人子宫内膜细胞原代体外培养方法

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1、己加入收藏夹向本刊在线投稿向本刊在线投稿人子宫内膜细胞原代体外培养方法首席医学网 2007年12月20日22:32:33 Thursday45作者：秦莉花，秦明春，李晟，王若光，刘小丽，李春梅，吴长虹 作者单位：(1 .湖南中医药大学2 0 0 4级研究生班，湖南长沙4 1 0 0 0 7； 2.湖南中医药大学，湖南长沙4 1 0 0 0 7 )摘要) 目的改良人子宫内膜细胞原代体外培养方法的建立，并对其进行特征鉴定。方法将选择的子宫内膜组织 机械法分离，复合酶消化，传代自然增殖法纯化细胞，进行单层培养。通过倒置显微镜观察其大体形态， HE染色观察其胞核情况，免疫细胞化学染色法对间质细胞(en

2、dometrial stromal c ell，ESC )及上皮细胞(endometrial glandular epithelial c ell，EEC)进行鉴定。结果培养的子宫内膜细胞均有ESC和EEC两种形态细胞EEC和E【关键词】 原代人子宫内膜细胞；免疫细胞化学；体外细胞培养Establishment of Method for Human Endome trial CellCulture in VitroQIN Lihua，QIN Ming chun，LI Sheng，WANG R uoguang，LIU Xiaoli，LI Chunmei，WU Chang hong(TCM Un

3、iversity of Hunan，Changsha，Hunan 4 10007，Chian)Abstract) Objective To improve the metho d for endometrial cell culture in vitro and identif ication of the cells. Methods Human endometria l tissues were separated mechanically，dige sted by complex enzyme，purified by passage and monolayer cultured. The

4、 cellular morph ology was observed by inverted phase contr ast microscope，the nucleus and cytoplasm w ere observed by staining of haematoxylin a nd eosin(HE)； Endometrial stromal cell and e ndometrial glandular epithelial cell were identified by the method of immunocytochem istry of cytokeratin (CK1

5、8) and vimentin(Vi m). Rusults Both endometrial stromal cell (E SC) and endometrial glandular epithelial c ell(EEC) were existed in the culture； EEC a nd ESC stained by CK18 and Vim McAb in the b rownyellow were positive cells. ConclusionThe endometrialcellisculturedsuccessfullyinVitroandthemethodis

6、establishedWithhighsurViValrateandloWcost，whichcontributestoinVestigateendometrialfunctionandadjustincellandmolecularleVel.KeyWordshumanendometialcell；immunocytochemistry；cellcultureinVitro子宫内膜作为性激素作用的靶器官，通过子宫内膜细胞进行体外培养，观察子宫内膜 对激素、各类药物细胞因子的作用，在妇产科疾病的研究中占有重要的地位。但对子宫内膜 腺上皮细胞（endometrial glandular epit

7、helial ce 11, EEC）及间质细胞（endometrial stromal cell, ESC） 的培养，各家报道的方法不一，方法简单者细胞纯度不高，方法复杂者经多次过滤等操作 增加了污染的可能性。本研究旨在探索建立一种较简便、纯度高的子宫内膜细胞体外培养方 法，为从细胞和分子水平方面研究子宫内膜的各种功能及干预调节奠定基础。现将实验方法 及结果报道如下。1材料与方法1.1材料1.1.1子宫内膜组织标本的获取标本来自于湘雅附三医院和省妇幼保健院不孕症 诊刮术，或子宫肌瘤子宫全切除的患者，均无其它内分泌疾病，年龄2 53 5岁，月经周 期规则，手术前3个月内未服用过激素类药物，如避孕

8、药、氟灭酸等影响内分泌的药物，术 中获取子宫腔前、后壁正常内膜各2条。将刮取的内膜组织置入盛有400 U/mL青霉 素，100 U/mL链霉素的冰D hanks液无菌瓶中，并在低温条件下30 min 内送实验室进行处理培养。另取部分内膜组织用10%中性甲醛固定后送病理学检查，经组 织学证实为正常子宫内膜者进行实验，不符合者舍弃。内膜组织学分期与实际月经周期相符。1.1.2 试剂 DMEM/F12培养基（Hyclone公司），新生胎牛血清（三 利生物制品厂）；胰蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶I （均为Sigma公司生产）；鼠抗 人波形蛋白单克隆抗体（Vim，ZM 0 0 7 3 ）、鼠抗人细胞角蛋白

9、18（CK18, ZM 0 2 6 0 ）单克隆抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒、浓缩型DAB试剂盒 （均为北京中杉金桥生物技术有限公司生产）。1.1.3仪器 水套式CO2培养箱（2 3 0 0型，SHEL LAB生产）；超净 工作台（SWCJ IF，苏州安泰空气技术公司）；倒置显微镜（XD1 01型，南 京江南光电股份有限公司）；台式多管自动平衡离心机（TDZ5WS，长沙平凡仪器仪 表有限公司生产）。1.2方法1.2.1子宫内膜细胞的原代培养1将挑取的子宫内膜组织，在Dhank s液中反复涮洗，去除血污，剪成1 mm3（肉眼成糊状）左右的小块，加入3倍体积的 复合消化酶（0.2 5%胰

10、蛋白酶一EDTA、0.1%胶原酶、0 .1%透明质酸酶） 充分混匀后置3 7 C恒温水浴静置消化2 0 min，留上清液于无菌离心管中，并加入含 2 0%无菌小牛血清的DMEM/F12培养液终止上清液消化。同法再消化6次，每次20 min, 1 0 0 0 r/min离心5 min,弃上清液，用巴氏吸管吹打成细胞悬液， 光镜下见组分主要为核直径2 5 呻的球型细胞（DSC），台盼蓝染色证明细胞存活率 达95%以上。用滴板计数并调整细胞浓度，以5.0x105个/mL接种于盛有DM EM/F12培养液的25 cm2一次性培养瓶中，置37 C. 5%CO2、99%湿度 的CO2培养箱中培养过夜。次日

11、换液，清除污染的红细胞和未贴壁细胞。继续培养时，每 48 h换液。待细胞融合后即可用胰蛋白酶一EDTA消化传代。1. 2. 2子宫内膜细胞形态学观察用倒置显微镜观察培养的子宫内膜细胞的形态及 生长规律并拍照。1. 2. 3子宫内膜细胞HE染色细胞爬片的制备：将传代的细胞消化制成细胞悬 液，接种到放置经多聚赖氨酸包被过的装有盖玻片的6孔培养板中，贴壁后换液继续培养， 待细胞长成单层后取出盖玻片，用一20 C纯丙酮固定30 min，晾干，室温保存备用； 染色、封片；光镜下观察。1.2.4子宫内膜细胞免疫细胞化学 细胞爬片的制备（方法同HE染色）；分 别加入按1：50稀释的Vim和CK18，4 C冰

12、箱过夜，并设阴性对照组（用PBS 代替一抗），采用链霉亲合素一生物素一过氧化物酶法（SABC）染色；光学显微镜观 察。2结果2.1不同消化时间的子宫内膜细胞培养及生长情况细胞接种2 4 h后大部分都能贴壁。随着消化时间的延长，各个时间间段的细胞数量及 形态均在不断发生改变，当消化20.40 min的细胞虽然数量比较多但其中大多数是 红细胞。培养34 d之后，红细胞开始崩解，死细胞也增多，活细胞减少，未见细胞有 明显增生现象，无法铺满瓶底，最终细胞也会消失。消化120、140 min时，只有 极少量细胞存在，且随着培养时间延长大多成死细胞。由于细胞数量极少而无法铺满瓶底， 细胞会消失，最终消化2

13、 0、40、120、140 min的细胞都没有培养成功。消化 60100 min之间的红细胞相对比较少，且细胞纯度比较高。原代细胞生长很慢， 但经首次传代后生长旺盛，57 d可以铺满。2.2子宫内膜细胞生长的形态学特点消化6 010 0 min的细胞中均有两种形态的细胞存在，一种是ESC，呈多边形 或梭形，培养初期呈极性生长，培养34 d后细胞排列无极性，平铺生长，呈现中间稍 宽、两端尖的形态，外形轮廓不甚清楚，细胞之间平行排列居多，细胞质薄而透明，核居中， 呈圆形或椭圆形（图1）。另一种细胞是EEC，呈多角形或蝌蚪形，培养56 d后 细胞呈漩涡状排列，细胞间出现拉网现象，排列紧密，且常围绕成

14、细胞小团，细胞轮廓清晰， 细胞质呈颗粒状，核圆而大，核仁明显（图1、）。增殖期的细胞以ESC为主（图1 、）；分泌期的细胞以EEC为主（图1、）。但随着培养时间的延长， ESC细胞伸长呈梭形，具有成纤维细胞形态；EEC形状成长梭形，且EEC寿命比较短， 传代次数少。当平均EEC传第23代，ESC传第79代时，消化传代的细胞大多易 成死细胞或传代后细胞不增殖甚至因细胞衰老不能耐受消化而无法铺满瓶底，最终细胞也会 消失。2.3子宫内膜细胞HE染色结果子宫内膜细胞经HE染色后，细胞形态与活细胞无明显区别。胞核均呈紫蓝色，胞质均 呈粉红色（图2）。2.4子宫内膜细胞鉴定阳性细胞胞质染成棕黄色，核呈蓝色

15、（图2、）。本实验显示分泌期的细胞免 疫细胞化学染色角蛋白阳性细胞90%（图2、）；增殖期的细胞免疫细胞化学染 色波形蛋白阳性细胞95%（图2、）。对照组表达阴性。3讨论3.1培养方法的改进体外培养子宫内膜细胞的报道多采用筛网分离或纯化培养的方法。而本实验采用不分离 而直接混合培养的方法其理由是：人体内子宫内膜细胞包括EEC和ESC,两者相互作 用、影响，ESC具有旁分泌功能，其产生的酶类、功能蛋白和细胞因子调节EEC的分化、 增殖；如果两者分离分别进行体外培养，则将导致人为的割裂两者间相互关系，且不能体现 子宫内膜细胞在人体内的细胞反应情况】2 2 5 6 :近年来，国外学者支持上述观点，

16、并采用EEC和ESC共同培养法进行了研究3；处于增生期和分泌期的子宫内膜细 胞，增生期以ESC为主，分泌期以EEC为主，随着传代及培养时间的延长，最终导致优 势细胞会覆盖劣势细胞，得到纯化；反复经过筛网分离血细胞、EEC和ESC以提高纯 度，其步骤繁琐易污染，细胞损伤大，细胞的活性也大大降低。本方法简化了操作步骤，减 少了细胞损伤，获得的细胞纯度较高，污染很少，方法简单易行。且细胞活力测定细胞存活 率为95%以上，说明上述方法适合子宫内膜细胞的培养、纯化和体外生长。3.2复合消化酶的优势文献报道中，关于培养子宫内膜细胞时，多数单独采用胶原酶或胰蛋白酶对细胞进行消 化。胶原酶作用缓慢、温和，对细

17、胞的消化通常需要23 h，耗时长且主要用于水解结 缔组织中的胶原蛋白成分，获得的细胞活力比胰蛋白酶强，但其价格较高，大量使用将会增 加实验成本。透明质酸酶主要用于分散细胞，甚至在以后的传代中，消化时细胞易于分散不 致成团。胰蛋白酶主要用于消化细胞间质，作用较强，价廉经济，但获得的细胞活性相对低。 另外，EDTA能通过赘合细胞间质中的二价阳离子破坏细胞连接，使细胞分离4。选 用EDTA及胰蛋白酶联合使用可提高消化效率，但EDTA不能被血清中和，消化后须用 离心方法将其去除，否则细胞不易贴壁甚至脱壁。胰蛋白酶及EDTA对子宫内膜细胞消化， 对不需要分离EEC和ESC的共同培养尤为适用2 2 5 7

18、。改良培养方法采用复合消 化酶的最佳消化时间6 010 0 min。故我们采用胰蛋白酶一EDTA、胶原酶及透 明质酸酶复合消化酶进行消化，可以缩短消化时间，容易贴壁，生长迅速，提高细胞活性， 降低培养成本。本实验改良人子宫内膜细胞体外培养方法，简便易行，获得的细胞纯度高、生长稳定， 为进一步研究提供了实验基础。在此基础上可进一步研究子宫内膜细胞的凋亡、胞内细胞因 子的调控及其在子宫内膜疾病中的作用。【参考文献】1苑春莉，韩丽英，胡静，等.人子宫内膜间质细胞的体外培养.吉林大学学报，2004,30 (2):267-269.2 王小敏，黄海鹏，何福仙.简易人子宫内膜细胞培养法及其优点.赣南医学院学报， 2002,12 (3):256 257.3 AkoumA. Jolicoeur C, Boucher A. Estrad iol amplifies interleukin1induced monoc yte chemotactic protein1 expression by ec topic Endometrial cells of women with endo metriosis. J Clin Endocrinol Metab, 2000, 85： 8 9 6 9 0 4.4 薛庆善.体外培养的原理与技术.北京：科技出版社，2 0 0 1:9 4 9 5.