临床血液学检验：血液病MICM检验

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1、 血液病血液病MICM检验检验背景介绍背景介绍 血液病血液病是原发于造血系统的疾病，或影响造血系统伴发血液异常改变，是原发于造血系统的疾病，或影响造血系统伴发血液异常改变，以贫血、出血、发热为特征的疾病。以贫血、出血、发热为特征的疾病。出血性疾出血性疾病病贫血症贫血症白细胞白细胞疾病疾病常见血液病常见血液病造血系统造血系统恶性肿瘤恶性肿瘤白血病的诊断分型：白血病的诊断分型：MICMMICM分型发展由来分型发展由来l 1827年，法国的Alfred Velpeau 描述第一例白血病l 1847 年，Virchow首次提出了“白血病”这个名称l 1976年，法、美、英3国7位血液学家以光镜下的形态

2、为主，参照细胞化学染色，制定了FAB分型标准，标志着现代白血病诊断与分型的开标志着现代白血病诊断与分型的开端端 l 80年代末至90年代初，随着免疫学、细胞遗传学和分子生物学理论和技术的发展，出现了MICM（形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学）分型l WHO造血和淋巴组织肿瘤分类方案（2001，2008）FAB分型及WHO分类l FAB：主要建立在形态学基础上l WHO(2001和2008)l骨髓或外周血原始细胞比例20%l将一些有明确诊断及预后指导意义的细胞或分子遗传学异常作为诊断和分型的重要标志l将患者诊断之前的疾病状态和治疗措施纳入考量FAB和WHO分类方案的主要区别急性髓细胞白血病

3、（AML）和相关肿瘤 WHO分型l 伴再现性遗传学异常的AMLl 伴MDS相关改变的AML n继发于MDS或MDS/MPNn伴有MDS相关细胞遗传学异常n2或3系50%以上的细胞有发育异常l 治疗相关性AML l 不另作分类的AMLl 髓细胞肉瘤l Downs综合征相关髓系增生疾病l 母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤伴再现性遗传学异常的AMLAML with t(8;21)(q22;q22)RUNX1-RUNX1T1AML with inv(16)(p13.1q22)or t(16;16)CBFB-MYH11APL with t(15;17)(q22;q12)PML-RARAAML with t(

4、9;11)(p22;q23)MLLT3-MLLAML with t(6;9)(p23;q34)DEK-NUP214AML with inv(3)(q21q26.2)or t(3;3)RPN1-EVI1AML-M7 with t(1;22)(p13;q13)RBM15-MKL1?AML with mutated NPM1?AML with mutated CEBPA通常通常AML的诊断标准，原始细胞比例的诊断标准，原始细胞比例20%，但如果，但如果t(8;21)、t(15;17)或或inv(16)阳性，则不论原始细胞比例为多少，阳性，则不论原始细胞比例为多少，AML诊断成立诊断成立MICMMIC

5、M FAB形态学诊断(Morphology)免疫学检查(Immunology)细胞遗传学检查(Cytogenetics)分子遗传学检查(Molecular)MICM分型原则中各检测技术简介l 形态学：外周血涂片、骨髓涂片形态学：外周血涂片、骨髓涂片骨髓活检骨髓活检l 免疫表型检测：多参数流式细胞仪免疫表型检测：多参数流式细胞仪l 细胞遗传学检测细胞遗传学检测l常规核型分析，分子核型分析常规核型分析，分子核型分析lFISHFISHl 分子遗传学检测分子遗传学检测l融合基因检测（融合基因检测（RT-PCRRT-PCR）：）：PML-RARAPML-RARA、AML1-ETOAML1-ETO、CBF

6、B-MYH11CBFB-MYH11、MLL-MLL-、BCR-ABLBCR-ABLl基因突变：基因突变：FLT3-ITDFLT3-ITD、CEBPACEBPA、NPM1NPM1、TET2TET2、IDH1IDH1、NOTCH1NOTCH1、IKZF1IKZF1、FBXW7FBXW7l拷贝数变化（拷贝数变化（CNVCNV）:SNP-array:SNP-arrayl高通量测序技术高通量测序技术 病史病史 形态学：形态学：结构：活检结构：活检 细胞学：涂片细胞学：涂片 骨髓血凝块骨髓血凝块 免疫分型：免疫分型：流式细胞或免疫组化流式细胞或免疫组化 细胞遗传学：核型分析、细胞遗传学：核型分析、FISH

7、FISH 分子遗传学：融合基因（分子遗传学：融合基因（RT-PCRQ-PCR)/RT-PCRQ-PCR)/基因基因突变（测序）突变（测序）白血病白血病MICMMICM诊断程序及技术诊断程序及技术白血病诊断的任务白血病诊断的任务不仅仅是不仅仅是FABFAB分类分类 是不是白血病？急性？慢性？系来源 FAB分类 预后分层 治疗、疗效判断 MRD 病史病史+形态形态形态形态+免疫免疫形态形态+免疫免疫+遗传遗传+分子分子形态形态+免疫免疫+遗传遗传+分子分子为什么需要为什么需要MICMMICM综合诊断？综合诊断？形态或病理或加细胞化学分析受观察者个体经验形态或病理或加细胞化学分析受观察者个体经验及分

8、辨力的限制，一致率仅及分辨力的限制，一致率仅50-70%50-70%；在此基础上增加免疫组化和在此基础上增加免疫组化和/或或FCMFCM分析大大增加分析大大增加了分型的准确率，可达了分型的准确率，可达90%90%以上；以上；染色体、染色体、FISHFISH及基因分析，进一步提高分型的准及基因分析，进一步提高分型的准确率确率 MICMMICM整合诊断的临床意义整合诊断的临床意义 全面正确诊断与分型全面正确诊断与分型 评估预后评估预后 确立检测确立检测MRDMRD的标志，追踪的标志，追踪MRDMRD 帮助建立分层、个性化的治疗帮助建立分层、个性化的治疗 定期追踪帮助发现抗原丢失、克隆演变或突变定期

9、追踪帮助发现抗原丢失、克隆演变或突变 帮助确定病因或发病机制帮助确定病因或发病机制MICMMICM分型原则中各检测技术简介分型原则中各检测技术简介细胞形态及细胞化学分析的优缺点细胞形态及细胞化学分析的优缺点优点：优点：直观：镜下直接观察细胞形态，对直观：镜下直接观察细胞形态，对MDSMDS的诊断、一些少见的、的诊断、一些少见的、大的恶性细胞的确定优于流式细胞分析恶性细胞的比例更准确：大的恶性细胞的确定优于流式细胞分析恶性细胞的比例更准确：简单快速，有显微镜即可完成报告简单快速，有显微镜即可完成报告缺点：缺点：人为因素影响大人为因素影响大 难以鉴别细胞的成熟阶段，难以鉴别细胞的成熟阶段，B B、

10、T T等系列的恶性细胞等系列的恶性细胞 细胞较成熟时，难以鉴别良恶性细胞较成熟时，难以鉴别良恶性 不能提供太多的预后信息不能提供太多的预后信息形态形态M 标本直接固定，不容易损失信息，恶性细胞比例更客观，对一些标本直接固定，不容易损失信息，恶性细胞比例更客观，对一些抽不出或少见细胞，仍可诊断。如伴骨髓纤维化、抽不出或少见细胞，仍可诊断。如伴骨髓纤维化、MMMM、淋巴瘤、转、淋巴瘤、转移癌、移癌、等等 可以直接观察到组织结构，容易确定恶性细胞的组织部位可以直接观察到组织结构，容易确定恶性细胞的组织部位形态形态M流式细胞术流式细胞术流式流式IFCMFCM检测的参数检测的参数流式流式IR8R8：幼稚

11、细胞群，正常骨髓中此群细胞数量极低或空缺幼稚细胞群，正常骨髓中此群细胞数量极低或空缺流式流式I 流式细胞免疫分型的作用流式细胞免疫分型的作用 确定系来源确定系来源 原理：不同系有特定的抗原表达原理：不同系有特定的抗原表达 髓系髓系/B/B系系/T/NK/T/NK系系/组织细胞和树突状细胞组织细胞和树突状细胞 确定细胞分化阶段确定细胞分化阶段 不同发育阶段细胞，其抗原表达不同不同发育阶段细胞，其抗原表达不同 预后判断预后判断 有些抗原表达和淋巴瘤有些抗原表达和淋巴瘤/白血病预后相关白血病预后相关 治疗方法选择治疗方法选择-治疗靶向治疗靶向 疗效判断、复发监测疗效判断、复发监测 诊断双表型、混合性

12、，M0、未分化型等特殊类型白血病 髓系分亚型与FAB分亚型有一定差异I：immunology,免疫学Type of cellCD markersstem cellsCD34+,CD31-all leukocyte groupsCD45+GranulocyteCD45+,CD15+,CD24+,CD114+,CD182+MonocyteCD45+,CD14+,CD114+,CD11a,CD91+T lymphocyteCD45+,CD3+T helper cellCD45+,CD3+,CD4+T regulatory cellCD4,CD25,and Foxp3Cytotoxic T cellC

13、D45+,CD3+,CD8+B lymphocyteCD45+,CD19+or CD45+,CD20+,CD24+ThrombocyteCD45+,CD61+Natural killer cellCD16+,CD56+,CD3-,CD31,CD30 M0 CD34,CD33,CD13 M1 MPO,CD34,CD33,CD13,HLA-DR M2 MPO,CD34,CD15,CD13,HLA-DR M3 MPO,CD33,CD13、CD9(HLA-DR、CD11b常阴性)M4 MPO,CD33,CD15,CD14,CD13 M5 CD68,CD33,CD14,CD13,HLA-DR,CD36，

14、CD64 M6 CD33,CD235a,CD71 M7 CD33,CD41,CD42b,CD61急性髓系白血病免疫表型与急性髓系白血病免疫表型与FABFAB分型相关性分型相关性形态与免疫表型的符合性不足形态与免疫表型的符合性不足80%，不能脱离形态学单纯依赖免，不能脱离形态学单纯依赖免疫表型进行白血病的诊断与分型。疫表型进行白血病的诊断与分型。FAB基于形态，两者不符以形基于形态，两者不符以形态为主。态为主。流式流式I髓系髓系l MPO+（用（用FCM，免疫组织化学染色，细胞化学染色证实），免疫组织化学染色，细胞化学染色证实）l 或单核细胞（至少有以下标志中的或单核细胞（至少有以下标志中的2项

15、阳性：项阳性：NSE、CD11c、CD14、CD64、CD36*、溶酶体、溶酶体T细胞系细胞系l cCD3+(用抗用抗CD3链的单抗及链的单抗及FCM分析，不能用免疫组化的抗分析，不能用免疫组化的抗CD3链多克隆来链多克隆来检测，因为后者不是检测，因为后者不是T细胞特异性抗原细胞特异性抗原)l 或或sCD3+B细胞系细胞系l CD19强阳性并同时有以下标志中的至少强阳性并同时有以下标志中的至少1项阳性：项阳性：CD79a、cCD22、CD10l 或或CD19弱阳性并同时有以下标志中的至少弱阳性并同时有以下标志中的至少2项阳性：项阳性：CD79a、cCD22、CD10流式流式IMRDMRD流式细

16、胞学检测流式细胞学检测 肿瘤细胞与正常起源细胞免疫表型不同肿瘤细胞与正常起源细胞免疫表型不同 跨系表达跨系表达 抗原表达不同步抗原表达不同步 抗原表达丢失抗原表达丢失 抗原表达减弱抗原表达减弱 其它抗原表达其它抗原表达 初始免疫分型结果、白血病相关表型特点初始免疫分型结果、白血病相关表型特点 抗体组合越多覆盖率越高、敏感性越高抗体组合越多覆盖率越高、敏感性越高 假阳性、假阴性均存在假阳性、假阴性均存在 随访、动态观察更有意义随访、动态观察更有意义流式流式IFCMFCM的优缺点的优缺点流式流式I诊断误区举例诊断误区举例原始细胞增多是诊断前体恶性血液病尤其原始细胞增多是诊断前体恶性血液病尤其ALA

17、L的重要指标，的重要指标，但但原始细胞应根据免疫学标志原始细胞应根据免疫学标志/基因基因/染色体证实为恶性染色体证实为恶性造血前体细胞造血前体细胞 一些形态上的原始细胞可以是正常造血细胞（尤其见于一些形态上的原始细胞可以是正常造血细胞（尤其见于儿童感染后，儿童感染后，G-CSF,GM-CSFG-CSF,GM-CSF等刺激或化疗后或移植等刺激或化疗后或移植后）后）病例病例3 3 儿童儿童B-ALL,B-ALL,化疗化疗3 3年后停药，来我院复查，骨年后停药，来我院复查，骨髓涂片髓涂片8%8%的幼稚细胞的幼稚细胞流式幼稚流式幼稚B B淋巴细胞增生，未见异常表型淋巴细胞增生，未见异常表型病例病例4

18、NK4 NK细胞白血病移植后细胞白血病移植后4040天，骨髓涂片天，骨髓涂片8%8%的幼稚细胞的幼稚细胞流式流式:未见表型异常细胞，未见表型异常细胞，CD34CD34阳性细胞阳性细胞为幼稚为幼稚B B淋巴细胞淋巴细胞 即染色体异常即染色体异常 包括染色体的包括染色体的结构结构和和数量数量异常异常 根据这些特征性的异常，对恶性血液病进行根据这些特征性的异常，对恶性血液病进行诊断和分类、预后分层及指导治疗。诊断和分类、预后分层及指导治疗。细胞遗传学细胞遗传学C1950196019701980199020002010确定染确定染色体数色体数目目=46发现发现Ph；发现发现+21各种显带技术各种显带技

19、术出现；发现多出现；发现多数数AL患者伴患者伴有染色体异常有染色体异常FISH出现；出现；阐明某些染阐明某些染色体异常的色体异常的分子学改变分子学改变SKYCGHPCR技术技术FLT3-ITD(1996)c-KIT突变（突变（1993）.芯片技术：芯片技术：cDNA array、SNP-array、测序技术的发展测序技术的发展大量基因突变的发现：大量基因突变的发现：JAK2、NPM、CEBPA、PAX5、IKZF1、FLT3、RUNX1、WT1、RAS、NOTCH1.新一代高新一代高通量测序通量测序技术；各技术；各种遗传学种遗传学改变间的改变间的相互作用相互作用 白血病遗传学研究的历史细胞遗传

20、学细胞遗传学C多数AML患者有非随机性染色体改变，包括易位、倒位、插入、缺失、扩增、等臂染色体等染色体异常在AML诊断、分型、预后评价、发病机制研究及靶向治疗药物研发方面有重要价值一些特殊的细胞遗传学异常在WHO分型建议中已被列为特殊亚型对不同细胞遗传学类型的血液肿瘤患者进行个体化治疗可以获得更好的疗效细胞遗传学细胞遗传学CAML的WHO分型伴再现性遗传学异常的AML伴多系发育异常的AML继发于MDS；无MDS病史治疗相关性AML烷化剂相关；拓扑异构酶抑制剂相关；其它无法分类的AML髓细胞肉瘤Downs综合征相关AML细胞遗传学细胞遗传学C伴再现性遗传学异常的AMLAML with t(8;2

21、1)(q22;q22)AML with inv(16)(p13.1q22)or t(16;16)APL with t(15;17)(q22;q12)AML with t(9;11)(p22;q23)AML with t(6;9)(p23;q34)AML with inv(3)(q21q26.2)or t(3;3)AML-M7 with t(1;22)(p13;q13)RUNX1-RUNX1T1CBFB-MYH11PML-RARAMLLT3-MLLDEK-NUP214RPN1-EVI1RBM15-MKL1?AML with mutated NPM1?AML with mutated CEBPA通

22、常AML的诊断标准，原始细胞比例为20%，但如果t(8;21)、t(15;17)或inv(16)阳性，则不论原始细胞比例为多少，白血病诊断成立细胞遗传学细胞遗传学C细胞遗传学C染色体核型分析正常核型：男：46，XY女：46，XX异常核型：46，XY，t(8;21)(q22;q22)46，XX，t(15;17)(q22;q21.1)47,XY,del(6)(q15),+11,-15,add(17)(p13),+mar16MICM分型原则中各检测技术简介 标本采集 细胞接种 阻留中期分裂相 收获细胞 低渗、固定 制片、染色染色体分离显带的步骤染色体分离显带的步骤1.Collection of sp

23、ecimena.5ml Bone marrow is necessary for patient with Hematologic Malignancies b.Peripheral blood may be use when blast cells are more than 10%and the number of Leukocyte is more than 10109/Lc.Heparin annticoagulant of specimend.Specimen must be treated in 24h 标本采集2.How to get cells in metaphase dir

24、ect method Cell culture50ng/ml Colchicine 1h 细胞接种 阻留中期分裂相3.How to isolate chromosome?0.075mol/L kclLow Permeability Methanol:acetic acid (3:1)Fixation FISHChromosome examination 收获细胞 低渗、固定 Mounting Technique for Studying Cell Chromosome Fixed cellsDiffusionFixation Aging 制片Chromosome Banding technol

25、ogy Conception Method of Chromosome Banding G Banding technology(EDTA-胰蛋白酶法胰蛋白酶法)R Banding technology Roast sliceEDTA-trypsinGiemsa stainingMounted sliceMounted sliceEarles liquidGiemsa staining 显带、染色 G G带 R带Structure and Nomenclature of chromosomebandRegion1Region2Region3pq Structure Nomenclature缩写

26、缩写addaceCcencpdelderdicdminduphsriidemider:意意 义义不明来源的额外物质不明来源的额外物质无着丝粒碎片无着丝粒碎片体质性异常体质性异常着丝粒着丝粒混合性核型混合性核型缺失缺失衍生染色体衍生染色体双着丝粒染色体双着丝粒染色体双微体双微体重复重复均匀染色体均匀染色体等臂染色体等臂染色体同前的同前的等臂衍生染色体等臂衍生染色体断裂断裂断裂后重接断裂后重接缩写缩写idicinsinvmarmnrrobmlslsdlttac？/意意 义义等臂双着丝粒染色体等臂双着丝粒染色体插入易位插入易位倒位倒位标记染色体标记染色体众数众数环状染色体环状染色体罗伯逊易位罗伯逊易

27、位主系主系干系干系旁系旁系易位易位端粒联合端粒联合表示不确定表示不确定用来分隔两个克隆用来分隔两个克隆多拷贝重排染色体多拷贝重排染色体Group and Karyotype for normal ChromosomeFemale:46，XXMale:46，XYAbnormal Chromosome and diseases l 约约55%的的AML患者可检出克隆性染色体异常患者可检出克隆性染色体异常l 分子遗传学技术的进展使得多数分子遗传学技术的进展使得多数AML患者检出基因水平的患者检出基因水平的异常，如异常，如FLT3、CEBP及及NPM1基因的突变基因的突变l 遗传学异常对于理解遗传学异

28、常对于理解AML发病机制、建立新的诊断方法、发病机制、建立新的诊断方法、研发治疗药物或指导临床治疗有重要的价值研发治疗药物或指导临床治疗有重要的价值l 在在WHO分型建议中，一些特殊的遗传学异常被列为诊断和分型建议中，一些特殊的遗传学异常被列为诊断和分型的依据分型的依据l AML：50%90%的患者细胞遗传学可检出异常克隆的患者细胞遗传学可检出异常克隆l ALL：大约：大约60%85%的患者可检出克隆性染色体畸变的患者可检出克隆性染色体畸变细胞遗传学细胞遗传学C Abnormal number Abnormal structureAbnormal structure of Karyotype：

29、Congenital and Acquired CongenitalAcquiredDescription of Abnormal Karyotype the mode of recording Chromosome 1p33.11 1p33.11 1 1号染色体短臂号染色体短臂3 3区区3 3带带1 1 亚带亚带1 1 Description of Karyotype 46,XX,t(8;21)(q22;q22)46,XX,t(8;21)(q22;q22)20 20AML常见染色体异常t(8;21)10%t(15;17)8%inv(16)/t(16;16)5-10%11q23异常3-5%30

30、45205单一异常：单一异常：45%2种异常：种异常：55%-5/5q-；-7/7q-；8；-Y；+11；+13；+21;+223q26；del(9q)t(6;9)；t(9;22)等等t(8;21)(q22;q22)l 见于约10%AML，形成8号染色体上的AML1-ETO 融合基因l CR率高，EFS长，预后相对较好 l 20%-30%伴KIT突变，复发率增高，预后较差l 75%伴性染色体丢失及del(9q)等附加异常，伴性染色体丢失不影响预后，伴del(9q)提示预后不良AML-M2 t(8;21)(q22;q22),9q-,-Yt(8;21)(q22;q22)模式图Common abno

31、rmity of AML chromosomet(15;17)(q22;q12)l 见于8-10%AMLl 对全反式维甲酸敏感，生存期长l 分子生物学特征：l易位形成易位形成PML/RAR融合基因，是融合基因，是APL特异性的分子生物学标志特异性的分子生物学标志lPML/RAR对对APL诊断具有高度特诊断具有高度特异性，也是治疗的分子基础异性，也是治疗的分子基础 AML-M3+8,t(15;17)AML-M3 t(11;17)17q22(RARA)4q12FIP1L15q35NMP111q13NuMA115q22PML17q11STAT5b 17q24PRKAR1A11q11PLZFATRA敏

32、感敏感 ATRA耐药耐药ATRA相对耐药相对耐药 对对ATRA敏感性未定敏感性未定 CML t(9;22)(q34;q11)inv(16)(p13;q22)/t(16;16)(p13;q22)l 见于约5%AML、20%AML-M4及100%AML-M4Eol 遗传学特点：l因因16号染色体较小及带型的限制，常规核型分析容易漏诊号染色体较小及带型的限制，常规核型分析容易漏诊l有典型形态学改变及常见继发性异常的患者须行有典型形态学改变及常见继发性异常的患者须行FISH或或PCR检测检测CBF/MYH11融合基因融合基因l常伴继发性异常：常伴继发性异常：+8，+21，+22l约约30%患者亦存在患

33、者亦存在KIT突变，复发率增高、预后欠佳突变，复发率增高、预后欠佳 l 化疗敏感，预后相对好，易发生CNSLAML-M4Eo 骨髓象AML-M4Eo+8,inv(16)FISH检测inv(16)inv(16)模式图 等的等的急性白血病预后不好急性白血病预后不好细胞遗传学细胞遗传学C有丝分裂相少或缺如有丝分裂相少或缺如染色体质量低劣，显带不佳染色体质量低劣，显带不佳染色体异常复杂染色体异常复杂细胞遗传学细胞遗传学C荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISHFISH）利用已知核酸序列作为探针，以荧光素直利用已知核酸序列作为探针，以荧光素直接标记后与靶接标记后与靶DNADNA进行杂交，最后在荧光进行杂交，

34、最后在荧光显微镜下观察杂交信号，从而对标本中待显微镜下观察杂交信号，从而对标本中待测核酸进行定性、定位和定量分析测核酸进行定性、定位和定量分析细胞遗传学细胞遗传学C荧光原位杂交(FISH)l 生命科学中的“钓鱼”技术l原理：通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交l 目的：获得细胞内多条染色体或多种基因状态的信息荧光标记探针探针变性样本DNA变性杂交荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）细胞遗传学细胞遗传学C细胞遗传学C荧光原位杂交（FISH）探针类型 双色单融合（Dual Color,Single Fusion）双色双融合（

35、Dual Color,Dual Fusion）双色分离（Dual Color,Break Apart）额外信号（Extra Signal）建议与染色体核型分析同时送检细胞遗传学细胞遗传学C双色单融合示意图细胞遗传学细胞遗传学C细胞遗传学细胞遗传学CFISH检测BCR/ABL融合基因BCR/ABL 基因正常BCR/ABL基因融合9号22号双色单融合探针，检测染色体易位ablbcr细胞遗传学细胞遗传学CBCR/ABL双色双融合探针双色双融合探针细胞遗传学细胞遗传学CBCR/ABL额外信号探针 Role of Sex Chromosome in ALLO-BMT(异基因骨髓移植)X，XX，Y细胞遗传

36、学细胞遗传学C细胞遗传学细胞遗传学CFISH检测可以弥补染色体不足，染色体检测为阴性，检测可以弥补染色体不足，染色体检测为阴性，FISH可能为阳性。可能为阳性。细胞遗传学细胞遗传学C1）染色体是独立的预后指标并有助与治疗方案的选择）染色体是独立的预后指标并有助与治疗方案的选择 与急白预后相关的细胞遗传学亚型与急白预后相关的细胞遗传学亚型预后等级预后等级 核核 型型AMLALL低危低危t(8;21)、t(15;17)、inv(16)正常核型、正常核型、+8、+21、+22、11q2350的超二倍体、的超二倍体、t(12;21)中危中危异常、异常、del(9q)、del(12p)、-y正常核型、正

37、常核型、6q-、t(10;14)、t(11;14)高危高危-5、-7、del(5q)、3q重排、重排、复杂异常（复杂异常（3 3种异常）种异常）t(9;22)、t(8;14)、t(4;11)、亚亚二倍体二倍体/近单倍体近单倍体细胞遗传学细胞遗传学C2）鉴别白血病微小残留病灶）鉴别白血病微小残留病灶(minimal residual leukemia，MRL)白血病化疗或骨髓移植后达到完全缓解 体内残存微量白血病细胞106-108 检测到原已消失的克隆性染色体异常和(或)新的克隆性染色体异常时，往往预示疾病将复发3)在骨髓增生异常综合征在骨髓增生异常综合征(MDS)中的应用中的应用21.510.

38、50 中间中间（其他异常）（其他异常）预后不佳预后不佳（-7，或复杂，或复杂染色体异常）染色体异常）国际预后积分系统（国际预后积分系统（IPSS）4)在淋巴瘤中的应用在淋巴瘤中的应用5）在其他血液病中的应用）在其他血液病中的应用 真性红细胞增多症（真性红细胞增多症（PVPV）常见的染色体异常有del(2v)(q11)，+8和+9，可见于PV病程的始末。原发性骨髓纤维化原发性骨髓纤维化常见的染色体异常为-7，-9，+8，+2或lq、13q等结构异常。在多发性骨髓瘤（在多发性骨髓瘤（MM)中的应用中的应用 预后不良预后不良 预后中等预后中等 预后良好预后良好 del(17p13)、1q21复制、t

39、(4;14)、t(14;16)del(13q14)只有t(11;14)、6，9，17或没有细胞遗传学异常 The role of chromosome in Disease Monitoring2Ph，+8，i（17q）noAbnormal chromosome recurrence CML in blastic phase:6）新的异常染色体的出现常提示复发）新的异常染色体的出现常提示复发分子生物学分子生物学MDohner,H.et al.Blood 2010;115:453-474 在在AML 中中,基因突变与细胞遗传学异常一样普遍基因突变与细胞遗传学异常一样普遍AML基因突变基因突变分子

40、生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分分子子生生物物学学M分分子子生生物物学学M凝胶电泳检测定性检测定量检测RQ-PCR检测分子生物学分子生物学M分子生物学M融合基因BCR/ABL：t(9;22)(q34;q11)PML/RAR：t(15;17)(q22;q21)AML1/ETO：t(8;21)(q22;q22)TEL/AML1：t(12;21)(p13;q22)E2A/PBX1：t(1;19)(q23;p13)分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分子

41、生物学分子生物学M血液病分子诊断的意义补充MIC检查的不足检测相关微小残留病灶（MRD）发现新的亚型研究各类血液病发病机制分子生物学分子生物学M1.AML1/EAP(1)2.AML1/ETO(1)3.AML1/MDS1(2)4.BCR/ABL(4)5.CBF/MYH11(8)6.DEK/CAN(1)7.dupMLL(5)8.E2A/HLF(3)9.E2A/PBX1(2)10.FIP1L1/PDGFR(4)11.MLL/AF10(18)12.MLL/AF17(1)13.MLL/AF1p(4)14.MLL/AF1q(4)15.MLL/AF4(12)16.MLL/AF6(4)17.MLL/AF9(8

42、)18.MLL/AFX(4)19.MLL/ELL(8)20.MLL/ENL(4)21.NPM/ALK(1)22.NPM/MLF1(1)23.NPM/RAR(2)24.PLZF/RAR(2)25.PML/RAR(5)26.SET/CAN(1)27.SIL/TAL1(1)28.TEL/ABL(2)29.TEL/AML1(2)30.TEL/PDGFR(1)31.TLS/ERG(5)分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分

43、子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学MFLT3ITD NPM1+预后较好FLT3ITD+NPM1+或 FLT3ITD NPM1 预后中等FLT3ITD+NPM1 预后较差急髓相关突变检测急髓相关突变检测CEBPA基因位于19q13.11，CCAAT盒/增强子结合蛋白，粒细胞分化过程中起重要作用，预后良好c-KIT基因位于4q11-21，t(8;21)和inv(16)伴c-KIT突变在AML预后危险分级中由“低危”升级为“中危”N-Ras为Ras基因家族成员之一

44、，见于10%左右的M4、M5、M6，该突变预后意义尚不明FLT3-TKD，Fms样酪氨酸激酶3-TK区域点突变，13q12，预后不良分子生物学分子生物学MAML患者常见基因突变和异常表达的预后意义分子生物学分子生物学M骨髓增殖性肿瘤骨髓增殖性肿瘤检测项目检测项目检测平台检测平台检测意义检测意义JAK2 V617F突变荧光PCR90%以上PV以及50%ET/PMF有JAK2V617F突变，鉴别诊断JAK2 539-544突变测序少数PV患者有JAK2 539-544突变MPL W515K/L突变测序少数ET/PMF患者有MPL 突变BCR/ABL P210定量BCR/ABL P230定量定量PC

45、R区分CML和MPNFIP1L1/PDGFR 定量定量PCR见于嗜酸性粒细胞增多综合征，判断TKI治疗效果31种融合基因筛查多重PCR适合临床情况不明的患者分子生物学分子生物学M骨髓增生异常综合征骨髓增生异常综合征NCCN提及的提及的MDS分子检测项目分子检测项目 TET2突变，见于20%MDS，预后较好 ASXL1突变，见于15%MDS，预后较差 RUNX1突变、EZH2突变、ETV6突变，预后较差 CBL突变、IDH2突变、U2AF1/U2AF35突变、SF3B1突变 SRSF2突变、ZRSR2突变，预后较差，增加白血病转化率分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学M分子生物学分子生物学

46、MMRDMRD主要检测方法比较主要检测方法比较方法方法覆盖范围覆盖范围敏感度敏感度备注备注实时定量实时定量PCR30-40%10-5-10-6只能针对特定的融只能针对特定的融合基因或基因突变合基因或基因突变流式细胞术流式细胞术微小残留检测微小残留检测大于大于90%10-3-10-4不适用于不适用于CMPDFISH30%10-3需要特定的染色体或需要特定的染色体或基因异常，且有相应基因异常，且有相应探针探针染色体核型分析染色体核型分析50%10-2需要培养细胞到分需要培养细胞到分裂中期报告时间较裂中期报告时间较长长血液肿瘤初诊检测方案建议MICM整合报告整合报告AL系别不清形态学流式细胞术免疫分

47、型骨髓染色体核型分析分子生物学白血病31种常见融合基因通筛血液肿瘤初诊检测方案建议-AL2525个以上抗原，包括粒系、单核系、个以上抗原，包括粒系、单核系、T T系、系、B B系、非系列特异性、干细系、非系列特异性、干细胞（原始细胞）相关以及其他细胞等各种标志；除可以进行系别鉴定、胞（原始细胞）相关以及其他细胞等各种标志；除可以进行系别鉴定、亚型判断外，还可进行一定的预后评估。亚型判断外，还可进行一定的预后评估。FAB分类分类CD13CD33CD11bCD14HLA-DRCD34CD117MPOM0+/-+M1+-/+-+M2+-+/-+M3+-+M4+/-+/-+M5a+/-+/-+/-+-

48、/+M5b+-/+M6+/-+/-+或-+/-+M7-+/-+?-可以宏观、全面地检查细胞内所有染色体的各种可以宏观、全面地检查细胞内所有染色体的各种异常，但对于一些微小异常或隐匿性易位以及低含量异常，但对于一些微小异常或隐匿性易位以及低含量的异常难以查出。的异常难以查出。此外，由于标本本身等各种原因的影响，会有一此外，由于标本本身等各种原因的影响，会有一定比例的无分裂相出现。定比例的无分裂相出现。建议必要时配合行建议必要时配合行FISHFISH检测。检测。诊断相关类：诊断相关类：AML1/ETO：多见于：多见于M2，少见于，少见于M4和和M1；M2b中最多中最多RAR相关融合基因：相关融合基

49、因：M3PML/RARPLZF/RARNPM/RARCBF/MYH11：M4Eo用药相关类：用药相关类：BCR/ABL：格列卫：格列卫PML/RAR：全反式维甲酸（：全反式维甲酸（ATRA）NPM/RAR：全反式维甲酸（：全反式维甲酸（ATRA）AML1/ETO：大剂量的阿糖胞苷：大剂量的阿糖胞苷CBF/MYH11：大剂量的阿糖胞苷：大剂量的阿糖胞苷ALLT、B等不清骨髓形态学流式细胞术免疫分型细胞遗传学检测基因诊断急淋15种常见融合基因筛查或者融合基因BCR/ABL、E2A/PBX1、TEL/AML1、MLL/AF4定量检测血液肿瘤初诊检测方案建议-ALL流式细胞术免疫分型：T系：CD1a、

50、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、cCD3、TCR、TCR等B系：CD10、CD19、CD20、CD22、cIgM、cCD79a等NK系：CD16、CD56、CD57等ALL-FISH套系：t(9;22)：预后极差11q23重排：预后差t(12;21)：预后好+4：预后好+10：预后好ALL融合基因（建议查定量，但个别基因未开展定量检测）：BCR/ABL：预后极差E2A/PBX1：常见于B-ALL，预后不良TEL/AML1：预后较好MLL/AF4：预后不良1p32染色体内微缺失SIL/TAL1：常见于T-ALL淋巴瘤白血病形态学流式细胞术免疫分型骨髓染色体核型分析/FISH套系基

51、因诊断TCR基因重排/IgH基因重排/t(11;14)bcl-1-JH融合基因定性/t(14;18)bcl-2-JH融合基因定性血液肿瘤初诊检测方案建议-淋巴瘤白血病CLL-FISHCLL-FISH探针：探针：ATMATM：缺失则中位生存期：缺失则中位生存期7-97-9个月个月P53P53：缺失中位生存期为：缺失中位生存期为3232个月个月RB1RB1：缺失则中位生存期：缺失则中位生存期133133个月个月13q1413q14：缺失则中位生存期：缺失则中位生存期133133个月个月D13S25D13S2512cen12cen正常正常FISHFISH组合结果中位生存期组合结果中位生存期11111

52、1个月个月淋巴瘤FISH探针：Bcl-2重排t(8;14)：Burkitts淋巴瘤t(11;14)：套细胞淋巴瘤Bcl-6重排：弥漫大B淋巴瘤t(11;18)：结外边缘带淋巴瘤t(14;18)：滤泡型淋巴瘤、弥漫大B淋巴瘤IgH重排MDS骨髓形态学流式细胞术免疫分型骨髓染色体核型分析基因诊断WT1基因定量、血液肿瘤初诊检测方案建议血液肿瘤初诊检测方案建议-MDS-MDSMDS-FISH探针套系：20q-：预后好+8：预后中等-7/7q-：预后差-5/5q-：单独则预后好，伴其他则预后差-Y：预后好CMPD是一组造血干细胞异常增殖性疾病，在髓细胞普遍增生的基础上有某个系列细胞尤其突出，呈现持续不

53、断地过度增殖，临床上常有肝脾大，尤其以脾大多见，病程缓慢。主要介绍：真性红细胞增多症（PV）原发性血小板增多症（ET）原发性骨髓纤维化（PMF）慢性粒细胞白血病（CML）血液肿瘤初诊检测方案建议-CMPD血液肿瘤初诊检测方案建议血液肿瘤初诊检测方案建议-CMPD-CMPDCMPD相关异常（外周血象、骨髓象）相关异常（外周血象、骨髓象）阴性阴性阳性阳性JAK2基因突变基因突变阴性阴性阳性阳性PV、ET、PMFHES/CEL、SMCML诊断可能诊断可能BCR/ABL融合基因融合基因（FISH、PCR）血液肿瘤初诊检测方案建议血液肿瘤初诊检测方案建议-CMPD-CMPD红细胞增多JAK2 V617F

54、突变筛查JAK2 V617F(+)JAK2 V617F(-)EPO正常或升高EPO降低JAK2 exon12突变JAK2 exon12(-)JAK2 exon12(+)考虑其他因素：P50测定；EPO受体测定；骨髓活检PV其他因素引起的后天或先天性红细胞增多症PVPV诊断流程血液肿瘤初诊检测方案建议血液肿瘤初诊检测方案建议-CMPD-CMPD血小板增多JAK2 V617F突变筛查JAK2 V617F(+)JAK2 V617F(-)骨髓活检或细胞遗传学检查巨核细胞；缺乏诊断为PV,PMF,CML,MSD或者髓系肿瘤WHO的标准MPL W515L/K突变MPL W515L/K(+)MPL W515

55、L/K(-)高度怀疑ETET不能排除，考虑其他的因素：细胞遗传学；骨髓活检；缺乏Ph染色体时，应用FISH检测BCR/ABLET诊断流程血液肿瘤初诊检测方案建议-CMPD额外骨髓造血的骨髓纤维化JAK2 V617F突变筛查JAK2 V617F(+)JAK2 V617F(-)缺乏诊断为PV,CML,MSD或者髓系肿瘤WHO的标准MPL W515L/K突变MPL W515L/K(+)MPL W515L/K(-)高度怀疑PMFPMF不能排除时，考虑其他的因素：Ph染色体；其他染色体畸形；TPO测定PMF诊断流程疾病疾病融合基因融合基因/基因突变基因突变临床意义临床意义慢性粒细胞白血病BCR/ABL(

56、P210,P230)定性检测可辅助CML的诊断，该基因阳性的患者可用格列卫进行治疗，并可进行疗效监测和微小残留检测BCR/ABL(P210)定量检测真性红细胞增多症JAK2/V617F突变定性/定量检测可辅助CMPD疾病的诊断，可进行疗效监测和微小残留检测原发性骨髓纤维化JAK2 exon12突变定性检测原发性血小板增多症MPL W515L/K突变定性/定量检测嗜酸性粒细胞综合征FIP1L1/PDGFR定性检测ETV6/PDGFR定性检测常见于高嗜酸性细胞综合征/嗜酸性细胞白血病，阳性者对格列卫治疗有效血液肿瘤初诊检测方案建议-CMPD微小残留病灶指的是疾病集中的部位或是综合病症、感染的主要部

57、位。血液肿瘤微小残留病灶是指血液肿瘤治疗达到完全缓解后，用常规的形态学检测方法不能检测到明显的肿瘤病灶，而此时体内仍存在的少量肿瘤细胞。微小残留病灶是肿瘤复发的直接原因。因此，定期进行微小残留病灶的检测，对于监测疗效、早期发现复发倾向、及时干预、防止复发等方面有很重要的意义。血液肿瘤治疗后残留检测建议骨髓形态学流式细胞术微小残留病灶检测（请在申请单上注明亚型，最好附初诊免疫分型报告；CMPD除外）查染色体核型分析或进行特异性FISH检测查特异性融合基因/基因突变定量、WT1基因定量等此外，还应进行耐药相关检测血液肿瘤治疗后残留检测建议流式细胞术检测微小残留病灶依据为是否违背细胞正常分化模式：表

58、面抗原系列的变异；表面抗原表达不同步；表面抗原表达的缺失；表面抗原强度的异常。举例：举例：患者，男，45岁，体检发现白细胞，高入院。血常规：WBC90109/L,HB80g/L,plt90109/L，幼稚细胞82%。有核红细胞3个/100个wbc.骨髓像：M5。细胞化学染色：POX阳性，a-NAE、aNBE阳性，且被氟化钠抑制。免疫分型：考虑急性髓系白血病。表达CD13、34、38、117，HLA_DR；少量表达CD3、64、11b；单核细胞群占1847%。倾向M4。染色体：46，xy，t（3,3）（q26.2；q21）【20】髓系融合基因：均阴性。预后相关基因检测：未突变。本章小结本章小结 熟悉血液病熟悉血液病MICM的检验方法及临床意义的检验方法及临床意义 掌握掌握MICM检测中各种检验方法的优缺点检测中各种检验方法的优缺点 熟悉各种血液病的诊断方法及步骤熟悉各种血液病的诊断方法及步骤