分子生物学的基本操作

《分子生物学的基本操作》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学的基本操作（63页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、第一章第一章 分子生物学的基本操作分子生物学的基本操作 分子生物学研究从分子生物学研究从20世纪中叶开始高速发展的世纪中叶开始高速发展的最主要原因最主要原因 现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。基因工程技术的进步。DNA分子的切割与连接分子的切割与连接核酸分子杂交核酸分子杂交凝胶电泳凝胶电泳细胞转化细胞转化核酸序列分析核酸序列分析基因的人工合成基因的人工合成基因操作基因操作基因的定点突变基因的定点突变PCR扩增扩增基因工程基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组

2、合，使之或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。稳定的繁殖和表达。基因工程技术区别于其它技术的基因工程技术区别于其它技术的根本特征根本特征：具有：具有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力。毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力。外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达的过程与性状表达的过程.1.1 重组重组DNA发展史发展史-1.40年代确定了遗传信

3、息的携带者，即基因的分子载体是年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；BacterialStrainInjectionResultsLiving S cellsLiving R cellsHeat killed S cellsHeat killed S cells mixed with living R cellsLiving S cells in blood sample from dead mousecapsule1928 Frederick Griffith&1944 Oswald Avery T

4、ransformation of Streptococcus pneumoniae三大成就三大成就：19521952年年HersheyHershey和和ChaseChase证实噬菌体证实噬菌体D DNANA侵染细菌侵染细菌实验实验2.50年代揭示了年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半分子的双螺旋结构模型和半 保留复保留复制机制制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；解决了基因的自我复制和世代交替问题；X-ray sourceCrystallized DNARosalind FranklinMaurice WilkinsPhotographicfilm1953-Franklin&Wilk

5、ins1953-Franklin&WilkinsDescription of the structure of DNAFrancis Crick&James WatsonConservative ModelSemiconservative ModelFrank StahlMatt MeselsonParent cellFirst replicationSecond replication1958-Matthew Meselson&Franklin Stahl 1958-Matthew Meselson&Franklin Stahl proved that DNA replication in

6、bacteria proved that DNA replication in bacteria follows the semiconservative pathwayfollows the semiconservative pathway3.50年代末至年代末至60年代，相继提出了年代，相继提出了中心法则中心法则和操纵子学说和操纵子学说,成成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。Jacob and Monod两大两大技术保证：技术保证：1.DNA的体外切割和连接的体外切割和连接1962年年Arber 发现限制性核酸内切酶，发

7、现限制性核酸内切酶，1967Gellert发现了发现了 DNA 连接酶连接酶DNA ligase covalently links two DNA strands RestrictionenzymeRestrictionenzymeLigaseLigase3535限制酶的发现细菌的限制与修饰现象重组重组DNADNA实验中常见的主要工具酶实验中常见的主要工具酶酶酶 类类功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(II(II型型)识别并在特定位点切开识别并在特定位点切开DNADNADNADNA连接酶连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个通过磷酸二酯键把两个或多个DNADNA片段连接成一个片段连接成一个D

8、NADNA分子分子DNADNA聚合酶聚合酶I I（大肠杆菌）（大肠杆菌）按按55到到33方向加入新的核苷酸，补平方向加入新的核苷酸，补平DNADNA双链中的缺口双链中的缺口反转录酶反转录酶按照按照RNARNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNADNA链链多核苷酸激酶多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5-OH5-OH末端（进行末端标末端（进行末端标记实验或用来进行记实验或用来进行DNADNA的连接的连接末端转移酶末端转移酶在双链核酸的在双链核酸的33末端加上多聚单核苷酸末端加上多聚单核苷酸DNADNA外切酶外切酶II

9、IIII从从DNADNA链的链的33末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸噬菌体噬菌体DNADNA外切酶外切酶从从DNADNA链的链的55末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶切除位于切除位于DNADNA链链55或或33末端的磷酸基团末端的磷酸基团1972-Paul Berg,1972-Paul Berg,Produced first recombinant DNA using EcoRIEcoRI recognition sites phage DNAEcoRI cuts DNA into fragmentsSticky endSV40 DNAThe two fr

10、agments stick together by base pairingDNA ligaseRecombinant DNA 仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行连接酶进行DNA的切割和重组远不能满足基因研究的需要。的切割和重组远不能满足基因研究的需要。DNA片段在体外片段在体外不具备自我复制不具备自我复制能力，要想得到足够量能力，要想得到足够量和足够纯度的和足够纯度的DNA，必须将它们连接到具备自主复制能力，必须将它们连接到具备自主复制能力的的DNA分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。这就是

11、基因克隆，或分子克隆这就是基因克隆，或分子克隆。分子克隆的载体分子克隆的载体-具备自主复制具备自主复制能力的能力的DNA分子分子（vector），），如如病毒、噬菌体和病毒、噬菌体和质粒等小分子量质粒等小分子量复制子都可以作复制子都可以作为基因导入的载为基因导入的载体。体。从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。1970年年Mandel和和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，能有效地吸收能有效地吸收噬菌体噬菌体DNA。1972年，年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样等人又

12、报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样能够摄取质粒能够摄取质粒DNA。1973-Boyer,Cohen&Chang1973-Boyer,Cohen&ChangTransform E.coli with recombinant plasmidStanley Cohen&Annie ChanHerbert BoyerKanamycin resistance genePlasmid pSC101Tetracycline resistance geneE.coli transformed with recombinant plasmidTransformed cells plated onto medi

13、um with kanamycin and tetracyclineOnly cells with recombinant plasmid survive to produce colonies表明：表明：（1 1）像）像pSC101pSC101这样的质粒这样的质粒DNADNA分子可以作分子可以作为基因克隆的载体，从而把外源为基因克隆的载体，从而把外源DNADNA导入导入寄主细胞；寄主细胞；（2 2）像非洲爪蟾这样的高等生物的基因）像非洲爪蟾这样的高等生物的基因也可以被成功地转移到原核细胞中并实现也可以被成功地转移到原核细胞中并实现其功能表达；其功能表达；（3 3）质粒）质粒DNA-DNA-大

14、肠杆菌细胞作为一种成大肠杆菌细胞作为一种成功的基因克隆体系，有可能在重组功的基因克隆体系，有可能在重组DNADNA或或基因工程研究中发挥重要作用。基因工程研究中发挥重要作用。2.DNA的核苷酸序列分析技术的核苷酸序列分析技术 DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基础上创立并发站起来的一门重要的础上创立并发站起来的一门重要的DNA技术学，这门技术，技术学，这门技术，对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆DNA片断的操作方面，都有着十分广泛的使用价值。片断的操作方面，都有着十分

15、广泛的使用价值。所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。而导致性状特征发生遗传改变的过程。提供转化提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌的细菌菌株则被称为受体菌株。菌株则被称为受体菌株。细菌转化细菌转化（0）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。感受态感受态细胞制细胞制备及细备及细菌转化菌转化步骤：步骤：处于能够接受外源处于能够接受外源DNADNA状

16、态的细胞称为感受态细胞。状态的细胞称为感受态细胞。4.4.在全培养基中生长一段时间使转化基在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、细胞活性恢复。因实现表达、细胞活性恢复。3.3.立即将该体系转移到立即将该体系转移到4242下做短暂的下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。热刺激，复合物便会被细胞所吸收。2.2.Ca2+Ca2+与转化混合物中的外源与转化混合物中的外源DNADNA形成粘形成粘附在细胞表面的复合物。附在细胞表面的复合物。5.5.涂布于选择性培养基中分离转化子。涂布于选择性培养基中分离转化子。General process of gene engineering1.1.从生物有

17、机体基因组中，分从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的离出带有目的基因的DNADNA片段。片段。2.2.将带有目的基因的外源将带有目的基因的外源DNADNA片段连接片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组体分子上，形成重组DNADNA分子。分子。3.3.将重组将重组DNADNA分子转移到适当的受体分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。殖。4.4.从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组得了重组DNADNA分子的受体细胞，并筛选出分子的受体细胞，并筛选出已经

18、得到扩增的目的基因。已经得到扩增的目的基因。5.5.将目的基因克隆到将目的基因克隆到表达载体表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，研究核酸序列与蛋白质功能之间的关系。景下实现功能表达，研究核酸序列与蛋白质功能之间的关系。1.3 基因扩增基因扩增 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)(polymerase chain reaction)，即即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。序列的方法，故又称为基因的体外扩增

19、法。基本原理基本原理 PCR技术的基本原理类似于技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由由高温变性高温变性低温退火低温退火适温延伸三个基本反应步骤构成，适温延伸三个基本反应步骤构成，经多个循环，理论上靶经多个循环，理论上靶DNA分子将呈现指数性扩增。分子将呈现指数性扩增。PCR Cycle-Step 1PCR Cycle-Step 1-Denaturation Template -Denaturation Template DNA by Heat(95DNA by Heat(9

20、5o oC)C)Target SequenceTarget SequencePCR原理示意图原理示意图模板模板DNA的变性：模板的变性：模板DNA经加热至经加热至93左右一定时间后，使左右一定时间后，使模板模板DNA双链或经双链或经PCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；以便它与引物结合，为下轮反应作准备；PCR Cycle-Step 2 PCR Cycle-Step 2 Temperature is lowered(TTemperature is lowered(Tm m)and primers anneal to)

21、and primers anneal to target sequencestarget sequencesTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533模板模板DNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)：模板：模板DNA经加热变性成单链后，温经加热变性成单链后，温度降至度降至55左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合；PCR Cycle-Step 3-PCR Cycle-Step 3-At 72 At 72 o o C C TaqTaq DNA polymerase catalyses

22、 primer extension DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporatedas complementary nucleotides are incorporatedTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase引物的延伸：引物的延伸：DNA模板模板-引物结引物结合物在合物在TaqDNA聚聚合酶的作用下，以合酶的作用下，以dNTP为反应原料，为反应原料，靶序列为模板，

23、按靶序列为模板，按碱基配对与半保留碱基配对与半保留复制原理，合成一复制原理，合成一条新的互补条新的互补 链。链。End of the 1st PCR Cycle End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequenceResults in two copies of target sequenceTarget SequenceTarget Sequence每完成一个每完成一个循环需循环需24分钟，分钟，23小时就能将小时就能将待扩目的基待扩目的基因扩增放大因扩增放大几百万倍。几百万倍。Target Amplificati

24、onTarget AmplificationNo.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle=2 Amplicon2 cycle=4 Amplicon3 cycle=8 Amplicon4 cycle=16 Amplicon5 cycle=32 Amplicon6 cycle=64 Amplicon7 cycle=128 AmpliconPCR仪 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（和聚丙烯酰胺（polyacrylamide

25、）凝凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许多分子生物学研相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如：究方法，如：DNA分型、分型、DNA核核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当

26、的一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。电极。电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与分它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与分子同介质的摩擦系数成反比。子同介质的摩擦系数成反比。已知摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数，因此，已知摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数，因此，根据分子大小的不同、构型或形状的差异以及所带的净电荷的根据分子大小的不同、构型或形状的差异以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成多寡，便可

27、以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。分彼此分离开来。在生理条件下，核酸分子之糖在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，化状态的，所以，DNA和和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子多核苷酸链又被称为多聚阴离子（polyanions），），把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。极的方向迁移。在一定的电场强度下，在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。移率，取决于

28、核酸分子本身的大小和构型。大分子量的DNA移动的慢小分子量的DNA移动的快电泳缓冲液阳极阴极DNA加样孔琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间称样溶解加热制板倒胶电泳操作基本程序电泳操作基本程序取样点样电泳检测结果结果检测检测:溴化乙锭（溴化乙锭（ethidium ethidium bromidebromide，简称简称EtBrEtBr）染色，染色，紫外观察。紫外观察。在紫外线的照射下结合溴化乙锭的在紫外线的照射下结合溴化乙锭的DNA分子发出荧光分子发出荧光聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度分离分

29、离DNA片段的大小范围（片段的大小范围（bp）0.3%琼脂糖琼脂糖50 0001 0000.7%琼脂糖琼脂糖20 0001 0001.4%琼脂糖琼脂糖6 0003004.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺1 00010010.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺5002520.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺501 凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。就增大，其分

30、辨能力也就随之减弱。基因工程载体基因工程载体 1.至少有一个复制起点，因而至少至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。可在一种生物体中自主复制。2.至少应有一个克隆位点，以供外至少应有一个克隆位点，以供外源源DNA插入。插入。3.至少应有一个遗传标记基因，以至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组指示载体或重组DNA分子是否分子是否进入宿主细胞进入宿主细胞 4.安全性安全性pBR322pBR322BamBamHIHISalSalI IHinHindIIIdIIIPstPstI IScaScaI IAmpAmpr roriori(4.36 kb)(4.36 kb)大肠杆菌载体大肠

31、杆菌载体pBR322结构图结构图 载体特点载体特点基因工程载体是一类可供外源基因工程载体是一类可供外源DNADNA插插入并携其进入适当宿主细胞且能自主入并携其进入适当宿主细胞且能自主复制的复制的DNADNA分子。分子。质粒质粒DNA及其分离及其分离 细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体并能自主复制细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体并能自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双链的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双链DNADNA组成的复制子，组成的复制子，也有线性质粒的报道。也有线性质粒的报道。质粒质粒DNADNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，也可分子可以持续稳定

32、地处于染色体外的游离状态，也可能在一定的条件下被可逆性整合到寄主染色体上，随着染色体的能在一定的条件下被可逆性整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。E Ecolicoli的质粒种类的质粒种类 1)colE11)colE1因子（大肠杆菌素因子）因子（大肠杆菌素因子）多数不多数不能进行接合转移能进行接合转移DNADNA，属高拷贝松弛型。，属高拷贝松弛型。2)R2)R因子（抗药性因子）因子（抗药性因子）可接合转移可接合转移DNADNA，属低拷贝，属低拷贝 严紧型，严紧型，质粒较大，操作不便质粒较大，操作不便 3)F3)F因子（性因

33、子）因子（性因子）质粒载体质粒载体DNADNA的分离的分离碱裂解法碱裂解法 碱裂解法是基于染色体碱裂解法是基于染色体DNADNA与质粒与质粒DNADNA的变性与复性的差异而的变性与复性的差异而达到分离目的的。达到分离目的的。在在pHpH大于大于1212的碱性条件下染色体的碱性条件下染色体DNADNA的氢键断裂双螺旋结构的氢键断裂双螺旋结构解开而变性。质粒解开而变性。质粒DNADNA的氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结的氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当构的两条互补链不会完全分离，当pHpH恢复至中性时，变性的质粒恢复至中性时，变性的质粒DNADNA又恢复到原来的构

34、型保存在溶液中。而染色体又恢复到原来的构型保存在溶液中。而染色体DNADNA不能复性而不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心染色体形成缠连的网状结构。通过离心染色体DNADNA与不稳定的大分子与不稳定的大分子RNARNA蛋白质蛋白质-SDS-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。复合物等一起沉淀下来而被除去。用酒精沉淀法可以收集仍然滞留在上清液中的质粒用酒精沉淀法可以收集仍然滞留在上清液中的质粒DNADNA。重要的大肠杆菌质粒载体1.5.2.1.pSC101质粒载体质粒载体 pSC101kb pSC101kb，编码有一个四环素抗性基编码有一个四环素抗性基因（因（tettetr r）。）。pSC1

35、01pSC101质粒不仅具有可插入外源质粒不仅具有可插入外源DNADNA的的多个限制性核酸内切酶的单克隆位点，而且多个限制性核酸内切酶的单克隆位点，而且还具有四环素抗性的强选择记号，因此，它还具有四环素抗性的强选择记号，因此，它被选为第一个真核基因的克隆载体。当然，被选为第一个真核基因的克隆载体。当然，这个质粒载体也有其明显的缺点，它是一种这个质粒载体也有其明显的缺点，它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质粒的寄主细胞中提取粒的寄主细胞中提取pSC101 DNApSC101 DNA，其产量就其产量就要比其它质粒载体低得多。要比其它质粒载体低得多。1

36、.5.2.2.ColE11.5.2.2.ColE1质粒载体质粒载体 ColE1质粒属于松弛型复制控制的多拷贝质粒。在正常质粒属于松弛型复制控制的多拷贝质粒。在正常生长条件下，当培养基中用于蛋白质合成的氨基酸被耗尽，生长条件下，当培养基中用于蛋白质合成的氨基酸被耗尽，或是在对数生长末期的细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白或是在对数生长末期的细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。此时，松弛型复制控制的质粒也随之停止。此时，松弛型复制控制的质粒DNA仍然可以仍然可以继续进行复制达数小时之久，使每个寄

37、主细胞中所累积的继续进行复制达数小时之久，使每个寄主细胞中所累积的ColE1质粒拷贝数增加到质粒拷贝数增加到10003000个之多，质粒个之多，质粒DNA大约大约可占细胞总可占细胞总DNA的的50%左右。由此可见，由于质粒拷贝数左右。由此可见，由于质粒拷贝数高，插入的外源高，插入的外源DNA片段的产量也就得到相应的提高。片段的产量也就得到相应的提高。1.5.2.3 pBR322质粒载体质粒载体 pBR322质粒是由三个不同来源的部质粒是由三个不同来源的部分组成的：分组成的：第一部分来源于第一部分来源于pSF2124质粒、转座子质粒、转座子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（的氨苄青霉素抗性基因（amp

38、r）；）；第二部分来源于第二部分来源于pSC101质粒的四环素质粒的四环素抗性基因（抗性基因（tetr）；）；第三部分则来源于第三部分则来源于ColE1的派生质粒的派生质粒pMB1的的DNA复制起点（复制起点（ori）。）。123第一个优点：分子量较小，易于纯化，第一个优点：分子量较小，易于纯化，操作便利。操作便利。第二个优点：具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的第二个优点：具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择记号。质粒选择记号。质粒DNA编码的抗生素抗性基因的插入失活编码的抗生素抗性基因的插入失活效应，是检测重组体质粒的一种十分有用的方法。效应，是检测重组体质粒的一种十分有用的方法。第三

39、个优点：具较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增，每第三个优点：具较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增，每个细胞中可累积个细胞中可累积10003000个拷贝，为重组体个拷贝，为重组体DNA的的制制备提供了极大的方便。备提供了极大的方便。pBR322质粒载体的优点质粒载体的优点思考题思考题使用pBR322载体进行基因克隆易于造成载体自身连接环化,为什么?1.5.2.4 pUC质粒载体质粒载体pUC系列质粒载体包括如下四个部分：系列质粒载体包括如下四个部分：(i)来自来自pBR322质粒的复制起点（质粒的复制起点（ori）；）；(ii)氨苄青霉素抗性基因（氨苄青霉素抗性基因（ampr），），但它的但它的核苷酸序

40、列已经发生了变化，不再含有原核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制性核酸内切酶的单识别位点；来的限制性核酸内切酶的单识别位点；(iii)大肠杆菌大肠杆菌-半乳糖酶基因（半乳糖酶基因（lacZ）的启的启动子及其编码动子及其编码-肽链的肽链的DNA序列，此结构序列，此结构称为称为lacZ基因基因；(iv)位于位于lacZ基因中的靠近基因中的靠近5-端的一段多端的一段多克隆位点（克隆位点（MCS）区段，它并不破坏该基区段，它并不破坏该基因的功能。因的功能。EcoSacKpnSmaBamXbaSalPstSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSph

41、Pst SalXbaBamSmaKpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(2.68kb)r 第一，更小的分子量和更高的拷贝数。第一，更小的分子量和更高的拷贝数。第二，可用组织化学方法检测重组体。第二，可用组织化学方法检测重组体。pUC18质粒结构中具有来自大肠杆菌质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的操纵子的lacZ基因，基因，所编码的所编码的-肽链可参与肽链可参与-互补作用。因此，可用互补作用。因此，可用X-gal显显色法实现色法实现对重组体转化子的鉴定。对重组体转化子的鉴定。第三，具有多克隆位点第三，具有多克隆位点(MCS)区段，可以把具两种不

42、同粘性区段，可以把具两种不同粘性末端（如末端（如EcoR和和Hind）的外源的外源DNA片段直接克隆到片段直接克隆到pUC18/19质质粒载体上。粒载体上。pUC质质粒载体优点：粒载体优点：_外源外源DNA片段定向插入载体分子片段定向插入载体分子 若用两种不同的限制性核酸内切酶同时消化一种特定的若用两种不同的限制性核酸内切酶同时消化一种特定的DNADNA分子，将产生具有两种不同粘性末端的分子，将产生具有两种不同粘性末端的DNADNA片段。因片段。因此，如果载体分子和待克隆的此，如果载体分子和待克隆的DNADNA分子都是用同一对限分子都是用同一对限制性核酸内切酶切割，那么，载体分子和外源制性核酸

43、内切酶切割，那么，载体分子和外源DNADNA片段片段将按一种取向退火形成重组将按一种取向退火形成重组DNADNA分子，从而保证外源分子，从而保证外源DNADNA片段定向插入载体分子。片段定向插入载体分子。EcoSacKpnSmaBamXbaSalPstSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst SalXbaBamSmaKpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(2.68kb)r思考题思考题:如何在特定基因的两端引入限制酶识别位点?借助PCR手段完成本章要点本章要点分子生物学操作常用工具酶的作用分子生物学操作常用工具酶的作用细菌转化细菌转化PCRPCR基因工程载体基因工程载体重组子筛选方法（重组子筛选方法（pBR322pBR322、pUC18/19)pUC18/19)复习题复习题细菌转化操作流程细菌转化操作流程PCRPCR原理与步骤原理与步骤基因工程载体的特点基因工程载体的特点