纳米毒理学---医学应用

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1、纳米毒理学纳米毒理学-医学应用医学应用2017-052017-05目录目录 纳米毒理学概述纳米毒理学概述 细胞纳米毒理学细胞纳米毒理学 分子纳米分子纳米毒理学毒理学 动物纳米毒理学动物纳米毒理学 纳米特性与生物效应相关性纳米特性与生物效应相关性 纳米毒理学的纳米毒理学的实验技术与研究实验技术与研究方法方法 纳米毒理学文献举例纳米毒理学文献举例第一部分第一部分纳米毒理学概述纳米毒理学概述纳米毒理学概述纳米毒理学概述传统毒理学 生物医学纳米毒理学=纳米科学 生命科学纳米生物学纳米生物学所有的物质都是毒药，没有无毒的物质，唯有剂量决定之所有的物质都是毒药，没有无毒的物质，唯有剂量决定之（毒理学之父）

2、（毒理学之父）纳米毒理学概述纳米毒理学概述 纳米毒理学定义：纳米毒理学定义：是研究是研究纳米尺度纳米尺度下，物质的物理下，物质的物理化学性质尤其是新出现的纳米特性对化学性质尤其是新出现的纳米特性对生命体系生命体系所产所产生的生的生物学效应生物学效应，尤其是毒理学效应，尤其是毒理学效应 纳米毒理学的目的：纳米毒理学的目的：是以科学的方式描述纳米物质是以科学的方式描述纳米物质颗粒在生物环境中的生物学行为，以及生态毒理颗粒在生物环境中的生物学行为，以及生态毒理学效应。揭示纳米材料进入人类生存环境对人类健学效应。揭示纳米材料进入人类生存环境对人类健康可能的影响。康可能的影响。纳米毒理学研究内容纳米毒理

3、学研究内容 暴露相暴露相 动力相动力相 毒效相毒效相 机理机理 安全性评价安全性评价纳米材料纳米材料(NP)(NP)特征特征 -剂量单位吸附团聚尺寸效应尺寸效应表面效应表面效应量子效应量子效应分散分散-团聚效应团聚效应比表面积效应比表面积效应高表面反应活性高表面反应活性表面吸附颗粒数表面吸附颗粒数浓度效应浓度效应自组装效应自组装效应常见纳米结构材料的应用常见纳米结构材料的应用纳米毒理学概述纳米毒理学概述 -纳米技术纳米技术 纳米技术：纳米技术：是在接近原子尺度是在接近原子尺度(1(1 100 100 nmnm)空间对原子、空间对原子、分子进行操纵和加工，产生性能独特的纳米材料、产分子进行操纵和

4、加工，产生性能独特的纳米材料、产品和器件的品和器件的技术技术 纳米技术应用：纳米技术应用：电子、化妆品、汽车、医疗行业等电子、化妆品、汽车、医疗行业等 纳米技术产品：纳米技术产品：健康和健身健康和健身相关的行业相关的行业-个人护理品、个人护理品、衣服、化妆品、运动产品、防晒剂等衣服、化妆品、运动产品、防晒剂等纳米纳米毒理学发展毒理学发展2003.042003.04，Science-Science-开展纳米尺度物质毒理学研究的必要性开展纳米尺度物质毒理学研究的必要性2003.072003.07，Nature-Nature-编者文章：再次肯定这一研究的必要性，编者文章：再次肯定这一研究的必要性，因

5、不发展将危及政府和公众对纳米技术的信任和支持因不发展将危及政府和公众对纳米技术的信任和支持20012001年，中科院高能物理研究所已提出建议年，中科院高能物理研究所已提出建议20042004年，年，“纳米生物效应实验室纳米生物效应实验室”成立，成立，整合了纳米生物学、稀有金属/重金属毒理组及有机卤素的生物效应与毒理研究组标准的完整的毒理学评价体系的建立与完善标准的完整的毒理学评价体系的建立与完善纳米纳米毒理学研究现状毒理学研究现状 纳米商品材料：纳米商品材料：A Ag,C,Zn(g,C,Zn(ZnOZnO),Si,Ti(TiO2),Au,etc.),Si,Ti(TiO2),Au,etc.纳米技

6、术商品地区分布：纳米技术商品地区分布：美国美国 亚洲亚洲 欧洲欧洲 其他其他 纳米毒理学研究特点：纳米毒理学研究特点：综合性、交叉性综合性、交叉性包含毒理学材料科学、医学、分子生物学、生物信息学等美国对热点问题反应最迅速，其论文数量也居首位美国对热点问题反应最迅速，其论文数量也居首位国内外纳米毒理学教科书：国内外纳米毒理学教科书：NanotoxicologyNanotoxicology，赵宇亮赵宇亮超细颗粒纳米颗粒病毒（活着的纳米颗粒）纳米纳米毒理学研究现状毒理学研究现状 发表文献：发表文献：美国中国德国等美国中国德国等 研究机构：研究机构：美国多所大学（德克萨斯美国多所大学（德克萨斯/密歇根

7、密歇根/哈弗等）哈弗等）中科院中科院纳米生物效应与安全性纳米生物效应与安全性实验实验医学应用：医学应用：已获批准的纳米治疗处方（至已获批准的纳米治疗处方（至20102010年年6 6个）个）纳米纳米材料材料NPNP进入进入人体的途径人体的途径 吸入吸入-肺/血液/NS/消化/NS 口服口服-胃肠道/肝脾肾肺 静脉注射静脉注射-肝脾肾 经皮吸收经皮吸收-皮肤/淋巴结 皮下注射皮下注射 腹腔腹腔注射注射 肺：肺：上皮屏障（上皮细胞上皮屏障（上皮细胞/内皮细胞，内皮细胞，1.3-400 nm)1.3-400 nm)胃肠道胃肠道:肠道淋巴组织肠道淋巴组织 皮肤：皮肤：表皮屏障（尺寸化学依赖性表皮屏障（

8、尺寸化学依赖性-表皮真皮）表皮真皮）纳米纳米材料材料NPNP进入进入人体的途径人体的途径NPNP可能的暴露和可能的暴露和清除清除路线路线嗅嗅N/三叉三叉Nl 药物注射药物注射纳米纳米毒理学现有研究小结毒理学现有研究小结1.1.活性导致蛋白质、活性导致蛋白质、DNADNA和生物膜损伤和生物膜损伤2.2.氧化应激反应氧化应激反应3.3.线粒体功能干扰：内膜损伤、膜通透性改变、能量耗竭、线粒体功能干扰：内膜损伤、膜通透性改变、能量耗竭、凋亡和坏死凋亡和坏死4.4.炎性反应：组织炎细胞浸润、纤维化、肉芽肿、动脉粥炎性反应：组织炎细胞浸润、纤维化、肉芽肿、动脉粥样硬化形成、样硬化形成、C C反应蛋白升高

9、反应蛋白升高纳米纳米毒理学现有研究小结毒理学现有研究小结5.5.蛋白变性降解、酶活性丧失、新抗原形成、免疫耐受功蛋白变性降解、酶活性丧失、新抗原形成、免疫耐受功能受损、自身免疫和抗原佐剂效应能受损、自身免疫和抗原佐剂效应6.6.细胞核摄取致细胞核摄取致DNADNA损伤、核蛋白质聚集、抗原性改变损伤、核蛋白质聚集、抗原性改变7.7.细胞周期改变致细胞增殖衰老出现异常凋亡改变细胞周期改变致细胞增殖衰老出现异常凋亡改变纳米纳米毒理学现有研究小结毒理学现有研究小结8.8.吞噬功能损伤、纤维化、肉芽肿、颗粒物聚集吞噬功能损伤、纤维化、肉芽肿、颗粒物聚集 致病原致病原体清除力下降体清除力下降9.9.网状内

10、皮系统摄取网状内皮系统摄取NPNP在肝脾淋巴结聚集，致组织肿大功在肝脾淋巴结聚集，致组织肿大功能丧失能丧失10.10.内皮功能受损致凝血功能障碍、内皮功能受损致凝血功能障碍、ASAS形成、血栓形成形成、血栓形成11.11.中枢神经系统摄取中枢神经系统摄取NPNP致中枢外周神经功能损伤致中枢外周神经功能损伤纳米纳米毒理学现有研究总结毒理学现有研究总结1.1.目前尚无公认的评定目前尚无公认的评定NPNP生物安全性的体系或模型生物安全性的体系或模型2.2.目前尚无公认的快速准确的分析和评定方法目前尚无公认的快速准确的分析和评定方法3.3.我国尚缺乏纳米技术与我国尚缺乏纳米技术与NPNP环境与生物安全

11、性标准与规范环境与生物安全性标准与规范纳米纳米毒理学我国优先发展的领域和关键技术毒理学我国优先发展的领域和关键技术1.1.环境中纳米尺度物质的行为、归趋及生态环境的影响和环境中纳米尺度物质的行为、归趋及生态环境的影响和人体暴露评估与健康影响人体暴露评估与健康影响2.2.复合典型环境污染物的复合典型环境污染物的NPNP宏观生物效应宏观生物效应3.3.人工制备的典型人工制备的典型NPNP对组织屏障的穿透效应及对亚细胞与对组织屏障的穿透效应及对亚细胞与分子水平损伤研究分子水平损伤研究4.4.纳米尺度物质所致生物毒性检测技术与设备研发纳米尺度物质所致生物毒性检测技术与设备研发纳米纳米毒理学我国优先发展

12、的领域和关键技术毒理学我国优先发展的领域和关键技术1.1.积极引进生物学高级技术和毒理学评价新技术积极引进生物学高级技术和毒理学评价新技术2.2.建立建立NPNP对生态环境的影响和生物毒性效应的评估体系、对生态环境的影响和生物毒性效应的评估体系、技术和标准技术和标准3.3.研发相应的检测技术与设备研发相应的检测技术与设备技术层面：技术层面：纳米纳米毒理学我国优先发展的领域和关键技术毒理学我国优先发展的领域和关键技术1.1.研究纳米物质在环境和机体中的转运分布、对生物靶器研究纳米物质在环境和机体中的转运分布、对生物靶器官、靶细胞的作用；探讨对亚细胞官、靶细胞的作用；探讨对亚细胞-分子水平的损伤作

13、分子水平的损伤作用与细胞超微结构的改变用与细胞超微结构的改变2.2.对细胞器直至生物大分子功能的影响对细胞器直至生物大分子功能的影响3.3.基因与蛋白表达的改变基因与蛋白表达的改变4.4.NPNP的代谢与代谢组学研究的代谢与代谢组学研究理论层面：理论层面：第二部分第二部分细胞纳米毒理学细胞纳米毒理学纳米纳米材料细胞毒理学研究的模型材料细胞毒理学研究的模型 原代细胞原代细胞/永久细胞株永久细胞株 纳米颗粒在组织的该细胞中可摄入纳米颗粒在组织的该细胞中可摄入纳米材料的细胞毒性纳米材料的细胞毒性 细胞摄入和定位细胞摄入和定位 毒性评价指标毒性评价指标纳米材料的细胞毒性纳米材料的细胞毒性 NPNP可溶

14、性可溶性-细胞实验一般用水溶性材料细胞实验一般用水溶性材料 NPNP示踪示踪-荧光显微成像方法荧光显微成像方法/同位素示踪技术同位素示踪技术 NPNP定位定位-溶酶体溶酶体-多由笼形蛋白介导多由笼形蛋白介导 NPNP摄入相关因素摄入相关因素表面结构效应表面结构效应/表面修饰效应表面修饰效应/尺寸效应尺寸效应纳米材料的纳米材料的细胞毒性细胞毒性 （以吸入暴露对肺组织的影响为例以吸入暴露对肺组织的影响为例）肺组织细胞模型肺组织细胞模型肺巨噬细胞、支气管上皮细胞、肺成纤维细胞 相关因素：相关因素：NP比表面积纳米材料纳米材料的的肺组织细胞肺组织细胞毒性毒性 肺巨噬细胞肺巨噬细胞巨噬细胞功能低下（吞噬

15、能力/趋化性/膜渗透性/细胞骨架功能下降/凋亡/坏死）l ROSROS形成是氧化损伤的标志形成是氧化损伤的标志NP-血红素加氧酶-1（HO-1)高效表达-谷胱甘肽减少-细胞膜受损-LDH泄露-TNF-a释放甚至细胞骨架功能紊乱纳米材料的细胞毒性纳米材料的细胞毒性 支气管上皮细胞支气管上皮细胞l炎症因子释放 肺成纤维细胞肺成纤维细胞l自由基产生-细胞毒性lDNA损伤-遗传毒性纳米材料的细胞摄取方式纳米材料的细胞摄取方式 离子通道（很难）胞吞胞吞（胞噬/胞饮-主要方式）l笼形蛋白笼形蛋白(clathrin)介导介导-大部分细胞的方式l细胞膜穴样内陷细胞膜穴样内陷（小窝蛋白caveolae）l脂筏脂

16、筏（细胞膜上附有葡糖鞘脂类和胆固醇的特化小区）纳米材料进入细胞的方式与其大小相关纳米材料进入细胞的方式与其大小相关NP尺寸（尺寸（nm）入细胞方式入细胞方式200-500波性蛋白，主动耗能200笼形蛋白clathrin500小窝蛋白caveolae第三部分第三部分分子纳米毒理学分子纳米毒理学涉及纳米尺度水平的外源性环境物质的纳米涉及纳米尺度水平的外源性环境物质的纳米生物学，即在分子水平上，外源性纳米物质生物学，即在分子水平上，外源性纳米物质与生物体系之间在一定尺度上的相互作用与生物体系之间在一定尺度上的相互作用分子纳米毒理学分子纳米毒理学研究方法研究方法 单细胞凝胶电泳技术单细胞凝胶电泳技术

17、荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术 PCR-SSCPPCR-SSCP技术技术 mRNAmRNA差异显示差异显示PCRPCR技术技术 基因芯片技术基因芯片技术 蛋白质蛋白质/代谢组学代谢组学分子纳米毒理学分子纳米毒理学-NP&NP&生物分子生物分子 NP&NP&蛋白质蛋白质 NP&NP&核酸核酸 NP&脂类分子纳米毒理学分子纳米毒理学-NP&NP&蛋白质蛋白质NPNP结构类似蛋白质结构类似蛋白质-尺寸小、比表面积大尺寸小、比表面积大小蛋白质易吸附于小蛋白质易吸附于NPNP（因大蛋白质空间位阻大）（因大蛋白质空间位阻大）NP&NP&蛋白质之间相互作用力蛋白质之间相互作用力l共价键共价键l非共价键（弱

18、相互作用力）非共价键（弱相互作用力）范德华力/氢键/静电引力/疏水亲水作用分子纳米毒理学分子纳米毒理学-NP&NP&蛋白质蛋白质 理论模型计算研究理论模型计算研究 细胞信号通道调节细胞信号通道调节 纳米毒性的生物标志物纳米毒性的生物标志物l抗氧化酶/血红素加氧酶HO-1/细胞谷胱甘肽l碳纳米材料-肝-P450，b5，苯并芘酪氨酸羟化酶 -肾细胞色素P450还原酶分子纳米毒理学分子纳米毒理学-纳米毒性的生物标志物纳米毒性的生物标志物 暴露标志物：暴露标志物：反映NP的生物吸收、分布、代谢、排泄、生物 聚集、靶器官的暴露水平 效应标志物：效应标志物：反映NP暴露后如生物机体的生化、生理学行为 改变

19、的生物学效应 易感性标志物：易感性标志物：反映NP引起的早期生物学效应如肺损伤、炎 症、纤维化、纳米毒性的剂量-效应关系和 时间-效应关系分子纳米毒理学分子纳米毒理学-NP&NP&核酸核酸 尺寸效应尺寸效应 协同效应协同效应 DNADNA切割切割 诱导基因突变诱导基因突变 基因转运载体基因转运载体第四部分第四部分动物纳米毒理学动物纳米毒理学一、纳米一、纳米材料的神经毒理学效应材料的神经毒理学效应 NPNP入脑途径入脑途径 血液循环血液循环-BBBBBB 嗅神经嗅神经（发出的神经联络纤维可到达脑内各个区域）三叉神经的感觉神经感觉神经末梢贯穿于鼻腔黏膜和嗅粘膜）一、纳米一、纳米材料的神经毒理学效应

20、材料的神经毒理学效应 NPNP细胞摄取细胞摄取 纳米本身特性（尺寸纳米本身特性（尺寸/表面电荷表面电荷/表面修饰）表面修饰）细胞种类：小胶质细胞细胞种类：小胶质细胞 NPNP所致病变所致病变氧化应激反应（氧化应激反应（iNOS/cox2/ApoE/b-iNOS/cox2/ApoE/b-淀粉样蛋白）淀粉样蛋白）脑部脑部炎症反应炎症反应 神经功能损伤（学习记忆、突触可塑性）神经功能损伤（学习记忆、突触可塑性）检测内容检测内容 炎症反应炎症反应 氧化应激氧化应激 直接毒性直接毒性 BBBBBB损伤损伤 DNADNA损伤损伤 .纳米材料神经毒性的机制纳米材料神经毒性的机制l 标志物标志物-GFAP,S

21、100B-GFAP,S100Bl 神经递质神经递质-NE,DA,Ach-NE,DA,Ach，GluGlu二、呼吸二、呼吸暴露暴露NPNP对心肺系统的毒理学效应对心肺系统的毒理学效应 NPNP所致心肺病变所致心肺病变l肺部肺部 巨噬细胞活化成簇、肺泡脂蛋白沉积等 PMN/LC/嗜酸粒细胞浸润，淋巴滤泡增生 肺泡壁增厚、肺气肿、肺淤血 炎症因子（IL-1、8,TNF-a）、ROS二、呼吸二、呼吸暴露暴露NPNP对心肺系统的毒理学效应对心肺系统的毒理学效应 NPNP所致心肺病变所致心肺病变l肺部肺部 （摄入/清除/长期蓄积/年龄）吸入/血循 纤毛粘液排送/M/淋巴/血循 肺内沉积后极缓慢释放/入血循

22、逃避单核巨噬吞噬或吞噬后难以有效清除/肺损伤后清除率下降 老年幼年成年（对NP敏感性）二、呼吸二、呼吸暴露暴露NPNP对心肺系统的毒理学效应对心肺系统的毒理学效应 NPNP所致心肺病变所致心肺病变l肺部肺部-吸入颗粒物对肺损伤评价的生化指标%PMN%PMN-炎症%LC%LC-免疫介导的炎症 TPTP（总蛋白）-炎症引起血管通透性 LDHLDH-细胞死亡二、呼吸二、呼吸暴露暴露NPNP对心肺系统的毒理学效应对心肺系统的毒理学效应 NPNP所致心肺病变所致心肺病变l心血管心血管 （呼吸系统炎症是心血管疾病的危险因素）NP/NP/炎症因子经呼吸系统入血液循环炎症因子经呼吸系统入血液循环ECEC、MC

23、MC、心肌细胞受损、心肌细胞受损、PMN/LCPMN/LC经骨髓大量入血、经骨髓大量入血、FIBFIB血液黏度增加、加速血液黏度增加、加速ASAS进程进程/促粥样斑块形成前血栓促粥样斑块形成前血栓血流血流R R致心脏负荷致心脏负荷，冠脉血液灌流，冠脉血液灌流血栓形成、心肌梗死等血栓形成、心肌梗死等老年幼年成年二、呼吸二、呼吸暴露暴露NPNP对心肺系统的毒理学效应对心肺系统的毒理学效应l可选评价指标可选评价指标 心肌损伤灵敏指标-血清心肌钙蛋白 心肌缺氧-Nagar-Olsens染色（正常心肌黄棕色/缺氧心肌艳红色）凝血系统功能典型指标血清组胺-评价炎症（老年成年幼年）凝血酶原激活时间PT部分凝

24、血酶原激活时间APPT纤维蛋白原FIB含量（FIB:肺部炎症急性相的产物蛋白之一）三、胃肠道三、胃肠道摄入摄入NPNP的毒理学效应的毒理学效应进入途径呼吸摄入-纤毛运动-食管食物药物口服三、胃肠道三、胃肠道摄入摄入NPNP的毒理学效应的毒理学效应摄入过程胃（胃酸）十二指肠（消化降解）空回肠（吸收面积大）吸收的NP进入血液循环未吸收的NP进入大肠（排出）三、胃肠道三、胃肠道摄入摄入NPNP的毒理学效应的毒理学效应急性毒性肝损伤-（肝功-ALT/AST/ALP/LDH)肾损伤-（BUN/Cr）心肌损伤-（CK/AST/LDH/HBD)贫血离子超载碱中毒机械性肠梗阻HBD-alpha-羟丁酸脱氢酶第

25、五部分第五部分纳米特性与生物效应相关性纳米特性与生物效应相关性纳米特性与生物效应的相关性纳米特性与生物效应的相关性NPNP尺寸尺寸NPNP结构化学效应结构化学效应NPNP表面化学表面化学l剂量剂量-效应关系效应关系l尺寸尺寸-效应关系效应关系l结构结构-效应关系效应关系纳米特性与生物效应的相关性纳米特性与生物效应的相关性 -尺寸尺寸在在NPNP其他特性相同、暴露剂量相同情况下其他特性相同、暴露剂量相同情况下尺寸愈小、毒性愈重尺寸愈小、毒性愈重（多数NP）原因：纳米尺度下巨大比表面积引起的超高反应活性原因：纳米尺度下巨大比表面积引起的超高反应活性影响因素：靶器官不同毒性不同影响因素：靶器官不同毒

26、性不同纳米锌：小尺寸贫血肾损伤重，大尺寸肝损伤重纳米特性与生物效应的相关性纳米特性与生物效应的相关性 -结构化学效应结构化学效应举例：举例：相同相同NPNP剂量下，毒性不同剂量下，毒性不同-SWCNTMWCNT-SWCNTMWCNT富勒烯富勒烯C60C60原因：原因：结构不同，则化学反应性不同、生物活性不同结构不同，则化学反应性不同、生物活性不同纳米特性与生物效应的相关性纳米特性与生物效应的相关性 -纳米表面化学纳米表面化学纳米表面化学是纳米表面化学是降低或消除降低或消除NPNP毒性毒性的有效途径，的有效途径，主要方式主要方式 -亲水性基团的加成反应亲水性基团的加成反应（-OH/-COOH/-

27、SO3H/-NH2,etc-OH/-COOH/-SO3H/-NH2,etc）因其可改变：因其可改变：毒理学效应毒理学效应表面化学性质表面化学性质比表面积比表面积NP结构和稳定性被改变，故NP的生物分布/靶器官/体内代谢动力学等亦随之改变第六部分第六部分纳米毒理学的实验技术与研究方法纳米毒理学的实验技术与研究方法 消费商品（消费商品（NP)NP)的安全性评价急需该领域的进展的安全性评价急需该领域的进展水溶性的好坏是NP能否应用于生物体系最重要的参数之一NPNP的预处理的预处理-生物医学生物医学/毒理学研究毒理学研究 NPNP颗粒的初度测试或纯化颗粒的初度测试或纯化寻找合适的颗粒悬浮剂（非吸入暴露

28、途径）寻找合适的颗粒悬浮剂（非吸入暴露途径）测定尺寸分布的样品处理测定尺寸分布的样品处理测定测定NPNP在介质中的表面积在介质中的表面积建议一个尺寸虽时间变化的标准曲线建议一个尺寸虽时间变化的标准曲线寻找高反应活性寻找高反应活性NPNP的保护方法的保护方法-（防止（防止NPNP与空气或溶剂介质等发生化学反应）与空气或溶剂介质等发生化学反应）NP的预处理的预处理-细胞细胞/动物实验动物实验 分散分散NPNP：超声或涡旋 选择介质溶液选择介质溶液 实验前后实验前后NPNP尺寸和表面性质及变化尺寸和表面性质及变化 体内实验注意防止体内实验注意防止NPNP与环境介质的协同效应与环境介质的协同效应NP多

29、变性多变性纳米毒理学的实验技术与研究方法纳米毒理学的实验技术与研究方法 体外体外NP的表征方法的表征方法NP体外细胞摄入和定位的检测方法体外细胞摄入和定位的检测方法NP细胞毒性的研究方法细胞毒性的研究方法NP体内毒性的研究方法体内毒性的研究方法纳米毒理学的实验技术与研究方法纳米毒理学的实验技术与研究方法-体外体外NPNP的表征方法的表征方法设备：设备：TEM/AFM/STMTEM/AFM/STM（扫描隧道显微镜）（扫描隧道显微镜）/SEM/Cryo-SEM/SEM/Cryo-SEM（低温扫描电镜）环境扫描电镜等（低温扫描电镜）环境扫描电镜等检测检测N NP P尺寸分布和比表面积分析尺寸分布和比

30、表面积分析动态观察实验前后及实验过程中动态观察实验前后及实验过程中NPNP有无变化有无变化目前，同步辐射小角X射线散射可能是测定溶液样品中的NP尺寸/比表面积和形态等性质的一种最合适的技术纳米毒理学的实验技术与研究方法纳米毒理学的实验技术与研究方法-体外体外NPNP的表征方法的表征方法粒度粒度分析分析形貌分析形貌分析成分分析成分分析结构分析结构分析表面与界面分析表面与界面分析纳米毒理学的实验技术与研究方法纳米毒理学的实验技术与研究方法-体外体外NPNP的表征方法的表征方法粒度粒度分析分析难点：自吸附特征（易团聚）难点：自吸附特征（易团聚）检测：检测：一次粒度：TEM（平均直径/粒径分布）（缺点

31、：观察样本少、杂质干扰）二次粒度：激光粒度分析法-动态光散射法（DLS)前提：NP应为球形、单分散；缺点：仅可测低浓度样本纳米毒理学的实验技术与研究方法纳米毒理学的实验技术与研究方法-体外体外NPNP的表征方法的表征方法形貌分析：形貌分析：SEM/TEM/STM/AFMSEM/TEM/STM/AFM 观察：观察：l几何外貌l材料颗粒度l颗粒度的分布l形貌微区的成分和物相结构纳米毒理学的实验技术与研究方法纳米毒理学的实验技术与研究方法-体外体外NPNP的表征方法的表征方法成分分析：成分分析：方法方法指标指标l光谱分析（XRD)确定NP的元素组成l质谱分析（ICP-MS)测定NP中杂质的种类、浓度

32、l能谱分析（XPS)纳米毒理学的实验技术与研究方法纳米毒理学的实验技术与研究方法-体外体外NPNP的表征方法的表征方法结构分析：结构分析：X X射线吸收谱射线吸收谱表面与界面分析：表面与界面分析：X X射线光电子能谱（射线光电子能谱（XPS)XPS)纳米毒理学的实验技术与研究方法纳米毒理学的实验技术与研究方法-生物环境中生物环境中NPNP的表征方法的表征方法尺寸和形貌尺寸和形貌l原始尺寸原始尺寸l给药尺寸给药尺寸l生物体内相互作用时的尺寸生物体内相互作用时的尺寸表面修饰与溶解表面修饰与溶解纳米毒理学的实验技术与研究方法纳米毒理学的实验技术与研究方法-体外体外NPNP的表征方法的表征方法成分分析

33、：成分分析：SEM/TEM/STM/AFMSEM/TEM/STM/AFM 观察：观察：l几何外貌l材料颗粒度l颗粒度的分布l形貌微区的成分和物相结构纳米毒理学的实验技术与研究方法纳米毒理学的实验技术与研究方法-NPNP体外细胞摄入和定位的检测方法体外细胞摄入和定位的检测方法透射电镜法透射电镜法同位素法同位素法元素分析法元素分析法荧光光谱法荧光光谱法其他新方法其他新方法 -视频增强干涉显微镜、双光子发光显微镜纳米毒理学的实验技术与研究方法纳米毒理学的实验技术与研究方法-NPNP体外细胞摄入和定位的检测方法体外细胞摄入和定位的检测方法透射电镜法透射电镜法优点：优点：NP在细胞或组织中的定位；结合光

34、谱法可定位内化的NP的组分；结合微分析系统的元素定性分析技术，可确定NP组成缺点：缺点：对电子散射材料的分辨率差（可结合DLS克服）纳米毒理学的实验技术与研究方法纳米毒理学的实验技术与研究方法-NPNP细胞毒性的研究方法细胞毒性的研究方法元素分析法元素分析法感应耦合等离子体质谱技术感应耦合等离子体质谱技术ICP-MSICP-MS（现今发展最快的痕量元素分析技术）l优点优点-多元素同步分析；高灵敏度，低本体信号；多元素同步分析；高灵敏度，低本体信号；检测分析快速；可提供同位素信息检测分析快速；可提供同位素信息感应耦合等离子体发射光谱感应耦合等离子体发射光谱ICP-AESICP-AESl优点优点-

35、检出限低、精度高、动态范围宽检出限低、精度高、动态范围宽l缺点缺点-若检测对象含该材料组分，则不能区分其来源，如碳元素若检测对象含该材料组分，则不能区分其来源，如碳元素纳米毒理学的实验技术与研究方法纳米毒理学的实验技术与研究方法-NPNP细胞毒性的研究方法细胞毒性的研究方法荧光光谱法荧光光谱法生物标记荧光分子（生物标记荧光分子（FITC,TexasFITC,Texas红）红）&荧光显微镜荧光显微镜l优点优点-可定量荧光可定量荧光l缺点缺点-NP-NP结合荧光素后，可能理化性质会发生改变结合荧光素后，可能理化性质会发生改变纳米毒理学的实验技术与研究方法纳米毒理学的实验技术与研究方法-NPNP细胞

36、毒性的研究方法细胞毒性的研究方法细胞发育情况细胞发育情况l细胞形态、增殖（MTT/XTT/WST-1）l细胞生长状态（贴壁率/集落形成率/存活率等）l坏死、凋亡细胞毒性机制细胞毒性机制l氧化应激（SOD/GSH表达及活性等）lDNA损伤MTT:形成不溶性染料；XTT/WST-1：形成水溶性染料注意：NP与反应物或四唑蓝产物之间相互作用致假阳 性。如SWNTs，多空硅，炭黑等。纳米毒理学的实验技术与研究方法纳米毒理学的实验技术与研究方法-NPNP细胞毒理学细胞毒理学 微核检测微核检测 生殖毒性检测生殖毒性检测 免疫毒性检测免疫毒性检测 细胞凋亡检测细胞凋亡检测 细胞周期检测细胞周期检测 染色体倍

37、性检测染色体倍性检测纳米毒理学的实验技术与研究方法纳米毒理学的实验技术与研究方法-常用的纳米毒理学研究方法中体外毒理学研究技术常用的纳米毒理学研究方法中体外毒理学研究技术纳米毒理学的实验技术与研究方法纳米毒理学的实验技术与研究方法-常用的纳米毒理学研究方法中体外毒理学研究技术常用的纳米毒理学研究方法中体外毒理学研究技术纳米材料纳米材料NPNP的体内毒性的体内毒性 动物选择动物选择 NPNP表征表征 NPNP暴露途径暴露途径 NPNP剂量剂量 观察指标观察指标细胞实验细胞实验-NP浓度高，作用时间长，因此浓度高，作用时间长，因此不能简单外推细胞实验结果到体内实验不能简单外推细胞实验结果到体内实验

38、纳米材料纳米材料NPNP的体内毒性的体内毒性 急性毒性试验：急性毒性试验：单次或多次给药后动物在24h内产生的毒性症状及其程度、毒性出现和消失的时间、死亡的发生率，并计算出最大给药量、最小致死量、半数致死量LD50等 长期毒性试验：长期毒性试验：多次染毒条件下动物出现损害的性质、程度、靶组织和器官、剂量-效应关系和时间-效应关系及可逆性等，从而了解动物耐受的剂量范围及对过度暴露的解救措施纳米毒理学的实验技术与研究方法纳米毒理学的实验技术与研究方法-NPNP体内毒性的研究内容体内毒性的研究内容LD50LD50组织学毒性评价组织学毒性评价血清生化学指标和细胞数量的变化（生化自动分析仪）血清生化学指

39、标和细胞数量的变化（生化自动分析仪）组织形态学的变化（组织形态学的变化（LM/TEM)LM/TEM)NPNP总的生物分布总的生物分布荧光标记/放射性标记/ICP-MS/ICP-AES/核医学与核分析技术/MRI/XRF（X射线（荧光分析技术）/量子点标记技术/动态实时检测技术NPNP表面吸附物质检测：表面吸附物质检测：MS/SERS(表面增强拉曼散射）纳米材料纳米材料NPNP的体内毒性的体内毒性组织毒性评价的观察指标组织毒性评价的观察指标 基本指标基本指标-体重、体长、症状、脏器系数体重、体长、症状、脏器系数 血液指标血液指标-血细胞、血清生化血细胞、血清生化 尿液指标尿液指标-尿常规尿常规

40、心血管心血管/肺肺/肝肝/肾肾/神经神经/生殖发育毒性生殖发育毒性 致癌性致癌性第七部分第七部分纳米毒理学的文献举例纳米毒理学的文献举例PAPERS ON NANOTOXICOLOGYPAPER1-纳米纳米材料材料NP的细胞学毒性的细胞学毒性 研究背景研究背景 实验策略实验策略 结果和讨论结果和讨论 结论结论PAPER1-研究背景研究背景:GRM 石墨烯石墨烯 2D材料、应用广泛、有商品化产品 石墨烯相关材料（石墨烯相关材料（GRM）安全性评价 GRM的生物学作用相关因素的生物学作用相关因素 横向尺寸/层数/氧含量(3要素）GRM暴露途径暴露途径 吸入/皮肤/食入/注射（吸入报道食入）GRM食

41、入方式食入方式 直接（食物水）/间接（由呼吸入消化道）PAPER1-研究背景研究背景:GRM&肠道肠道 NP入肠前经历的生物环境有入肠前经历的生物环境有 pH/消化酶/微生物等 （胃酸影响可能最大）肠道粘膜屏障肠道粘膜屏障 重要的生物屏障之一重要的生物屏障之一营养成分的吸收/致病菌的防御/共生菌的维持 肠道粘膜屏障肠道粘膜屏障&GRM 鲜有报道GRM既然被广泛应用，食入是机体摄入的途径之一，既然被广泛应用，食入是机体摄入的途径之一，且且GRM有报道其安全性问题，故明确有报道其安全性问题，故明确GRM理化特性理化特性（三要素）和生物学效应关系非常必要！（三要素）和生物学效应关系非常必要！PAPE

42、R1-实验策略实验策略4种种GRM样本样本GO&GNP（2种商品化种商品化2种研究级别）种研究级别）酸化前后表征酸化前后表征细胞存活率细胞存活率细胞细胞-GRM界面界面综合分析综合分析GRM三要素（横向尺寸、层数、氧含量）三要素（横向尺寸、层数、氧含量）及团聚性对肠细胞生物学效应的影响及团聚性对肠细胞生物学效应的影响细胞细胞ROS生成生成细胞数目细胞数目材料选择，材料预处理，剂量选择，实验设计材料选择，材料预处理，剂量选择，实验设计PAPER1-结果和讨论结果和讨论#Table1：GRM表征表征-SEM/XPS/Zeta电位电位/Raman光谱光谱Lateral size:GO1GO2GO3G

43、O4 zeta 电位：GO1GO4GO2GO3GFPPAPER1-结果和讨论结果和讨论#1：酸化前后：酸化前后GRM形态表征形态表征1-SEM-无明显差异无明显差异GOGRMPAPER1-结果和讨论结果和讨论#Table2：酸化前后表征：酸化前后表征2酸化前:zeta电位-GNPGO1酸化后zeta/氧含量无明显变化Raman：GNP-D/G降低,GO1无明显变化因选择性降解/原材料不同#1&Table2小结：小结：GO/GNP是相对惰性材料，因急性酸处理是相对惰性材料，因急性酸处理（0.1M HCl 2h，pH2)基本未改变其表征基本未改变其表征PAPER1-结果和讨论结果和讨论#2：酸化前

44、后：酸化前后GRM暴露暴露Caco2细胞形态学（细胞形态学（SEM）-无明显差异无明显差异PAPER1-结果和讨论结果和讨论#3：酸化前后：酸化前后GRM暴露暴露Caco2细胞存活率细胞存活率-无明显差异无明显差异#2&3小结：若小结：若NP生产过程中涉及酸化，生产过程中涉及酸化，在研究其毒性时酸化预处理是不必需的在研究其毒性时酸化预处理是不必需的GO1 80ug/ml,细胞存活率80%以上；而GNP则约为60%（急性低毒性）（70%认为有毒性）PAPER1-结果和讨论结果和讨论#4：GRM暴露暴露Caco2细胞形态细胞形态细胞膜表面可见平行排列的细胞膜表面可见平行排列的GNP、细胞膜的皱褶、

45、折叠、突起等细胞膜的皱褶、折叠、突起等提示：细胞摄取提示：细胞摄取GRMPAPER1-结果和讨论结果和讨论#5：GRM暴露暴露Caco2细胞细胞ROS生成生成-均有升高，但各均有升高，但各GRM间变化不明显间变化不明显PAPER1-结果和讨论结果和讨论#6:GRM暴露暴露Caco2细胞存活率和细胞数目细胞存活率和细胞数目-无明显差异无明显差异？GRM尺寸大尺寸大PAPER1-结论结论 GRMGRM在生理相对酸性条件下是惰性的，提示在生理相对酸性条件下是惰性的，提示 酸化预处理对研究急性毒性不必需，利于医学应用酸化预处理对研究急性毒性不必需，利于医学应用 功能化功能化GRMGRM则需考虑其理化特

46、性的稳定性则需考虑其理化特性的稳定性 高浓度时高浓度时GNPGNP有急性低毒性有急性低毒性GOsGOs无，提示无，提示 GRMGRM的尺寸、团聚性、层数、氧含量有关的尺寸、团聚性、层数、氧含量有关（某尺寸作用占主导？）（某尺寸作用占主导？）PAPER1-存在问题存在问题 细胞摄取细胞摄取GRMGRM细节、细胞功能、细节、细胞功能、DNADNA损伤等指标损伤等指标 其他类型肠上皮细胞对其他类型肠上皮细胞对GRMGRM的反应的反应 长期毒性长期毒性 人工胃液人工胃液.PAPER2-纳米纳米材料材料NP的体内毒性的体内毒性 研究背景研究背景 实验策略实验策略 结果和讨论结果和讨论 结论结论PAPER

47、2-研究背景研究背景:GO 优良的理化特性优良的理化特性 生物感受器 比表面积大比表面积大 转运、药物等 光吸收性光吸收性 光热治疗 荧光性荧光性 体内外成像 细胞生长分化细胞生长分化 组织工程支架GO既然被广泛用于工业、医学等领域，其毒性必须被阐明！既然被广泛用于工业、医学等领域，其毒性必须被阐明！PAPER2-研究背景研究背景:GO毒性研究毒性研究 原材料原材料GO肺部肺部GO聚积聚积静脉注射静脉注射小鼠小鼠肺水肿、肉芽肿、线粒体ROS 将将GO改良后，如改良后，如PEG化等可使其水溶性化等可使其水溶性、生物相容性、生物相容性 毒性或基本无毒；NP生物分布及半衰期与NP表面包被方式、尺寸密

48、切相关基于（基于（1）NP代谢动力学与毒性和暴露方式、尺寸代谢动力学与毒性和暴露方式、尺寸密切相关，且（密切相关，且（2）目前尚无）目前尚无口服口服/腹腔注射腹腔注射后的相后的相关报道，所以本研究将就此展开！关报道，所以本研究将就此展开！PAPER2-实验策略实验策略制备不同尺寸的制备不同尺寸的NP:GO,nGO-PEG,RGO,nRGO-PEG表征表征生物分布生物分布毒性评估毒性评估重要脏器（心肝脾肺肾）重要脏器（心肝脾肺肾）血清生化血清生化全血细胞学全血细胞学 NPNP选择，标记方式选择，暴露方式，剂量选择（分布，毒性）选择，标记方式选择，暴露方式，剂量选择（分布，毒性）分组（时间：分组（

49、时间：1 1，7 7，30,9030,90）GOGO在在labelling bufferlabelling buffer迅速沉淀迅速沉淀PAPER2-结果和讨论结果和讨论#1：NP表征表征-AFM 稳定性稳定性（水（水/盐盐/FBS):GO易聚积；易聚积；PEG化后分散好化后分散好PAPER2-结果和讨论结果和讨论#1.NP表征表征-AFMSIZETHICKNESSSize：GORGO-PEGnRGO-PEGnGO-PEGThickness:nRGO-PEGRGO-PEGnGO-PEGGOPAPER2-结果和讨论结果和讨论#2：NP（125I标记）灌胃后的组织分布标记）灌胃后的组织分布4h，胃

50、肠高1d，仅剩2-3%1w，几乎检测不到PAPER2-结果和讨论结果和讨论#3：NP（125I标记）标记）i.p后的组织分布后的组织分布1d/7d，肝脾（RES)分布多尺寸大的PEG-NP吸收多RGO-PEGnRGO-PEG nGO-PEGPAPER2-结果和讨论结果和讨论#4：NP 在在i.p后的组织分布后的组织分布1d/7d/30d 肝脾分布多PEG化后肝脾吸收多，至少维持30d因GO稳定性差，易聚积于腹腔，而不易被RES吸收PAPER2-结果和讨论结果和讨论#5：NP 在在i.p后未见后未见肝肾功能损伤肝肾功能损伤PAPER2-结果和讨论结果和讨论#6：NP 在在i.p后未见后未见全血细胞学指标异常全血细胞学指标异常PAPER2-结果和讨论结果和讨论#7：NP 在在i.p后未见明显组织毒性后未见明显组织毒性PAPER2-结论结论 NP口服后不易被组织吸收，且迅速被清除口服后不易被组织吸收，且迅速被清除 NP腹腔注射后肝脾吸收较多，其吸收量与腹腔注射后肝脾吸收较多，其吸收量与表面包被情况及表面包被情况及NP尺寸密切相关尺寸密切相关 NP腹腔注射后未见明显毒性腹腔注射后未见明显毒性PAPER2-存在问题存在问题 GO口服后的生物分布口服后的生物分布 NP标记方式的优化标记方式的优化 毒性评价指标的完善毒性评价指标的完善 长期毒性的评价长期毒性的评价-90 days？.