环境微生物检测PPT课件

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1、第第11章章 环境微生物检测环境微生物检测11.1 空气中微生物的检测与控制空气中微生物的检测与控制11.1.1 空气中微生物的检测方法空气中微生物的检测方法 (1)撞击法撞击法 撞击法是采用撞击式空气微生物采撞击法是采用撞击式空气微生物采样器，通过抽气动力作用，使空气通过狭样器，通过抽气动力作用，使空气通过狭缝或小孔而产生高速气流，使悬浮在空气缝或小孔而产生高速气流，使悬浮在空气中的带菌轮子撞击到转动的营养琼脂培养中的带菌轮子撞击到转动的营养琼脂培养基平皿上。经基平皿上。经37、48h培养，计算出每培养，计算出每立方米空气中所含的细菌菌落数。立方米空气中所含的细菌菌落数。(2)自然沉降法自然

2、沉降法 自然沉降法是靠重力的作用将空气中自然沉降法是靠重力的作用将空气中携带微生物的悬浮颗粒沉陷到直径携带微生物的悬浮颗粒沉陷到直径9cm的的营养琼脂培养基平皿上，经营养琼脂培养基平皿上，经37，48h培养培养后计生长的细菌菌落数。后计生长的细菌菌落数。由于沉降法是被动采样，会造成很大的误差。由于沉降法是被动采样，会造成很大的误差。通过前苏联奥梅梁斯基公式换算出。通过前苏联奥梅梁斯基公式换算出。通常设置通常设置5个采样点，即室内墙角对角个采样点，即室内墙角对角线交点为线交点为1个采样点，该交点与四墙角连续个采样点，该交点与四墙角连续的中点为另外的中点为另外4个采样点。采样高度为。个采样点。采样

3、高度为。采样点心远离墙壁采样点心远离墙壁1m以上，并避开空调、以上，并避开空调、门窗等空气流通处。检测点数越多越准确，门窗等空气流通处。检测点数越多越准确，以以2030个测点数为宜，最少测点数为个测点数为宜，最少测点数为56。(3)过滤法过滤法 过滤法是在负压下抽滤空气，使空气过滤法是在负压下抽滤空气，使空气通过经灭菌的微孔滤膜，空气中细菌被截通过经灭菌的微孔滤膜，空气中细菌被截留在膜上，然后将膜转移到培养基上，使留在膜上，然后将膜转移到培养基上，使滤膜与培养基完全贴紧，倒置于滤膜与培养基完全贴紧，倒置于37恒温恒温箱培养箱培养24h。通过计平板上的菌落数，测定。通过计平板上的菌落数，测定空气

4、中细菌的数量。空气中细菌的数量。空气中微生物总数目前用空气中微生物总数目前用CFUm3，计量。即计量。即每立方米空气落下的细菌数每立方米空气落下的细菌数，一，一般以室内空气中细菌总数般以室内空气中细菌总数5001000 CFUm3以作为空气污染指标。以作为空气污染指标。11.1.2 空气微生物污染的控制空气微生物污染的控制 控制空气微生物污染，控制空气微生物污染，必须减少空气必须减少空气中微生物的来源中微生物的来源，特别是微生物污染严重，特别是微生物污染严重的医院，肉类加工等行业废水废物的处理的医院，肉类加工等行业废水废物的处理消毒工作；搞好室内外环境卫生。减少微消毒工作；搞好室内外环境卫生。

5、减少微生物滋生；绿化造林也是净化市气、除尘、生物滋生；绿化造林也是净化市气、除尘、杀菌和吸收有害气体的重要途径；另外空杀菌和吸收有害气体的重要途径；另外空气消毒和空气净化器对净化空气也起一定气消毒和空气净化器对净化空气也起一定的作用。的作用。日本建议的评价空气清洁程度的标淮见表11.2 水的微生物检测及控制水的微生物检测及控制11.2.1 水质的细菌学检测水质的细菌学检测 我国生活饮用水卫生标准我国生活饮用水卫生标准GB5749-85关于关于饮用水中的细菌标准与大肠菌群数量标准为饮用水中的细菌标准与大肠菌群数量标准为一、伤寒杆菌一、伤寒杆菌l病症：病症：伤寒或副伤寒。伤寒或副伤寒。l表现：表现

6、：持续发烧，牵涉持续发烧，牵涉到淋巴组织，脾脏肿大，到淋巴组织，脾脏肿大，躯干上出现红斑，胃肠躯干上出现红斑，胃肠壁溃疡产生腹泻壁溃疡产生腹泻。伤寒沙门氏菌伤寒沙门氏菌二、痢疾杆菌二、痢疾杆菌l痢疾杆菌可引起痢疾杆菌可引起细菌性痢疾细菌性痢疾(与阿与阿米巴痢疾不同米巴痢疾不同)，症状为急性腹泻，症状为急性腹泻，通常大便中有血通常大便中有血及粘液，某些病及粘液，某些病例中有发烧。例中有发烧。三、霍乱弧菌三、霍乱弧菌l病症：霍乱病症：霍乱l症状：轻型病例中，症状：轻型病例中，只造成只造成腹泻腹泻。l 在较严重或较典在较严重或较典型的病例中，除腹泻型的病例中，除腹泻外，症状还包括外，症状还包括呕吐、

7、呕吐、“米汤样米汤样”大便、腹大便、腹疼和昏迷等疼和昏迷等。病程短，。病程短，严重的常常在症状出严重的常常在症状出现后现后12h内死亡内死亡。l电镜照片使用的是电镜照片使用的是结晶紫结晶紫单染色单染色，若，若革兰氏染色则革兰氏染色则为阴性红色为阴性红色四、寄生虫四、寄生虫l真菌一般通过接触传染，不通过水传播，真菌一般通过接触传染，不通过水传播，l引起疾病的原生动物引起疾病的原生动物和和小型后生动物小型后生动物也由水传播，通常也由水传播，通常称为称为寄生虫寄生虫。在目前发现的几千种原生动物中只有在目前发现的几千种原生动物中只有能引起人类疾病能引起人类疾病l传播方式传播方式：除了饮水不卫生外，：除

8、了饮水不卫生外，l如疟疾是蚊子传播，食用生肉感染肉类寄生虫等如疟疾是蚊子传播，食用生肉感染肉类寄生虫等11.2.2 水质指示微生物水质指示微生物大肠菌群大肠菌群 大肠菌群是人肠道中正常的寄生菌，大肠菌群是人肠道中正常的寄生菌，是一群需氧和兼性厌氧的，能在是一群需氧和兼性厌氧的，能在37，24h内使乳糖发酵产酸产气的革兰阴性无芽孢内使乳糖发酵产酸产气的革兰阴性无芽孢杆菌，杆菌，又称总大肠菌群又称总大肠菌群。大肠菌群作为水体被粪便污染的指标，大肠菌群作为水体被粪便污染的指标，也是饮水、食品等的细菌学常规检验指标也是饮水、食品等的细菌学常规检验指标之一，通常用之一，通常用“大肠菌群指数大肠菌群指数”

9、和和“大肠大肠菌群值菌群值”表示。表示。这些寄生菌通常与人体构成互利共生关系，这些寄生菌通常与人体构成互利共生关系，当人体免疫力下降时，他们则有可能成为引起肠当人体免疫力下降时，他们则有可能成为引起肠炎的致病菌，他们中的个别变种还会变为极具毒炎的致病菌，他们中的个别变种还会变为极具毒性的病菌。性的病菌。如大肠埃希氏菌可引起幼儿腹泻，引起美国如大肠埃希氏菌可引起幼儿腹泻，引起美国和日本传染病流行的和日本传染病流行的O-157也是大肠埃希氏菌的也是大肠埃希氏菌的变种菌株。变种菌株。中国水质标准中规定的大肠菌群数中国水质标准中规定的大肠菌群数(个个L)饮用水饮用水 3 游泳池水游泳池水 100 地表

10、水地表水 第一级第一级 500 第二级第二级 10000 第三级第三级 5000011.2.2.1 大肠菌群检测的目的和原理大肠菌群检测的目的和原理；11.2.2.2 大肠菌群的检测方法大肠菌群的检测方法 常用的大肠菌群的检测方法有多管发酵法常用的大肠菌群的检测方法有多管发酵法与膜滤法。与膜滤法。MPNl发酵法是大肠菌群测定的国家标准方法。分发酵法是大肠菌群测定的国家标准方法。分为三步。为三步。l目的：目的：方法为将水样置于方法为将水样置于糖类液糖类液体培养基中体培养基中，在一定温度，在一定温度下，经一定时间培养后，下，经一定时间培养后，观察有无酸和气体产生，观察有无酸和气体产生，即有无发酵，

11、而初步确定即有无发酵，而初步确定有无大肠菌群存在。如采有无大肠菌群存在。如采用含有葡萄糖或甘露醇的用含有葡萄糖或甘露醇的培养基，则包括副大肠杆培养基，则包括副大肠杆菌；如不考虑副大肠杆菌，菌；如不考虑副大肠杆菌，则用乳糖培养基。则用乳糖培养基。由于水由于水中除大肠菌群外，还可能中除大肠菌群外，还可能存在其它发酵糖类物质的存在其它发酵糖类物质的细菌，所以培养后如发现细菌，所以培养后如发现气体和酸并不一定能肯定气体和酸并不一定能肯定水中含有大肠菌群，还需水中含有大肠菌群，还需根据这类细菌的其它特性根据这类细菌的其它特性进行下两阶段的检验。进行下两阶段的检验。l试验中的培养基中加入了试验中的培养基中

12、加入了酸碱指示剂酸碱指示剂的的，时时，同时培养基中口朝下放置了装满同，同时培养基中口朝下放置了装满同样培养基的小试管，样培养基的小试管，时时，被作为培养中是否产气的依据被作为培养中是否产气的依据。l目的：目的：。l根据：根据：大肠菌群在固体培养基上大肠菌群在固体培养基上，和和的特性的特性 远藤氏培养基远藤氏培养基 出现特征出现特征 不符合不符合 划线分离单菌落划线分离单菌落 菌落菌落 特征菌落特征菌落 阳性阳性 阴性阴性 结论：无大肠菌群结论：无大肠菌群 菌落革兰氏染色菌落革兰氏染色 阳性阳性 阴性阴性 结论：无大肠菌群结论：无大肠菌群 在此阶段，先将上在此阶段，先将上一试验产酸的菌种一试验产

13、酸的菌种移植于移植于品红亚硫酸品红亚硫酸钠培养基钠培养基(远藤氏培远藤氏培养基养基)或或伊红美蓝培伊红美蓝培养基表面养基表面（划线接（划线接种是为了分离出单种是为了分离出单菌落，防治菌落不菌落，防治菌落不纯干扰结果），这纯干扰结果），这一步氧气可以阻止一步氧气可以阻止厌氧芽抱杆菌的生厌氧芽抱杆菌的生长，而上述培养基长，而上述培养基所含染料物质也有所含染料物质也有抑制许多其它细菌抑制许多其它细菌生长的作用。生长的作用。C.复发酵复发酵l目的目的l将可疑的菌落再移植于糖类培养基中，将可疑的菌落再移植于糖类培养基中，观察其是否发酵，是否产酸产气，最观察其是否发酵，是否产酸产气，最后肯定有无大肠菌群存

14、在。后肯定有无大肠菌群存在。l 对于自来水厂出水，初步发酵试验一对于自来水厂出水，初步发酵试验一般都在般都在10个小发酵管和个小发酵管和2个大发酵管个大发酵管(或发酵瓶或发酵瓶)内进行，复发酵试验则在内进行，复发酵试验则在小发酵管内进行。小发酵管内进行。l根据肯定有大肠菌群存在的初步发酵根据肯定有大肠菌群存在的初步发酵试验的发酵管或瓶的数目及试验所用试验的发酵管或瓶的数目及试验所用的水样量，即可利用数理统计原理，的水样量，即可利用数理统计原理，查表得出结果查表得出结果。（2）膜滤法）膜滤法 使用的使用的滤滤膜膜是孔径是孔径为为m的微的微孔滤膜；孔滤膜；转移至伊红美兰转移至伊红美兰平板上。平板上

15、。11.2.3 水微生物污染的控制水微生物污染的控制 控制水体微生物的污染首先必须控制水体微生物的污染首先必须从源头从源头做起做起，即控制排放废水，尤其是医院废水，即控制排放废水，尤其是医院废水等微生物的含量等微生物的含量,避免大量有害微生物进入避免大量有害微生物进入水体；水体；其次，其次，消除微生物兹生的环境。消除微生物兹生的环境。净化水净化水体，对地表水、游泳池水要进行定期检测，体，对地表水、游泳池水要进行定期检测，必要时加入消毒剂以杀灭微生物。必要时加入消毒剂以杀灭微生物。11.3 发光细菌的微毒检测发光细菌的微毒检测 发光细菌法是发光细菌法是20世纪世纪70年代后期提出的年代后期提出的

16、一种微生物一种微生物检测环境水质毒性检测环境水质毒性的新方法。的新方法。发光细菌法简便、快速、灵敏、精度高，发光细菌法简便、快速、灵敏、精度高，凡有毒化合物、废水、废物的生物毒性均凡有毒化合物、废水、废物的生物毒性均可测定。可测定。发光细菌法已被中国国家环境保护总局发光细菌法已被中国国家环境保护总局规定为规定为测定水环境急性毒性的国家标准测定水环境急性毒性的国家标准。11.3.1 发光细菌检测的原理发光细菌检测的原理 细菌的发光过积是菌体内一种细菌的发光过积是菌体内一种新陈代谢新陈代谢的生理的生理过程。菌体含有荧光素、荧光酶、过程。菌体含有荧光素、荧光酶、ATP等发光要等发光要素，在有氧条件下

17、通过细胞内生化反应而产生微素，在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生微弱荧光。弱荧光。毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系，发光细菌法就是利用灵敏的光电测量系统测定毒发光细菌法就是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对细菌发光强度的抑制程度进而反映环境中毒物对细菌发光强度的抑制程度进而反映环境中毒物毒性大小，用发光度表征毒物所在环境的急性物毒性大小，用发光度表征毒物所在环境的急性毒件。毒件。11.3.2 发光细菌法检测的操作发光细菌法检测的操作 目前国内外发光细菌的测定常用的有目前国内外发光细菌的测定常用的有两种方法。两种方法。新鲜发光细菌培养测定法新鲜发光细菌

18、培养测定法 即将发光菌接种于液体培养基中，在适当条即将发光菌接种于液体培养基中，在适当条件下件下(200.5)振荡振荡培养培养到对数生长期，配制含到对数生长期，配制含3NaCl盐度的适当浓度的菌悬液加入测试管中，盐度的适当浓度的菌悬液加入测试管中，再加入再加入待测液待测液，使之与菌液接触，作用，使之与菌液接触，作用515min后，读出并记录对照管和样品管发光强度。此法后，读出并记录对照管和样品管发光强度。此法操作较为简便。操作较为简便。冷冻干燥发光细菌制剂测定法冷冻干燥发光细菌制剂测定法 即把培养到对数生长期的发光细菌，即把培养到对数生长期的发光细菌，以冷冻干燥法制成以冷冻干燥法制成干粉剂干粉

19、剂，使用时加入冷，使用时加入冷的的2NaCl溶液复苏溶液复苏，使其恢复到原来的生，使其恢复到原来的生理状态和发光水平，然后用于测定。这是理状态和发光水平，然后用于测定。这是国家标准方法，其优点是可实行测定的质国家标准方法，其优点是可实行测定的质量控制。冻干粉可长期保藏方便使用，操量控制。冻干粉可长期保藏方便使用，操作简便，节约时间。作简便，节约时间。11.3.3 发光细菌法的应用发光细菌法的应用在水质监测中的应用在水质监测中的应用在工业废水、固体废物、废气的急性毒性在工业废水、固体废物、废气的急性毒性检测中的应用检测中的应用 对重金属急性毒性效应的测定和评价对重金属急性毒性效应的测定和评价对化

20、学品的毒性评价和安全性评价对化学品的毒性评价和安全性评价 11.4 污染物致突变性检测（污染物致突变性检测（Ames）试验）试验 该试验是通过测定有污染物存在时鼠伤该试验是通过测定有污染物存在时鼠伤寒沙门菌寒沙门菌(Salmonella typhimurium)的的组组氨酸营养缺陷型氨酸营养缺陷型(his-)菌株发生回复突变菌株发生回复突变的的概率来判断污染物的致癌、致突变效应。概率来判断污染物的致癌、致突变效应。其阳性结果与致癌物吻合率高达其阳性结果与致癌物吻合率高达83。列为评价化学物质安全性的首选力法。列为评价化学物质安全性的首选力法。11.4.1 Ames试验的原理和方法试验的原理和方

21、法 鼠伤寒沙门菌的组氨酸营养缺陷型菌株，鼠伤寒沙门菌的组氨酸营养缺陷型菌株，在在不含组氨酸的培养基上不能生长不含组氨酸的培养基上不能生长。但当受到致突。但当受到致突变物作用后，大量细胞在遗传物质的特定座位发变物作用后，大量细胞在遗传物质的特定座位发生基因回复突变而成为野生型，生基因回复突变而成为野生型，能自行合成组氨能自行合成组氨酸酸，此时培养物中虽不含组氨酸。组氨酸缺陷型，此时培养物中虽不含组氨酸。组氨酸缺陷型菌株亦能生长并菌株亦能生长并形成菌落形成菌落。Ames试验就是通道在培养物中加入待测物，试验就是通道在培养物中加入待测物，根据不含组氨酸的培养基上组氨酸营养缺陷型茵根据不含组氨酸的培养

22、基上组氨酸营养缺陷型茵株长出株长出回复突变菌落数目的多少回复突变菌落数目的多少判断待测物的致判断待测物的致突变性。突变性。(1)试验菌株试验菌株 采用鼠伤寒沙门菌变异株采用鼠伤寒沙门菌变异株TA97，TA 98，TAl00，TAl02四种菌种，又增加了四种菌种，又增加了TA1535，TA1537，TA1538共七株。共七株。(2)试剂试剂 牛肉膏蛋白陈培养基牛肉膏蛋白陈培养基 牛肉膏，蛋白胨牛肉膏，蛋白胨Nacl 5.0g,水水 S9mix 大鼠肝匀浆大鼠肝匀浆S9与与NADP、G-6-P、KCl、Na2 HPO4、KH2PO4和水配成混合液。和水配成混合液。(3)菌种鉴定菌种鉴定 在试验之前

23、都要进行全面的生物学特在试验之前都要进行全面的生物学特性和敏感性鉴定，符合要求才能使用。性和敏感性鉴定，符合要求才能使用。脂多糖屏障丢失脂多糖屏障丢失 判定是否是缺陷型判定是否是缺陷型R因子因子 判断菌体是否存在或失去了某种判断菌体是否存在或失去了某种 抗药性质粒。抗药性质粒。紫外线损伤修复缺陷紫外线损伤修复缺陷自发回变自发回变回变特性回变特性诊断性试验诊断性试验 组氨酸营养缺陷型组氨酸营养缺陷型(4)操作方法操作方法 Ames试验的典型操作方法有试验的典型操作方法有平板掺入平板掺入试验试验和和斑点试验斑点试验两种。两种。11.4.2 Ames试验的应用试验的应用检测食品添加剂、化妆品等的致突

24、变性，检测食品添加剂、化妆品等的致突变性，由此推测其致癌性。由此推测其致癌性。检测水源水和饮用水的致突变性，探索较检测水源水和饮用水的致突变性，探索较现行方法更加卫生安全的消毒措施。现行方法更加卫生安全的消毒措施。检测城市污水和工业废水的致突变性，结检测城市污水和工业废水的致突变性，结合化学分析，追踪污染源，为研究防治对合化学分析，追踪污染源，为研究防治对策提供依据。策提供依据。检测土壤、污泥、工业废物堆肥、废物灰烬的致检测土壤、污泥、工业废物堆肥、废物灰烬的致突变性。以防止维系生命的土壤受致突变物污染突变性。以防止维系生命的土壤受致突变物污染后，再通过农作物危害人类。后，再通过农作物危害人类

25、。检测气态污染物的致突变性，防止污染物经出大检测气态污染物的致突变性，防止污染物经出大气，通道呼吸对人体发生潜在危害。气，通道呼吸对人体发生潜在危害。研究化合物结构与致突变性的关系。为合成对环研究化合物结构与致突变性的关系。为合成对环境无潜在危害的新化合物提供型论依据。境无潜在危害的新化合物提供型论依据。检测农药在微生物降解前后的致突变性，检测农药在微生物降解前后的致突变性，了解农药在施用后代谢过程中对人类有无了解农药在施用后代谢过程中对人类有无隐患。隐患。筛选抗突变物，研究开发新的抗痛药。抗筛选抗突变物，研究开发新的抗痛药。抗诱变因素在抗癌作用上至关重要、随着遗诱变因素在抗癌作用上至关重要、

26、随着遗传毒理学的发展，通过筛选已发现天然食传毒理学的发展，通过筛选已发现天然食物如蔬菜类、茶叶、中草药等都员有抗诱物如蔬菜类、茶叶、中草药等都员有抗诱变作用。变作用。11.5 生物传感器生物传感器11.5.1 生物传感器的定义与分类生物传感器的定义与分类 传感器传感器是能感受特定的被测量的物质是能感受特定的被测量的物质并按照一定规律将其转换成可用信号的器并按照一定规律将其转换成可用信号的器件或装置。件或装置。生物传感器生物传感器是用固定化生物成分或生是用固定化生物成分或生物体作为敏感元件的传感器。物体作为敏感元件的传感器。生物传感器的分类主要有三种方式。生物传感器的分类主要有三种方式。根据生物

27、传感器中根据生物传感器中分子识别元件分子识别元件即敏感元即敏感元件可分为五类：酶传感器、微生物传感器、件可分为五类：酶传感器、微生物传感器、细胞传感器、组织传感器和免疫传感器。细胞传感器、组织传感器和免疫传感器。根据生物传感器的根据生物传感器的换能器换能器即信号转换器分即信号转换器分类有：生物电极传感器、半导体生物传感类有：生物电极传感器、半导体生物传感器、光生物传感器、热生物传感器、压电器、光生物传感器、热生物传感器、压电晶体生物传感器等。晶体生物传感器等。以以被测目标与分子识别元件的相互作用被测目标与分子识别元件的相互作用方方式进行分类有：生物亲和型生物传感器和式进行分类有：生物亲和型生物

28、传感器和代谢型或催化型生物传感器。代谢型或催化型生物传感器。三种分类方法之间互相交义，相互渗三种分类方法之间互相交义，相互渗透。透。11.5.2 生物传感器基本结构和工作原理生物传感器基本结构和工作原理 生物传感器通常由生物传感器通常由敏感元件敏感元件(生物分子生物分子)、转换元件及相应的机械结构和电子线路转换元件及相应的机械结构和电子线路所所组成，它以生物分子所发生的物理或化学组成，它以生物分子所发生的物理或化学变化转化为相应的电信号予以放大输出，变化转化为相应的电信号予以放大输出，从而得到检测结果。从而得到检测结果。生物传感器的工作原理主要有以下几生物传感器的工作原理主要有以下几种：种：(

29、1)将将化学变化化学变化转变成电信号转变成电信号 (2)将将热变化热变化转换成电信号转换成电信号 (3)将将光信号光信号转变为电信号转变为电信号 (4)直接直接产生电信号方式产生电信号方式 11.5.3 生物传感器在环境检测中的应用生物传感器在环境检测中的应用(1)BOD生物传感器生物传感器 应用应用BOD传感器完成样品的测定，一传感器完成样品的测定，一般在般在1030min，比传统法的测定时间大，比传统法的测定时间大为缩短。为缩短。(2)测定氨生物传感器测定氨生物传感器(3)亚硝酸盐生物传感器亚硝酸盐生物传感器(4)致突变物传感器致突变物传感器(5)急性毒性发光细菌生物传感器急性毒性发光细菌

30、生物传感器11.6 PCR技术在环境检测中的应用技术在环境检测中的应用 聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）是近年来分子是近年来分子生物学领域中迅速发展和广泛应用的一种生物学领域中迅速发展和广泛应用的一种技术。技术。PCR技术能快速、特异地在技术能快速、特异地在体外扩体外扩增所希望的目的基因或增所希望的目的基因或DNA片段片段，是基因，是基因扩增技术的一次重大革新，它可以将极微扩增技术的一次重大革新，它可以将极微量的量的DNA特异地特异地扩增上百万倍扩增上百万倍。对于检侧。对于检侧环境中难以培养或极其微量的病原微生物环境中难以培养或极其微量的病原微生物是一种非常有用的技术。是一种非常有用的技术。11.7 用于环境保护的工程菌的安全性问题用于环境保护的工程菌的安全性问题（1）基因工程菌的构建）基因工程菌的构建 多质粒新菌株的构建、原生质体融合技多质粒新菌株的构建、原生质体融合技术、降解性质粒术、降解性质粒DNA和染色体和染色体DNA的体外的体外重组。重组。（2）基因工程菌存在的问题）基因工程菌存在的问题 降解功能的稳定性问题、基因工程菌降解功能的稳定性问题、基因工程菌应用的安全性问题应用的安全性问题。