流式检测常见问题课件

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1、流式细胞基本知识Q&A1、流式细胞仪上的FL2-W FL2-A FL2-H分别是做什么的？FL2-W是只检测荧光的脉冲宽度，FL2-H是指脉冲高度。通常在做细胞周期分析时应用，用于去除 粘连细胞。2、流式同型对照怎样选择？同型对照（Isotype Control）:使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白 及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。如果一抗是多抗， 可以用 an normal serum （与一抗相同的正常血清） （must be the same species as primary antibod y）。This con

2、trol is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining. 这个可以咨询试剂商。同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照。由于荧光标记单抗的组来源不同，应选用 相同来源的未标记单抗作为同型对照来调整背景染色。举个例子：比如检测一抗为单抗的mouse anti rat CD11b，clone OX-42 purified IgG，那么它的 isotype 是 mouse IgG2a，所以可以用 purified （纯化的） mouse IgG2a来做OX-42的同型对照（Isotype Contr

3、ol）o 一般的的生物技术公司和国内的代理都有出 售。同型对照：是指与MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类，若使用直接免疫荧光染色法，同 型对照也应标记荧光色素，如IgG1 FITC、IgG2a、PE等。主要考虑了细胞的自发荧光、FC受体介导的 抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。此外，同型对照与MoAb所标记的荧光色素、浓度、F： P比值 （标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值）应该相同为最佳，这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重 要意义，切忌使用与MoAb不相匹配的同型对照，最好为同一实验室、采用相同工艺或方法制备（如同一 品牌）的产品。3、流式细胞技术测定细胞内游离钙浓度为何要使

4、用氯化钙.在文献及其他专业网站中都有测定游离钙的方法，具体如下：（1）钙荧光探针负载；（2）随机测定每管细胞悬液样品（以下简称样品）的单个细胞的荧光强度，记为F值。（3）加入10%Triton X 100，（破膜用）；加入1 mmol/L氯化钙，（问题所在），吹打均匀，孵 育110min，测定荧光即Fmax值。（4）加入EGTA，20心（钙螯合剂），孵育110min，激发波长488nm测定荧光，即Fmin值。这个过程中的氯化钙的作用如何，请高人指点，谢谢。因为正常血浆中Ca2+浓度是1mM，细胞外液的Ca2+对细胞内Ca2+有影响。加0.1%triton是增加膜 通透性，使细胞外Ca2+进入细

5、胞内，作为最大值。加EGTA是为了螯合Ca2+，作为最小值.生理环境中细 胞内钙离子浓度远低于细胞外液（大约1： 10000），细胞膜对钙的通透性变化对细胞内钙影响很大。4、流式与werstern的区别，知道一些，不足之处请大家补充：（1）Western是检测蛋白表达的金标准，可用于检测细胞多种类型的蛋白；流式细胞术的方法多用 于检测细胞膜蛋白，虽然也可通过Triton-X100给细胞打孔的方法来检测胞内蛋白，但对于分泌蛋白却是 无能为力的；（2）Western测蛋白含量对抗体的量需要很少，一般1： 1000左右，而流式对抗体的需要量很大， 一般1： 50 （很浪费抗体）；（3）采用Weste

6、rn方法检测细胞蛋白含量的变化一般要有内参，而流式一般要把每个样品分为两份， 同时都做只加二抗（FITC标记的）的对照，这样平均到每个细胞的发光就不用内参了；（4）就个人经验而言，流式用多抗不好，单抗标出来不错。不过流式的应用原理主要还是抗原和抗体反应和western.免疫组化没有本质差别，但是由于免疫组 化和western都有酶催化底物的放大体系，因此，流式不适合检测低表达的蛋白，低表达的还是采用west ern （尤其是化学发光底物更佳）和免疫组化更好。当然，流式最大的一个特点就是，可以定量（百分比）， 如果是高表达的用流式细胞仪非常有优势。5、 FL1，FL2，FL3的区别是什么？是指在

7、不同位置测得的荧光?还是不同波长的荧光?这3个参 数到底测的是什么？有什么意义？你的理解是正确的，其实FL1， FL2， FL3是指不同的荧光通道.举个例子来说吧.我们用FITC/PE 双标记的细胞，在488nm的激光激发下，这两种荧光染料分别发出波长不同的绿色和橙色荧光，然后这发 出的荧光再通过滤光片分开，对应的是不同的波长的滤光片，一般在fl1那的是530nm的滤光片，在FL2 那的是575nm的滤光片，这样就可以把在一起的荧光分开了。6、用于做Western或ELISA的一抗可否用于流式细胞术？看你说明书上是怎么说的了，如果没有说就不可以做流式，需要另外买了。7、MFI和GFI的意义？G

8、eo Mean，叫做几何均数（geometric mean），常用于等级资料和对数正态分布资料，和常用的 算数均数（mean）的计算方法不同。“ %total或者%gate的结果”代表的是百分率，即细胞占总体细胞或 者是门内细胞的百分比；用百分比作为统计指标，适用于荧光表达较强的指标。我看到你的流式图上，检 测样本的荧光强度不是很强，属于弱表达的指标，若用百分率统计，就是会失去一部分弱阳性的数据。我 建议可以用平均荧光强度（也就是mean值）作为统计指标，比较荧光强度的变化。8、流式技术中的APC，pure标记是什么意思呢？荧光物质通常是指那些在受到一个波长激发后，处于一个能量不稳定的状态，能

9、发射一个波长比激 发波长长的光的一类物质。当然荧光并不都是受激发后发射的，如一些生物可以发射荧光，如荧火虫，发 光细菌等，他们发出的光是通过体内的酶促反应而产生的，这个酶通常被称为荧光素酶.EB是一种荧光物 质，它在受到紫外线照射后可以发出一可见光，常用于DNA、RNA电泳中。APC英文全名：allophycocyanin；中文名：别藻青蛋白；最大吸收峰：650nm，最大发射荧光峰：660n m，适用于双激光流式仪，可被600-640nm波长的激光激发。PerCP英文全名：peridinin chlorophyll protein，中文名：多甲藻叶绿素蛋白；最大激发波峰490nm，被4 88n

10、m的氩离子激光激发后，发射光峰值约为677nm，与FITC、PE进行多色荧光染色补偿重叠较少，非 特异性结合也较少。虽然较易使用，但量子产量不高，多用于检测表达较高的抗原。9、怎样用流式细胞仪来鉴定小鼠BMDC？检测小鼠BMDC主要是从形态学和细胞表面分子两方面来鉴定我做的时候就做了普通光镜下形态、 电镜（扫描和透射），另外检测了小鼠BMDC表面的共刺激分子如CD86、CD11、CD80。还做了 MHC II类分子的检测，还有MHCI类分子的检测，这些分子在DC表面都不是特异存在的，在巨噬细胞、淋巴 细胞表面也有表达，所以目前并没有非常特异性的方法检测你的细胞一定就是DC，但是从形态和表面分

11、子的检测结合来看，效果就比较好了.一般在幼稚的DC上述分子表达水平较低，DC成熟过程中，上述分 子表达呈上调趋势，你可以在不同的培养时间分别检测。10、请问流式细胞术单抗直接荧光需要几种对照?首先确认你用的直标抗体的荧光染料是什么，再确定该抗体的来源种属，选择相应的同型对照。如： 你现在想检测小鼠淋巴细胞表面的CD4抗原，荧光染料为FITC，抗体来源为大鼠的IgG1亚型，即R at anti Mouse CD4-FITC （IgG1），你所需要的同型对照就应该是Rat IgG1-FITC，一般的抗体说明 上都会写清。11、6孔板的细胞量能否做流式呀？对于6孔板而言，每孔的表面积为10 cm2依

12、细胞种类不同在长满时达到的数量从5*10的5次方 到5*10的6次方不等。6孔板绝对没问题的！甚至24孔板也可以正常做。不过用于调试仪器参数的正常 细胞要多准备一些。12、血液里的mononuclear cell （除外红细胞，血小板和破碎的细胞碎片），能不能用细胞大小来 gating，只看我关心的细胞？（1）红细胞还是小一些，无法100%区分，但还是可用把大部分红细胞gate掉。（2）溶血也很重要，如果你的红细胞多的话。（我猜不少，如果用ficol的话）。可以用氯化铵溶液， 如 ACK（Lonzo），（3）CD45是所有白细胞都表达的，可以用来区分RBC vs. WBC13、细胞膜蛋白变化是

13、用流氏检测好，还是要做western?膜蛋白的提取，好像很费功夫，提取的不好，western结果也就不可信。流式需要的抗体很少，流式 能够检测阳性表达细胞的比例，western能对总的表达定量，各有有缺点。14、FCM检测表达结果到底是用百分比还是MFI。我作出是单峰，原本我觉得用MFI表示较好。但 我做的2个蛋白很奇怪，一个表达率高，但MFI值低；另一个表达率低，但MFI值高。我又作了 SYBRGREEN定量PCR，发现mRNA的表达基本与百分比相符，而与MFI值不太一致。个人认为如果有明显阴性细胞群和阳性细胞群，应计算百分比；无明显分群，仅荧光强度发生变化 的应该用MFI。如果是整体峰移（

14、或者叫单峰），那么根本不存在MFI之外的任何合理的指标，不管MFI 跟其它指标吻合度如何，这就是客观数据、客观事实。15、培养细胞的bcl-2及Bax蛋白的检测？首先制成单细胞悬液，PBS洗涤后用胞内染色试剂盒（很多公司都有，其实就是固定剂加增透/打孔 剂）进行处理，再进行抗体孵育标记染色，洗涤后上样。16、流式检测胞内抗原时打孔液的配方？打孔液有很多种，方法也有很多。与你的实验方法相关。我用过酒精固定或Triton X-100 （我做的都 是培养的细胞）：（1）70%的酒精固定24小时即可，不再需要再打孔。如在PI染色测细胞周期或凋亡。（2）Triton X-100是比较强烈的穿孔剂。0.1

15、% Triton X-100/PBS （再加0.1%BSA）是比较温和 一点。浓度可适当提高。作用时间以几分钟为宜。这个时间必须要自己试。时间长了细胞易破裂，短了则 打孔不够。如果你要染胞浆，则时间适当短些，如果要染内质网或核内等，由于要对两层膜性结构打孔， 时间当然会长一些（3）可以试试0.1% saponin （皂素）17、标本必须在抗体染色后30分内检测吗？SOP是这么说的:（1）Keep samples after staining covered with aluminum foil and at 4 0C （in the refrigerat or） until they are

16、run for flow analysis. The samples should be analyzed within 48 hours. Fluore scence loses its brightness if cells are not kept properly： not at 4 0C, or are exposed to light（2）If cells are not fixed with paraformaldehyde, keep the samples on ice and run them i mmediately after staining is accomplis

17、hed因此，如果你没有用PBS洗的话，可以用paraformaldehyde固定，放置48小时。洗了后应该尽快 检测。如果做好不能及时检测，我们一般是加入等量的2%的多聚甲醛固定，4度冰箱避光贮存。一般过夜 没有问题，第二天同样PBS 2ml洗涤细胞一次，上机检测。18、如何分选原始红细胞？CD71（转铁蛋白受体）-幼稚细胞的标记CD235（GPA）-红细胞的标记（小鼠有Ter119）双阳性细胞即为幼稚红细胞，但无法区分原始及中晚幼红.19、请问流式检测膜蛋白表达的变化用多克隆抗体出结果的机会大吗？流式的抗体和WB的抗体是不同的（有部分可以通用），多抗一般是大的变性蛋白为抗原制备的， 而WB的

18、中被检测蛋白就是变性状态，所以很吻合，而流失中一般蛋白还是保持了天然构象，所以产生的 多抗可能不太好，而需要用很小特定的决定簇为抗原制备单克隆抗体。Q 20、在下最近作人外周血流式，作表面及其胞内染色，试剂说明书说要先分离外周血单个核细胞 再染色，我有时候分的红细胞比较多，其他的方法试过了，都改进的不好，我担心红细胞会有影响，想在 分离出PBMC以后如果红细胞比较多的话，就用红细胞裂解液裂解一下，但是我有如下问题，希望这样做过的同志指点一下，感激不禁。（1）有人这样在分离PBMC以后再裂解的吗（我知道一般是在全血染色后再裂解红细胞）？（2）这样会影响流式检测吗？（3）用的裂解液配方是什么（最好

19、是自己用过的）。（4）用法是什么我是在如果PBMC分出来以后要是红细胞比较多的时候使用，这样要怎样把分出 的PBMC稀释，加多少裂解液裂解多长时间，裂解后洗涤几次等等。我曾做骨髓液分离单个核细胞而后做流式，一般来说用Ficoll分过之后即便还有红细胞残留，上流式 也可通过“设门”根据细胞形态大小将红细胞剔除。若红细胞残留太多，则可通过红细胞裂解液进一步去除 之。我用的裂解液配方是：碳酸氢钾（KHCO3） 1.0g氯化氨（NH4CL） 8.3gEDTA-Na2 0.037g 加双 H2O 至 1000ml，为工作液。配好后4度冰箱保存，使用时效果更好。我是在Ficoll分过之后用的，所以一般根据

20、离心后EP管里 细胞团的大小加红细胞裂解液，通常5ml骨髓液分离单个核细胞后得到的细胞再加500ul裂解液，震荡混 匀置2-5分钟红细胞就基本上裂解干净了。洗涤次数看白细胞多少而定，因为洗的次数越多，损失就越多。 我一般洗一到两次就OK了.做了很久没发现这样处理影响结果。有一点，我是在这样处理后才标记抗体 的，楼上的说是标记过才溶红细胞，所以建议在溶的时候时间不宜过长，洗涤次数也不宜过多，以免将标 记上的单抗洗脱。21、请问下表中流式细胞仪给出的平均值是什么意思，是怎样得到的，有些文献中提到“fluoresce nce per cell，是下面的mean值吗，还是要用mean值除以第1栏的细胞

21、数events，才能得到fluore scence per cell ？mean值就是每个细胞的平均荧光强度，不用再除细胞数。这只是个相对值，如果求绝对值，应用 巳知荧光剂浓度值对应仪器给出的mean值，做标准曲线。以后你得到的mean值，就可以根据这条标准 曲线查出真正的荧光浓度值。22、流式中检测细胞表面和细胞内蛋白表达水平的抗体有何区别？抗体只是针对相应抗原的，至于是针对胞内还是胞膜对你检测来说并无明显影响，你只需要查清楚 到底是针对哪一个部位的抗原的，应该是可以用同一种抗体进行检测的，在流式操作时只需注意：如果是 针对胞内，则需要加破膜剂，让抗体能和相应抗原接触，否则就不需要了。23、

22、请教各位前辈：只要是荧光抗体久可以用于共聚焦显微镜吗？一般情况下都是可以的。但有时候强度不够，需要选择荧光强度大的染料，比如Alexa系列的。24、流式细胞仪检测细胞周期是否需要鸡红细胞作参照？不用，标准微球做完laser alignment （光路校正）就可以了。尽量把微球的各色CV值控制在1.5 以内。25、我现在要用间接法流式细胞术，刚买了荧光二抗，是KPL的fluorescein-labeled affinity pu rified antibody to mouse IgG+IgM（H+L） produced in goat .说明说上提示要用 TBS 或是 BSA 或milk di

23、luent/blocking solution液稀释。稀释至1： 101： 100。请问BSA是不是小牛血清，要用 多少浓度的。TBS液我没有，还有可否用注射用水稀释。BSA：牛血清白蛋白，浓度可以在一定范围内1%5%，具体可参考其他抗体说明书。TBS： Tris buffer saline。就是Tris 的盐溶液，很常规的溶液，配方：20mM Tris-HCl (ph8.0), 150mM NaClo你说的注射用水应该就是生理盐水吧，这对抗体来说是不利的，虽然在基础条件很差的情况下会用 这个溶液，但是还不如PBS溶液。既然是做流式，按照正规程序操作抗体，得到的结果也最能反映真实情 况。26、流式细胞检测中怎样把对照和样本的检测结果放在一张图中？分析获取数据是分开进行的，不可以混在一起上样。首先通过阴性对照调节基本电压，固定条件后 进行样品检测，分别保存结果。利用流式软件的multigraph中的overlap可以将阴性对照和样品结果相应 图进行叠加，这只是获取数据后对结果的组合和加工。