代谢物的测定

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1、代谢物的测定-理论知识部分一.相关定义与前言药物进入体内后一般需经历物理变化和化学变化，物理变化是指药物与生物大分子如血浆蛋白的结合反应；化学变化是指体内代谢反应。体内代谢反应也称生物转化，分为一相代谢和二相代谢，一相代谢是指药物在体内发生的氧化反应、还原反应、水解反应。二相代谢是指药物在体内的结合反应，包括：葡萄糖醛酸结合、硫酸酯化、甲基化、乙酰基化、氨基酸缀合、谷胱甘肽缀合等。体内药物及其代谢产物的分析研究将为药浓度、药效和毒性之间的关系，为药物作用机理及药代动力学的研究提供科学的依据，因此近年来的进展令人瞩目,已成为药物研究的重要分支，并形成了一门新型的学科。1.1本节有关定义生物利用度

2、(Bioavailability):剂型中的药物被吸收进入血液的速率和程度。生物等效性(Bioequivalence)：种药物的不同制剂在相同的试验条件下，给以相同的剂量，反映其吸收速率和程度的主要动力学参数没有明显的统计学差异。二研究代谢物测定的意义2.1测定药物及其代谢物在血液组织及脏器内的分布量，是衡量药物的有效性和安全性的重要指标；2.2测定药物及其代谢物浓度的经时变化，提供可靠的药代动力学数据；2.3研究药物的代谢途径，代谢物的药理活性，生成与消除速度，对于合理用药，避免药物的毒性以及寻找新药有一定意义。2.4有利于生物样品的保存当生物样品如血液米集之后，血浆酯酶有可能继续水解样品中

3、的酯类药物，其他酶类也可能对样品药物继续产生代谢反应，因此，常需加入酶抑制剂。2.5有利于分析方法选择大多数药物的体内代谢反应，只是药物分子结构上某些基团的改变，使代谢物与母体药物的化学结构十分相似，从而导致某些物理性质无较大差异，光谱分析及免疫分析法经常面临代谢物的干扰，欲测定生物样品中的药物和代谢物含量时，应用色谱法是适当的选择，因其具备分离、分析功能，能避开代谢物的干扰或直接测定代谢物。2.6有利于选择样品分离、提取的方法药物经体内代谢后，生成的代谢物一般极性增大，水溶性增强，因此将药物自生物样品中分离、提取时，常利用它们之间极性和离解行为为的差别，选择适当pH的缓冲液和溶剂系统将其分开

4、。三体内代谢物需要被测定的情况3.1在做药物的1期临床药代动力学试验时，3.1.1如果已知有活性代谢物（药理和毒理），并且浓度足够高，可以测定a）研究的是其药代情况，需要测定代谢物b）仅仅做生物等效性实验，并且原药可以测定时可以不测定代谢产物3.1.2如果已知有活性代谢物，但是浓度低，不易测定，可以不测定3.1.3如果代谢产物会影响药物的代谢，分布和排泄时，在研究其药代特征时应该考虑进行代谢产物测定但是代谢产物是否在人体具有活性很难判断，因为其是否有活性均是由其临床前资料支持的。这时候可以参考05年3月版的化学药物临床药代动力学研究技术指导原则和FDA的BioavailabilityandBi

5、oequivalenceStudiesforOrallyAdministeredDrugProducts-GeneralConsiderations（2003年）3.2在对生物样品中代谢物浓度的检测时，3.2.1代谢物能影响药物的安全性和有效性时：药代动力学研究：同时测定母体药物和代谢物的浓度，等效性试验：同时测定母体药物和代谢物的浓度,等效性评价时以母体药物作为主要判断指标。322主要代谢物活性不清楚时：药代动力学研究:测定母体药物和代谢物浓度，等效性试验:测定母体药物浓度。3.2.3前药浓度很低，代谢物为体内主要存在形式时：药代动力学研究:测定母体药物和代谢物浓度，等效性评价:测定代谢物的

6、浓度。324前体药物：药代动力学研究:测定母体药物（如果能测到）和代谢物浓度，等效性试验:测定代谢物浓度。四代谢物测定时常用的生物样本代谢物测定时常用的生物样本血样（血浆、血清和全血）、尿样、唾液。常用生物样本的采集与储存：血浆全血加抗凝剂，离心，取上清液；血清全血离心，取上清液。采血后必须尽快离心分离出血浆或血清，置一20C以下冷冻保存。尿样一一收集服药后一定时间内尿样，记录体积，混合均匀后取一定量，测定尿中药物浓度，计算一定时间内尿中药物的累积量。唾液漱口15分钟后收集口内自然流出或经舌在口内搅动后流出的混合唾液，离心后取上清液。样本采集后不能及时测定，可置4C冷藏，若放置时间较长，则需-

7、20C-80C冷冻保存。五代谢物测定的方法代谢产物的测定是药物代谢研究中最经典、同时也是十分有效的方法之一。由于药物最终会通过与母核相关的一种或多种代谢物排出体外，因此，分离鉴定测定代谢产物可在一定程度上了解药物的代谢途径。近年来，HPLC,GC-MS,LC-MS及GC-MS-MS,LC-MS-MS,LC-NMR及LC-MS-NMR等高速、高效、高灵敏度的分析方法已用于代谢产物的分析和测定。5.1.HPLC的方法由于体液中药物及代谢产物含量极微，又与大量内源性成分相混杂，因此，只有分析方法可靠才能保证分析结果准确。气相色谱-质谱法（GC-MS）是分析微量乃至超微量化合物的有力工具，在这一领域中

8、应用颇多。但是许多药物和代谢产物缺乏挥发性和热稳定性，限制了它的应用。近年来，高效液相色谱法（HPLC）以适用范围广、分离效率高、组分易回收及快速简便为特点，伴以灵敏度高、选择性强的检测器的开发和应用，在诸多的分析方法中后来居上，成为分析体内药物代谢产物的不可缺少的手段之一。因为体内药物及代谢产物含量甚微，很难收集到足够的样品量测定四大光谱即红外、紫外、核磁共振和质谱。因此，以HPLC为工具定未知物就成为需要解决的难题之一。LC-MS虽然有效，却因仪器价格昂贵不能广泛应用。目前仍常用以经验推断的化合物为对为了去除内源性成分的干扰，保证色谱柱的柱效和寿命，进行生物样品的前处理是极其重要的。5.1

9、.1分离对于选用的不同的生物样品类型进行不同的预处理。如血样（包括血清、血浆）可直接上样进行固相萃取，但若药物与蛋白结合，则会降低萃取回收率，故要去除代谢物中蛋白质，使结合型药物释放出来，以测定总浓度。得到较“干净”的提取液，减少乳化，消除对测定的干扰。而唾液样品则主要采用离心沉淀除去粘蛋白，取上清液测定药物浓度。要测定尿液中的缀合物常需采用酸水解法或酶水解法使缀合物水解。常用去蛋白质方法：蛋白质沉淀法一一生成不溶性盐或盐析和脱水作用。常用的蛋白质沉淀剂包括有机溶剂（乙腈、甲醇、乙醇及丙酮等）、碳酸铵盐、无机酸（三氯乙酸、高氯酸等）和重金属盐（汞盐、钨酸盐及铜盐等）。由于经有机溶剂或酸处理后的

10、生物样品与反相HPLC分析相匹配，因此应用最为广泛。组织酶消化法一一蛋白水解酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶等。近年来，用微孔膜滤除蛋白质的方法已见报道，具有简便快速的优点，但只能测定游离状态的化合物。用酸碱性离子交换树脂去除与碱酸性化合物共存的蛋白质，可同时完成纯化和富集过程，因此也常被应用。512提取从生物样品中提取待测物通常有液相提取和固相提取两种，分析超微量化合物时尤为必要。液相提取亦即溶剂提取，常用的有机溶剂有：正醇、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙醚、苯及正己烷等等以及它们的混合溶液。有时为了减少乳化可加入少量的甲醇或乙醇。为了有效地提取酸、碱性药物，通常需要调节样品的pH，碱药物一般调至高于

11、其pKa12个单位，酸性药物则调至低于其pKa12个单位，使药物处于非解离状态而易被提取。提取高度电离的化合物（如季铵盐或磺酸盐）以及两性化合物（如氨基酸）时，则须加入离子对试制。酸性化合物一般选用季铵盐或叔铵盐，碱性化合物则选用烷基或芳基磺酸盐类以形成离子对，提高有机溶剂由于有机溶剂一般有毒易燃，蒸发去除溶剂可能引起待测物损失以及有时出现乳化现象等，因此，更为简便有效的提取方法成为寻求的目标。其中固相提取法显示出广阔的前景。经典的固相提取剂有氧化铝、活性炭及硅藻土等。由于氧化铝能选择地吸附邻酚羟基化合物，因此至今仍常使用，通常在弱碱性介质ph8左右）中进行吸附，水洗去杂质后用酸洗脱待测物。影

12、响液-液提取的因素：有水相pH值、提取溶剂和离子强度等1）水相pH碱性药物：PH高于药物的pKa23单位；酸性物质：VpKa23单位2）提取溶剂提取溶剂的选择既要考虑提取的选择性，同时也要考虑操作是否方便，在满足提取效率的同时选取极性尽可能小的溶剂，使既有合适的回收率，又可将干扰物质降到最低。一般可根据相似相溶原则进行选择，选择沸点低的溶剂。当样品中药物性质未知时，可用乙醚、氯仿分别作为酸性和碱性药物的提取溶剂。3）离子强度在水相中加中性盐，如NaCl,可增加离子强度，使溶液中水分子与无机离子强烈缔合，导致与药物缔合的水分子减少，使药物在水相中溶解度变小，有利于有机溶剂提取。4）有机相和水相体

13、积1:1或2:1影响液-固提取的因素：分离度和回收率是反映提取效率的重要指标，影响提取率的主要因素是：1）洗脱液流速一一流速太快，分离度下降，样品流失，回收率低，重现性差。2）样品装载量一一有效装载量取决于被测物的容量因子、固定相量和样品浓度。过载，导致样品流失。根据药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等选择其预处理及检测方法A）具有亲脂性的药物在适当的pH值下用溶剂萃取B）具有强极性或亲水性的药物选择沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍生化后萃取的方法等C）具有挥发性的药物选择GC测定法D）具有光谱或电化学特性选择分析检测方法E）要根据药物的稳定性选择萃取浓缩技术：对酸碱不稳定避免使用强酸

14、或强碱性溶剂，对热不稳定的药物避免高温蒸发溶剂，对光不稳定的药物避免见光。样品处理步骤与分析方法的选择如下图所示图2-L祥品建理步舉与幷析方注的选择5.2其他测定代谢物的方法由于药物最终会通过与母核相关的一种或多种代谢物排出体外，因此，分离鉴定代谢产物可在一定程度上了解药物的代谢途径。这时也可用特殊的分析手段如GC-MS,HPLC-MS,GC-MS-MS,LC-MS-MS,LC-NMR及LC-MS-NMR分析方法，它们具有高速、高效、高灵敏度的特点，并且有着绝对的专一性。并且可在检测出极微量代谢产物的同时鉴定代谢产物的结构。吸收度比，光电二极管矩阵检测，蒸发光散射检测，或双检测器（紫外、荧光）的应用也是一些特殊的方法。在缺乏上述技术时，应仔细比较各色谱峰的峰型和保留时间。PS:测定代谢物具体方法分析的文献见队友的文档。