状态，揭示了药物及环 境因素对生命体的影响。因此，系统性的蛋白质研究和分析对理解生命现象、监测 疾病进程和药物作用等方面都具有非常重要的意义51,52。基于传统的免疫分析是常规的蛋白质检测方法，通常在抗原或抗体上标记放射性物 质、酶或荧光素等，然后利用抗原-抗体间的特异性反应来实现对蛋白质的灵敏特 异性检测53-59 。虽然免疫分析可以对蛋白质实现高灵敏度检测，但以上技 术实验过程复杂，操作繁琐，效率低，不适合系统化、大规模的蛋白质组学研究， 且功能化修饰可能影响抗原抗体间的亲和力。因此，发展一些简单、快速、灵敏的 蛋白质分析新方法显得尤为重要。近年来，基于

21、蛋白与核酸的作用以及核酸与工具酶的作用，发展了一系列新型的蛋 白质分析方法6064。这些方法不仅避免了传统蛋白质检测方法中操作复杂， 常需对蛋白质进行标记，不易保持其生物活性等缺点，还有效地提高了蛋白质检测 的效率与灵敏度。2010年，Ou等60基于TATA结合蛋白(TBP)与含有TATA 序列的DNA的特异结合能有效抵抗核酸外切酶的作用，设计了一种核酸外切酶B 辅助的信号放大比色检测蛋白质的新方法。如图4所示，首先在不同的金纳米颗 粒上分别修饰上能互补的单链DNA，当两种金纳米颗粒按一定比例混合后，互补 DNA之间的碱基作用力使得金纳米颗粒相互靠近，从而产生金纳米颗粒团聚效应， 肉眼看到金纳

22、米颗粒溶液由酒红色变成暗紫色。然后，加入核酸外切酶B,当 TBP存在时，因TBP与含有TATA序列DNA特异性结合，能对DNA 3端有保 护作用(空间位阻效应)，使得核酸外切酶B不能切割DNA链，从而金颗粒溶液一 直呈暗紫色;当TBP不存在时，DNA链失去蛋白的保护作用，核酸外切酶B从 DNA 3端切割，使得金颗粒彼此远离，溶液呈酒红色，从而实现对DNA特异结 合蛋白TBP的比色检测。图3基于T7核酸外切酶辅助的信号循环放大方法检测miRNA的原理图44 Fig.3 Schematic illustration of T7 exo-assisted signal amplification s

23、ystem for miRNA detection 44 图4基于核酸外切酶B辅助的信号循环放大方法和金颗粒检测DNA特异结合蛋白 的原理图60 Fig.4 Schematic illustration of Exo B-assisted signal amplification system and gold nanoparticles for sequencespecific DNA- binding protein detection 60 随着更多的靶标蛋白的核酸适配体成功筛选，基于适配体作为识别元件的核酸外切 酶辅助信号放大的蛋白质检测也备受关注。Chen等61发明了一种基于核酸适

24、配体和核酸外切酶B辅助下循环放大的平台用于检测溶菌酶。实验原理如图5所 示，设计一个发夹结构DNA , DNA链的一部分为溶菌酶的核酸适配体。当有溶 菌酶存在的情况下，探针发生空间构象变化使得非核酸适配体部分暴露出，然后加 入标记了荧光基团的信号探针，该探针与非核酸适配体部分互补配对，形成平齐末 端的DNA双链，在核酸外切酶B的作用下，信号探针被剪切，释放出荧光基团， 被打开的发夹探针可以循环利用，释放出大量荧光基团，由于荧光分子无法被吸附 到氧化石墨烯表面，从而呈现出强的荧光信号。当不存在溶菌酶时，发夹结构无法 打开，信号探针无法与其互补结合，核酸外切酶B也无法切割，荧光基团一直被标 记在信

25、号探针上，信号探针与氧化石墨烯结合，荧光基团被氧化石墨烯淬灭，呈现 很低的荧光信号。基于类似的原理，凝血酶与其对应的核酸适配体结合后构型会发生变化，Wang 等62 设计了一种检测凝血酶的方法，该方法特异性好，灵敏度高，可达到对 几个蛋白分子的准确定量。此外，利用一些核酸外切酶对底物的偏好性(如磷酸化、 甲基化等)，发展了一些磷酸激酶、磷酸化酶、甲基转移酶等的检测新方法。Liu 等63利用入核酸外切酶对底物5磷酸化的要求，结合氧化石墨烯平台设计了 种快速检测T4多核苷酸激酶活性的方法。3.3生物小分子检测除了核酸、蛋白质等生物大分子外，一些生物活性小分子在机体的新陈代谢及生命 过程中也起着重要

26、作用，与人类的健康息息相关。如三磷酸腺苷(ATP)发生水解时， 能产生大量供给人体的日常所需的生命活动的能量;还原型的谷胱甘肽(GSH)可以 通过与过多的自由基或者对身体有害处的重金属等物质结合，以达到中和有毒物质 的作用，并能够将之排出体外，所以GSH是人体内部特别的抗氧化剂跟自由基清 除剂。以GSH、ATP等为代表的细胞内小分子活性物质的检测对研究机体的生理 功能和疾病早期诊断具有重要意义。目前，用于生物活性分子的分析检测手段主要 有荧光、比色、电化学以及同位素标记等。其中，利用荧光方法分析小分子具有灵 敏度高、分析快捷、样品制备简单等优点而被广泛关注。随着配体指数富集系统进 化技术(SE

27、LEX)的发展，一些小分子的核酸适配体(Aptamer)被发现，利用其适配 体与小分子的特异性结合，已发展了许多新的小分子荧光分析新方法6567。 工具酶对作用底物的结构有较强的依赖性，而这些小分子与核酸适配体的结合又能 诱导核酸适配体构型的变化，因而，一些工具酶也被广泛用于小分子的放大检测6871。如图6所示，Xu等68设计了一种基于核酸外切酶B催化的目标物循环放大方 法免标记检测ATP。利用ATP的核酸适配体构建了一个发夹探针，且使得茎部3 端突出，以避免被核酸外切酶B降解。当有ATP存在时，ATP与发夹探针中的核 酸适配体序列结合，使得核酸适配体的构型发生变化，导致茎部3端凹陷，加入 核

28、酸外切酶B后即可从3端开始剪切双链部分，最终形成单链DNA，并释放出 ATP，而ATP即可继续循环利用，实现循环放大，双链特异性染料无法嵌入循环 产生的单链DNA，因此没有荧光信号。而没有目标ATP存在时，发夹探针的茎部 双链部分能嵌入SYBR Green I呈现出非常高的荧光信号。Zheng等69 利用核酸适配体与靶标结合产生的空间位阻作用达到抗酶切的效 果，设计了一种基于核酸外切酶I辅助的分析检测平台，可用于离子、小分子物质 及蛋白的检测。图5基于氧化石墨烯和核酸外切酶B辅助的信号循环放大方法检测溶菌酶的原理 图61Fig.5 Schematic illustration of GO an

29、d Exo B-assisted signal amplification system for lysozyme detection 61 3.4离子检测图6基于核酸外切酶B辅助的目标物循环放大方法检测ATP的原理图68 Fig.6 Schematic illustration of Exo IE-assisted target amplification system for ATP detection68重金属离子Hg2+和Ag2 +由于其性质相对比较稳定，在环境中很难被生物降解， 且生物毒性高，因此，重金属污染严重危害环境及生物的生存。由于重金属污染以 及重金属随着食物链的富集作用，使

30、得重金属离子广泛存在于水、土壤和食物当中， 然而重金属的摄入会直接损害人体健康，过量甚至会危及生命72,73，因此 针对重金属离子的监测显得极为重要。传统的检测方法是基于专业仪器的原子吸收 光谱、原子发射光谱以及电感耦合等离子体质谱法等，这些方法存在操作复杂、费 时费力、成本高等缺点。近些年，一些基于小分子发色团、纳米材料、核酶以及聚 合物材料的重金属离子传感检测方法被不断发展7476。同时，基于DNA 的特殊碱基或位点能特异性地与某些金属离子结合，形成非自然碱基对（即金属离 子稳定的非沃森-克里克碱基配对系统，如“T-Hg2 + -T”、C-Ag + -C”），许多 针对相应离子的传感器被发

31、展出来7779。正是由于这些离子与核酸的结合， 许多工具酶，特别是核酸外切酶也被引入相应离子的放大检测体系80,81。如Chen等80发明了一种基于核酸外切酶B辅助的信号放大方法可视化检测 Hg2+的一次性条带生物传感器，其原理如图7所示，发夹DNA和辅助DNA中 间部分可互补配对，其中发夹DNA的3端和辅助DNA的5均为富T序列，没 有Hg2+存在时，二者无法杂交以打开发夹DNA;只有当Hg2+存在时，通过T- Hg2 + -T非自然配对使得形成具有平齐末端的双链DNA，进而被核酸外切酶B识 别并从3端开始剪切，释放出的辅助DNA和Hg2+继续循环利用，产生大量 ssDNA。在B部分中，结合

32、部分(Conjugate pad)含有大量修饰了 DNA的金颗粒 (AuNPs-DNA probe1)，检测条带区域(TZ)处含有修饰了链霉亲和素和生物素的 DNA(SA-biotin-DNA probe2)，对照条带区域(CZ)处含有修饰了链霉亲和素和生 物素的另一条 DNA(SA-biotin-DNA probe3)。其中 AuNPs-DNA probe1 与 SA-biotin-DNA probe3是互补的，只要条带部分完好，金颗粒被富集于CZ条 带处显色，该条带可以检验条带传感器是否完好。当检测体系中有Hg2+存在时， 产生的 ssDNA 可以与 AuNPs-DNA probe1 和

33、SA-biotin-DNA probe2 杂交， 从而使金颗粒富集于TZ条带处显色;而当没有Hg2+存在时，无法产生ssDNA， 因此TZ条带处不能显色。该方法方便快捷，可直接肉目艮观察到结果，且灵敏度高， 检出限可达1 pmol/L。类似T-Hg2 + -T非自然碱基配对，基于C-Ag + -C交攵应和 核酸外切酶B辅助放大，Xu等79设计了一种的循环放大方法检测Ag+,其 检出限可达0.03 nmol/L。图7基于核酸外切酶B辅助的信号放大方法检测Hg2+的原理图80 Fig.7 Schematic illustration of Exo B-assisted signal amplifi

34、cation system for Hg2+ detection 80 4展望核酸外切酶在生化分析领域的应用发展极其快速而且应用方式变化层出不穷。纵观 核酸外切酶在生化分析中的应用情况，其在生化分析中的应用发展未来将有可能呈 现出以下趋势，包括：(1)多元化信号获取方式。可以通过改进仪器达到高灵敏的检 测(如荧光信号、电化学信号等)，也可通过肉眼直接观察的比色方法以及试纸条显 色等方法得出结果，未来可能有更多、更灵敏的信号输出方式；(2)酶切循环放大和 功能化纳米材料信号放大相结合实现多重放大。例如酶和金属纳米颗粒结合应用， 先通过酶切实现信号放大，然后通过结合金属纳米颗粒二级放大实现更灵敏的

35、检 测;(3)向生化传感的实用性方向发展。利用核酸外切酶来实现信号放大的传感器通 常都比较轻巧，不需要配备严格的实验条件和贵重的仪器，可用于发展便携的传感 器或检测试纸条等，因此这类传感器有望实现即时检测(POCT)和临床应用;(4)复杂 生物样品的检测。基于核酸外切酶的放大检测方法，目前还主要应用于体外缓冲液 样品的检测，随着更多的离子、分子、细胞等与核酸结合的发现，核酸外切酶也将 用于更多样性的分析物的检测，其难点和挑战是在更为复杂的生物样品(如体液、 细胞等)中实现目标物的检测。我们相信，随着对核酸外切酶性质和应用的进一步 探索，核酸外切酶在生化分析领域将会有更加广阔的应用前景。Refe

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