分子克隆实验

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1、分子克隆实验设计一、总体实验流程二、实验内容（一） PCR （聚合酶链式反应）1. 原理：利用DNA在体外摄氏95度时解旋，45-60度时引物与单链按碱基互补配对的原则结合， 再调温度至72度左右，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5-3）的方向合成互补链。2. PCR操作：反应体系：l Template1ulPrimerl1ulPrimer21ul2*Taq master MIX25ulH2O22ul，Total50ul反应条件：94C5min94 C30s -58 C30s K40 cycles72 C40sL72C5min（二）琼脂糖凝胶电泳1. 原理：琼脂糖凝胶具有网络结构，分子通过时会受

2、到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大， 因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大 小。2. 凝胶电泳步骤：1）称取0.5g琼脂糖至50ml电泳缓冲液（TAE）中，摇匀；同时装置制胶架。2）加热至琼脂糖完全融化，期间停止加热摇动3次，即无可见漂浮物，澄清为止。3）加入1ulEB染液，充分摇匀。4）缓慢倒入制胶架内，冷却30-60min，至凝胶充分凝固，放入电泳槽中即可使用。5）使用时，将样品点入相应的加样孔内，即可开始电泳，待指示剂位于整块凝胶23位置 时，停止电泳，在紫外灯下观察样品条带。（三）切胶回收（天根生化公司凝胶回收试剂盒）1. 将空小离心管称

3、重。将回收的带DNA片段的凝胶放入其中、再次称重，确定凝胶净重。2. 将离心管中的凝胶捣碎以助于凝胶溶解。按胶的重量加入三倍体积的Extraction buffer （1mg 凝胶加 3 u l Extraction buffer ）。3. 55恒温加热直到凝胶完全融化（5-15分钟），每隔2-3分钟需将管内混悬液混匀一次。4. 按照1： 1比例加入异丙醇（1mg凝胶加1 u l异丙醇），混匀。5. 将混合液全部移入Spin column、6000rpm离心1分钟，弃去接液管中的液体。6. 向 Spin column 中加入 500 u l Extraction buffer，12000g 离

4、心 30-60 秒，弃去接液管中的液 体。7. 向Spin column中加入650 u l Wash buffer， 12000g离心30-60秒，弃去接液管中的液体。8. 重复步骤7 一次。9. 再次将Spin column离心1分钟后，小心去除残留的液体，将其移入一无菌的1.5ml的离 心管中。10. 加入50 u l的Elution Buffer，室温静止1分钟，12000g离心1分钟回收DNA样品。（四）连接T载体1. 反应体系ComponentVolumeVector pTZ57R/T, (0.17 pmol ends)3 pl5X Ligation Buffer6 plPCR p

5、roduct (0.52 pmol ends)variable*Water, nuclease-freeto 29 plT4 DNA Ligaser ipiTotal volume30|jl2. 将连接混合物在室温（22C）孵育1h。如果转化需要达到最大值，4C孵育过夜。3. 用2.5ul连接混合物直接进行细菌转化。（五）转化1. 取感受态细胞至于冰浴中融化。2. 向感受态细胞悬液中加入5ul连接产物，轻轻旋转离心管混匀，冰浴30min。3. 将离心管置于42度水浴中60-90S，然后快速将离心管转移至冰浴中，使细胞冷却2-3min， 该过程不要摇动离心管。4. 向离心管中加入600ul无菌的

6、LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37度摇床上震荡培 养45min，使菌体复苏。5. 分别吸取100ul和300U1，均匀涂布于LB固体培养基上（含抗生素），将平板置于室温直 至液体被完全吸收，之后转移至37度，倒置培养12-16h。（六）挑菌与摇菌1. 使用黄色200U1枪头，挑取单个形态良好的克隆，直接连同枪头打A5m1 LB培养基中。每 支LB培养基只能打入一个单克隆。2. 加入 50u1 Amp。3. 封好管口，固定放置在37度摇床，振摇12-16h。（七）质粒提取（天根生化公司质粒小量提取试剂盒）1. 柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500U1的平衡液BL，1

7、2,000 rpm（13,400Xg ）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用 当天处理过的柱子）2. 取1-5 ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000 rpm（13,400X g ）离心1 min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管 中）。3. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250 U1溶液P1 （请先检查是否已加入RNase A），使用 移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。4. 向离心管中加入250 U1溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DN

8、A，造成提取的质粒中混有基因 组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如 果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。5. 向离心管中加入350 U1溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现 白色絮状沉淀。12,000 rpm （13,400Xg ）离心 10 min。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再 次离心后取上清。（八）酶切与鉴定通过双酶切法对提取的质粒进行酶切，并将酶切产物凝胶电泳进行鉴定。（九）实验结果1. 通过PCR成功获得了目的基因，凝胶电泳条带较清晰，没有杂带。

9、2. 转化摇菌涂板后，平板上菌落数较少，仅十余个，有的板上甚至一个都没有。但菌落比 较一致。可能是涂板时涂布棒没能完全冷却，杀死了菌体；也可能是摇菌时间不够，菌 液浓度偏低。3. 对提取的质粒进行酶切鉴定，酶切质粒凝胶电泳结果只有一条带，而未经酶切的质粒有 两条带（见下图）。分析可能是某个酶有问题，导致质粒只有一个切口。A： D2000Marker； B：未酶切质粒；CE:酶切质粒（C、E、F分别为酶切模板3u1、4u1、5u1）（十）讨论1.在进行PCR、酶切的实验中，应该注意设置对照组，以便排除一些实验干扰因素，保证结果的可信性。2. 在凝胶回收中，切胶要准确，对于又杂带的情况，要判断目的条带（实验中常遇到杂带 比目的条带亮的情况，要注意区分）。切胶要切全，不然回收量不够，但尽量减少多余 的胶，否则影响纯化效果。3. 在涂板时，应注意无菌操作，尽量避免杂菌的污染。涂板时，涂布棒烧灼后一定要等冷 却了再涂菌，防治杀死菌体，涂板也要均匀。涂板时根据菌液浓度，确定相应的涂菌的 量。4. 提取的质粒凝胶电泳条带为两条、三条均为正常现象。出现几条带的原因可能是质粒存 在几种状态：螺旋缠绕、质粒环展开和质粒环断开等等。但经过双酶切酶，正常也应该 出现多条带（主要是目的基因带和T载体带），选择的酶不同，条带的大小也不同。