基因克隆课件

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1、基因工程及体外表达体系基因工程及体外表达体系（2 2）.载体载体心血管病研究所心血管病研究所王王 佐佐一、概述外源外源DNA一般没有明显的遗传标志，如果一般没有明显的遗传标志，如果将其导入宿主细胞，没有有效的方法将导将其导入宿主细胞，没有有效的方法将导入了外源入了外源DNA的细胞和未导入外源的细胞和未导入外源DNA的的细胞区分开来。细胞区分开来。外源外源DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细导入宿主细胞后，不能随宿主细胞的繁殖而复制，达不到使外源胞的繁殖而复制，达不到使外源DNA片段片段扩增的目的。扩增的目的。1载体（vector）携带靶携带靶DNA片段（外源片段（外源DNA片段）片段）进入宿主细

2、胞进行扩增和表达的工具。进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。宿主细胞，常见的有大肠杆菌、酵母等。宿主细胞，常见的有大肠杆菌、酵母等。2载体的特征：能自主复制；能自主复制；具备筛选标记；具备筛选标记；适当大小的分子量和适当限制性内切酶适当大小的分子量和适当限制性内切酶酶切位点；酶切位点；在细胞中拷贝数高在细胞中拷贝数高除上述特征外，表达载体还应配备有与除上述特征外，表达载体还应配备有与宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、加尾信号、增强子等调控加尾信号、增强子等调控DNA元件。元件。3 载体的分类按来源分：质粒、噬菌体、病毒载体等；按来源分：质粒、噬菌体、病毒载体等；

3、按用途和功能分：克隆载体和表达载体。按用途和功能分：克隆载体和表达载体。克隆载体与表达载体克隆载体：主要用来获得大量纯化的目的克隆载体：主要用来获得大量纯化的目的DNA片段（目的基因），以便进一步研究其结构和片段（目的基因），以便进一步研究其结构和功能；功能；本章主要以克隆载体为例讲解本章主要以克隆载体为例讲解。表达载体：主要用来产生插入基因和表达载体：主要用来产生插入基因和mRNA，进而合成相关蛋白质。进而合成相关蛋白质。二、质粒载体 Plasmid Plasmid：细菌染色体：细菌染色体外小型双链环状外小型双链环状DNADNA，对细，对细菌的某些代谢活动和抗药菌的某些代谢活动和抗药性的表型

4、具有一定的作用。性的表型具有一定的作用。1 1 概念概念2 严紧型质粒与松驰型质粒的区别严紧型质粒严紧型质粒松驰型质粒松驰型质粒质粒复制所需的酶质粒复制所需的酶DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶每个细胞中所含的质每个细胞中所含的质粒数粒数1 15 5个个1010200200个以上个以上质粒复制与细菌复制质粒复制与细菌复制的关系的关系密切密切能在没有蛋白质合成能在没有蛋白质合成的情况下继续复制的情况下继续复制在基因克隆中的应用在基因克隆中的应用前景前景小小大大3 Specificity of Plasmid VectorsAutonomously replicating DNA m

5、oleculesn(have an origin of replication)Selectable marker,such as drug resistanceInsertion site for foreign DNAn(often a genetically engineered multiple cloning region with sites for several restriction enzymes)multiple cloning sites 人工合成的人工合成的DNADNA序列，含有密序列，含有密集排列的多种限制性内切酶识别集排列的多种限制性内切酶识别序列，以利于不同来源

6、的外源序列，以利于不同来源的外源DNADNA片段插入载体。片段插入载体。pBRpBR系列载体系列载体4 pBR质粒载体筛选的原理质粒载体筛选的原理5 pBR质粒载体的筛选方法质粒载体的筛选方法双抗生素对照筛选法双抗生素对照筛选法6 pUC系列载体 由由pBR质粒与质粒与M13噬菌体构建成的双链噬菌体构建成的双链DNA质粒载体，长质粒载体，长2674bp，1983年构建。年构建。（1 1）构建）构建主要特点：氨苄青霉素抗性基因、主要特点：氨苄青霉素抗性基因、lac Zlac Z基因、基因、复制起始点（复制起始点（oriori）（2）筛选原理及方法 含有来自大肠杆菌的含有来自大肠杆菌的lacZ操纵

7、子的操纵子的DNA片段片段（lacZ基因），编码基因），编码-半乳糖苷酶氨基端的一个片半乳糖苷酶氨基端的一个片段。此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型段。此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型-半乳糖半乳糖苷酶实现基因内互补（苷酶实现基因内互补（互补），形成完整的互补），形成完整的-半半乳糖苷酶。该酶能分解乳糖苷酶。该酶能分解X-gal，形成蓝色菌落。，形成蓝色菌落。外源基因插入载体后，外源基因插入载体后，lacZ被破坏，不能分解被破坏，不能分解X-gal，菌落呈白色。，菌落呈白色。“蓝白斑蓝白斑”筛选法。筛选法。7质粒载体的主要用途保存和扩增片段小于保存和扩增片段小于2kb的的DNA；构建构建cDNA

8、文库；文库；目的目的DNA测序；测序；制备探针。制备探针。缺点：所能接受的缺点：所能接受的DNADNA片段容量小；转化效率低。片段容量小；转化效率低。三、噬菌体载体 噬菌体的基因组是约噬菌体的基因组是约50kb的线性双链的线性双链DNA分子，两端各有分子，两端各有12个核苷酸的个核苷酸的5突突出，碱基互补（出，碱基互补（cos位点，又称粘端）。位点，又称粘端）。噬菌体感染宿主菌后，其粘端通过碱基噬菌体感染宿主菌后，其粘端通过碱基配对而结合，形成环状配对而结合，形成环状DNA分子。分子。1噬菌体在细菌内的生长方式：裂菌性生长（裂菌性生长（lytic pathway）：在宿主菌中大）：在宿主菌中大

9、量复制并组装成子代噬菌体颗粒，导致宿主菌量复制并组装成子代噬菌体颗粒，导致宿主菌裂解。裂解。溶菌性生长（溶菌性生长（lysogenic pathway）：整合到）：整合到宿主菌宿主菌DNA分子中，随宿主菌分子中，随宿主菌DNA复制并转复制并转到子代细菌中。到子代细菌中。2噬菌体结构 野生型的野生型的噬菌体基因组庞大而复杂，有约噬菌体基因组庞大而复杂，有约48.5kb48.5kb，约占基因组总，约占基因组总长度长度3030的中间部分的基因对噬菌体生长是非必需的，可以直接插入外的中间部分的基因对噬菌体生长是非必需的，可以直接插入外源基因或切除该区域而由外源基因代替而不影响噬菌体的生存。源基因或切除

10、该区域而由外源基因代替而不影响噬菌体的生存。DNA DNA与与噬菌体载体组成重组噬菌体载体组成重组DNADNA分子后，还不能直接分子后，还不能直接转染宿主细胞，必须首先包装成有活性的成熟噬菌体颗粒转染宿主细胞，必须首先包装成有活性的成熟噬菌体颗粒后才具有转染宿主细胞的能力，重组后才具有转染宿主细胞的能力，重组DNADNA分子能否被噬菌体分子能否被噬菌体包装蛋白、头部所识别而被包装，除必须含有包装蛋白、头部所识别而被包装，除必须含有coscos位点外，位点外，就是对重组就是对重组DNADNA分子长度有严格的限制，必须不能大于野生分子长度有严格的限制，必须不能大于野生型基因组长度的型基因组长度的1

11、05105或小于或小于7575，否则均不能被包装成有，否则均不能被包装成有活性的噬菌体颗粒，因此噬菌体载体大致允许插入外源基活性的噬菌体颗粒，因此噬菌体载体大致允许插入外源基因的长度范围为因的长度范围为151525kb25kb。噬菌体载体在细菌中以溶菌状态生长。它有两噬菌体载体在细菌中以溶菌状态生长。它有两种形式：插入载体和替代载体。种形式：插入载体和替代载体。3 插入载体 经 人 工 改 造 而 成，具 有 单 一 的经 人 工 改 造 而 成，具 有 单 一 的EcoR酶切位点，该酶切位点位于酶切位点，该酶切位点位于lacZ基因内，使用蓝白斑筛选法。基因内，使用蓝白斑筛选法。插入插入片段长

12、度约几个片段长度约几个kb，主要用于构建，主要用于构建cDNA文库。文库。插入载体的插入载体的筛选原理筛选原理 4 替代载体替代载体 噬菌体基因组中央部分约有噬菌体基因组中央部分约有14kb14kb主要主要编码抑制性因子，非裂菌性生长所必需，编码抑制性因子，非裂菌性生长所必需，作为载体这部分可被外源作为载体这部分可被外源DNADNA所替代。所替代。此载体中央部分两端有三个酶切位点。可此载体中央部分两端有三个酶切位点。可插入片段的长度约插入片段的长度约9 922kb22kb，主要用于构建基，主要用于构建基因组文库。因组文库。不足：噬菌体载体在进行真核基因组文噬菌体载体在进行真核基因组文库构建时，

13、其容量仍然受到一定的限库构建时，其容量仍然受到一定的限制。最大插入片段不能超过制。最大插入片段不能超过23kb。四、粘粒载体 1978年构建，由质粒和噬菌体的年构建，由质粒和噬菌体的cos粘粘性末端构建而成。插入片段性末端构建而成。插入片段2945kb。可根据载体携带的抗药性标记筛选阳性可根据载体携带的抗药性标记筛选阳性克隆细胞株。克隆细胞株。构成：质粒复制起始点、一个或多个限制性构成：质粒复制起始点、一个或多个限制性内切酶位点、抗药性基因、内切酶位点、抗药性基因、噬菌体的噬菌体的coscos位点。粘粒载体大小为位点。粘粒载体大小为4 46kb6kb。粘粒克隆外源DNA的步骤：外源外源DNA与

14、粘粒载体用同一种内切酶酶切；与粘粒载体用同一种内切酶酶切；连接酶连接，外源连接酶连接，外源DNA插入到两个线状粘粒之间；插入到两个线状粘粒之间；离体包装，组成成熟的噬菌体颗粒。该过程对离体包装，组成成熟的噬菌体颗粒。该过程对DNA分子长分子长度有严格的限制，过长或过短均不能被包装，所以虽然粘度有严格的限制，过长或过短均不能被包装，所以虽然粘粒只有几千个碱基，但要求插入的外源基因却必须是大片粒只有几千个碱基，但要求插入的外源基因却必须是大片段（段（2545kb）。）。体外包装好的颗粒感染宿主菌，重组载体由于缺乏噬菌体体外包装好的颗粒感染宿主菌，重组载体由于缺乏噬菌体其他部分基因，故不能像噬菌体一

15、样复制，只能像质粒一其他部分基因，故不能像噬菌体一样复制，只能像质粒一样扩增。样扩增。五、BAC(bacterial artificial chromosome)与标准的质粒载体相似，但有不同的与标准的质粒载体相似，但有不同的ori和编码和编码ori蛋白的蛋白的F因子；因子；可容纳大于可容纳大于300kb的外源的外源DNA；重组子可通过电脉冲穿孔高效导入细菌细胞；重组子可通过电脉冲穿孔高效导入细菌细胞；进入细胞的拷贝数低。进入细胞的拷贝数低。六、YAC(yeast artificial chromosome)由酵母的染色体经人工改建而成。由酵母的染色体经人工改建而成。优点优点：1 1 酵母是真

16、核细胞，能真核基因序列，尤其是重复序列；酵母是真核细胞，能真核基因序列，尤其是重复序列；2 2 能克隆很大的能克隆很大的DNADNA片段（片段（2Mb2Mb）。）。缺点缺点：转化效率低，形成的克隆数少，每个细胞仅含一个拷贝。转化效率低，形成的克隆数少，每个细胞仅含一个拷贝。人类基因组计划中作物理图的工具。人类基因组计划中作物理图的工具。YAC YAC载体序列包括着丝粒序列（载体序列包括着丝粒序列（CEN1CEN1）、端粒序列（）、端粒序列（TEL TEL 使使线形线形DNADNA的完全复制和保护染色体末端免于核酸酶的降解的完全复制和保护染色体末端免于核酸酶的降解）、自）、自主复制序列（主复制序

17、列（ARS1 ARS1 主导染色体主导染色体DNADNA的自主复制的自主复制）、氨苄青霉素）、氨苄青霉素抗性基因（抗性基因（AmpAmp）、源于）、源于E.coliE.coli的复制起始区（的复制起始区（oriori）。）。由于酵母细胞内真正必需的由于酵母细胞内真正必需的DNADNA片段主要片段主要限于几百碱基对，因而就可以用酵母染色体限于几百碱基对，因而就可以用酵母染色体复制子复制子ARSARS元件构建新型的克隆载体。元件构建新型的克隆载体。YACYAC的基本构成为二个端粒、一个着丝粒的基本构成为二个端粒、一个着丝粒及及ARSARS元件，以适当大小的外源元件，以适当大小的外源DNADNA串成

18、线状串成线状分子，端粒以正确取向位于末端。分子，端粒以正确取向位于末端。宿主宿主：酵母宿主菌：酵母宿主菌AB1380菌株含菌株含ade-2基因，因赭石突变呈红色；基因，因赭石突变呈红色；YAC含含SUP4基因，克服基因，克服ade-2突变，使菌突变，使菌株恢复到野生型，呈白色。株恢复到野生型，呈白色。外源基因克隆进外源基因克隆进SUP4基因会引起插入失基因会引起插入失活，菌株重新变成突变型活，菌株重新变成突变型红色。红色。鉴定鉴定：Approximate Maximum Length of DNA That Can Be Cloned in VectorsVector TypeCloned D

19、NA(kb)Plasmid20phage25Cosmid45P1 phage100BAC(bacterial artificial chromosome)300YAC(yeast artificial chromosome)1000七、表达载体原核细胞表达载体；原核细胞表达载体；真核细胞表达载体。真核细胞表达载体。表达载体适用于在受体细胞中表达外源表达载体适用于在受体细胞中表达外源基因，产生相关蛋白质。为产生大量天然基因，产生相关蛋白质。为产生大量天然状态含量极少的蛋白组份提供了可能，具状态含量极少的蛋白组份提供了可能，具有重要的医学应用价值（如：胰导素、干有重要的医学应用价值（如：胰导素、干

20、扰素等）。分为：扰素等）。分为：可控制的高效启动子，可被可控制的高效启动子，可被RNA聚合酶识别，经诱导聚合酶识别，经诱导后能启动目的基因转录出大量后能启动目的基因转录出大量mRNA；调控序列、起始密码子；调控序列、起始密码子；在克隆基因和启动子之间要有正确的阅读框架，不引起在克隆基因和启动子之间要有正确的阅读框架，不引起读框移位；读框移位；SD序列；序列；有很强的终止子，保证只转录目的基因，而不转录其他有很强的终止子，保证只转录目的基因，而不转录其他DNA。除克隆载体需要的一些序列外（选择性标记、多克隆位除克隆载体需要的一些序列外（选择性标记、多克隆位点等），还需要外源基因转录和表达所必需的

21、元件：点等），还需要外源基因转录和表达所必需的元件：1原核表达载体产生非融合型表达蛋白载体产生非融合型表达蛋白载体：非融合蛋白是不与细菌的任：非融合蛋白是不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白。其优点是，它具有何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白。其优点是，它具有近似于真核生物体内蛋白质的结构。缺点是，易被细菌蛋近似于真核生物体内蛋白质的结构。缺点是，易被细菌蛋白酶所破坏。白酶所破坏。产生融合型表达蛋白载体产生融合型表达蛋白载体：融合型蛋白是指蛋白质的：融合型蛋白是指蛋白质的N末末端由原核端由原核DNA序列或其他序列或其他DNA序列编码，序列编码，C端由真核端由真核DNA的完整序列编码。这样

22、产生的融合蛋白是由一条短的原核的完整序列编码。这样产生的融合蛋白是由一条短的原核多肽与真核蛋白质结合而成。优点是，抵御细菌蛋白酶的多肽与真核蛋白质结合而成。优点是，抵御细菌蛋白酶的降解，构成一些信号肽使重组蛋白转移到细胞内合适的位降解，构成一些信号肽使重组蛋白转移到细胞内合适的位置。置。由哈佛大学的由哈佛大学的GilbertGilbert实验室构建。在大肠杆菌实验室构建。在大肠杆菌细胞中能高水平表达外源细胞中能高水平表达外源基因。由基因。由PBR322PBR322构建，包构建，包括：括：tactac杂合强启动子、操杂合强启动子、操纵子、纵子、SDSD序列、包括序列、包括PUC8PUC8的多克隆

23、位点和的多克隆位点和rrnB rRNArrnB rRNA转录终止子。宿主转录终止子。宿主JM105JM105大大肠杆菌菌株。属于非融合肠杆菌菌株。属于非融合型表达载体。型表达载体。载体含有：载体含有：tactac启动子、启动子、LacLac操纵基操纵基因、因、SDSD序列、序列、LacILacI阻遏蛋白基因等。阻遏蛋白基因等。SDSD序列下游是谷胱序列下游是谷胱甘肽巯基转移酶基甘肽巯基转移酶基因，克隆的外源基因，克隆的外源基因就是与这个酶基因就是与这个酶基因相连接。基因表因相连接。基因表达产物为谷胱甘肽达产物为谷胱甘肽巯基转移酶和目的巯基转移酶和目的基因的融合体。其基因的融合体。其表达的融合蛋

24、白使表达的融合蛋白使用凝血酶和用凝血酶和XaXa因子因子就可从表达的融合就可从表达的融合蛋白中切下所需要蛋白中切下所需要的蛋白质和多肽。的蛋白质和多肽。2 真核表达载体原核原核DNA序列：序列：Ori、抗生素抗性基因、单克隆、抗生素抗性基因、单克隆位点；位点；启动子；启动子；增强子；增强子；终止信号和加终止信号和加poly A信号；信号；遗传选择标记（报告基因）：有效地筛选出转化遗传选择标记（报告基因）：有效地筛选出转化细胞。细胞。构成：构成：原理 多使用病毒载体。这些真核生物的病毒核酸经改多使用病毒载体。这些真核生物的病毒核酸经改建之后，具有真核细胞可以识别的启动子，能够使建之后，具有真核细

25、胞可以识别的启动子，能够使克隆的外源基因及其某些常用的报告基因得以表达。克隆的外源基因及其某些常用的报告基因得以表达。当这些病毒感染宿主细胞后，在感染周期中可持续当这些病毒感染宿主细胞后，在感染周期中可持续地复制，从而使基因组拷贝数达到相当的水平；若地复制，从而使基因组拷贝数达到相当的水平；若克隆的外源目的基因可以插入到这些病毒的基因组克隆的外源目的基因可以插入到这些病毒的基因组中，病毒感染后的很短时间内，其拷贝数也会增加，中，病毒感染后的很短时间内，其拷贝数也会增加，使基因达到有效的表达。使基因达到有效的表达。一、各种病毒载体系统的特点特征特征逆转录病逆转录病毒载体毒载体腺病毒载腺病毒载体体

26、单纯疱疹单纯疱疹病毒载体病毒载体E B 病 毒病 毒载体载体腺相关病腺相关病毒载体毒载体痘病毒载痘病毒载体体野 生 型 病野 生 型 病毒毒二 倍 体 正二 倍 体 正链链RNA病病毒 长毒 长 8 10kb双 链 线 状双 链 线 状DNA病毒，病毒，长长36kb双 链 线 状双 链 线 状DNA病毒，病毒，有有4种异构种异构体，长体，长152kb双 链 线 状双 链 线 状DNA病毒，病毒，长长172kb单 链 线 状单 链 线 状DNA病毒，病毒，双 链 线 状双 链 线 状DNA病毒，病毒，长长190kb外 源 基 因外 源 基 因插 入 最 大插 入 最 大容量容量8kb7.5kb3

27、0kb？4.4kb40kb在 细 胞 内在 细 胞 内定位定位细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞浆细胞浆宿主范围宿主范围较宽较宽宽宽宽宽宽宽宽宽？基 因 表 达基 因 表 达持续持续长 期、稳长 期、稳定表达定表达瞬时表达瞬时表达瞬时表达瞬时表达长期表达长期表达长 期、稳长 期、稳定表达定表达瞬时表达瞬时表达基 因 表 达基 因 表 达水平水平中等中等高高中等中等高高中等中等高高二、酵母细胞的表达载体酵母整合质粒；酵母整合质粒；酵母复制型质粒；酵母复制型质粒；酵母附加体质粒；酵母附加体质粒；酵母着丝点质粒。酵母着丝点质粒。酵母是一种低等真核细胞，对蛋白具有一定的修

28、饰酵母是一种低等真核细胞，对蛋白具有一定的修饰作用。在酵母中有一种天然质粒，长约作用。在酵母中有一种天然质粒，长约2m2m，在酵母中，在酵母中，它的拷贝数高，但易丢失。目前常用酵母载体是以克隆它的拷贝数高，但易丢失。目前常用酵母载体是以克隆质粒载体为基础，插入酵母的启动子和终止子构建起来质粒载体为基础，插入酵母的启动子和终止子构建起来的，主要有以下几种：的，主要有以下几种：三、昆虫细胞表达载体 昆虫细胞能有效地对表达外源蛋白进行加工修饰，同昆虫细胞能有效地对表达外源蛋白进行加工修饰，同时还可以将外源蛋白分泌到细胞外，易于蛋白的分离和纯时还可以将外源蛋白分泌到细胞外，易于蛋白的分离和纯化。昆虫细

29、胞载体是用易感染昆虫的病毒改建而来的，常化。昆虫细胞载体是用易感染昆虫的病毒改建而来的，常用的是昆虫杆状病毒载体。优点：容量大，可以插入大片用的是昆虫杆状病毒载体。优点：容量大，可以插入大片段外源段外源DNA，对宿主有严格的专一性，对脊椎动物无害，对宿主有严格的专一性，对脊椎动物无害，携带了外源基因的病毒载体还可以直接感染昆虫的幼虫，携带了外源基因的病毒载体还可以直接感染昆虫的幼虫，表达大量的外源蛋白。表达大量的外源蛋白。四、电子克隆定义：通过基因数据库序列搜索、对比分定义：通过基因数据库序列搜索、对比分析、拼接整合，预测新的、假定的全长基析、拼接整合，预测新的、假定的全长基因，然后通过分子生物学方法，加以证实，因，然后通过分子生物学方法，加以证实，并从相应的、细胞中获得这种基因，即电并从相应的、细胞中获得这种基因，即电子克隆（子克隆（in silico cloning）。）。基于基于EST数据库电子克隆程序数据库电子克隆程序基于基因组数据库电子克隆程序基于基因组数据库电子克隆程序