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1、 RNA i 及其应用实例 2006 Nobel Prize生理学（医学奖生理学（医学奖)RNA interference“沉默沉默”是是金金后基因组研究焦点：基因功能研究抑制基因表达抑制基因表达观察功能变化观察功能变化KnockOut 法法Antisense法法Ribozyme法法RNAi法法概 念：RNA interference（RNAi）与靶基因序列同源的双链RNA所诱导一种序列特异性的转录后基因沉默现象。RNAi 发现历程：1990年，曾有科学家给矮牵牛花插入一种催生红色素的基因，希望能够让花朵更鲜艳。但意想不到意想不到的事发生了：矮牵牛花完全褪色，花瓣变成了白色！?1995年 康奈
2、尔大学 Guo等在对线虫的研究中，应用正义链RNA作为对照，研究par-1基因的表达，意外的发意外的发现现，正义链RNA与反义链RNA同样能够抑制目的基因的表达。1998年，Andrew Fire等首次将正义链反义链RNA混合注入线虫中，观察到更强的基因表达抑制。首次提出了RNA interference的概念。Mex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridizationRNAi机制 DicerRISC碱基互补碱基互补酶解酶解short-interfering RNAQuickTime and aGIF decompressorare nee
3、ded to see this picture.加工长链加工长链 dsRNA形成形成 21-23 nt 小片段小片段3427212016Tuschl,2001Dicer contains two RNAse III domainssiRNAslong dsRNARISC:RNA-Induced Silencing ComplexExonucleaseHomology search activityEndonucleaseHelicase53Target mRNAOH35P形成RISC复合物，降解目的mRNARNAi 的生物学意义：一种古老、保守而又及其重要的遗传学行为。生物体在长期的进化过程中
4、对异常基因活动的监控和防御,有学者称之为“基因组水平的免疫系统”。一种抗病毒感染机制。与其他反基因技术的比较：优点：1、特异性好；2、抑制效率高；3、操作相对简单，实验周期短；缺点：1、靶点选择的不确定性；2、核酸的不稳定性，dsRNA引入细胞的常见问题；3、脱靶效应；4、生物安全性（质粒，病毒等）。RNAi 的应用：功能基因组学 药物靶筛选和验证 细胞信号传导通路分析 基因治疗的新策略基因治疗方面的应用 RNAi RNAi方法在哺乳动物细胞中的应用方法在哺乳动物细胞中的应用 得益于RNAi机制的研究，小分子干扰RNA（short interfering RNA，siRNA)概念的引入。哺乳动
5、物细胞中的哺乳动物细胞中的 RNAi 现象现象长链长链dsRNA所有基因表达下降所有基因表达下降RNAi 现象现象PKR,RNase L 活性化活性化X干扰素干扰素RNAi过程的功能单元：过程的功能单元：siRNA19 nt duplex2 nt 3 overhangsRNAi方法的核心步骤siRNA的设计：1、从转录本（mRNA）的AUG起始密码下游75bp开始，寻找“AA”二连序列，并记下其后面的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%60%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。靶点的选择往往是试验性的。2、将候选的靶点序列和相应的基因组数据库等
6、进行BLAST比较。3、选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。提供RNAi 在线技术支持的公司（网站）siRNA制备常用的五种方法：1、化学合成；2、体外转录；3、长片断dsRNAs经RNase III 类降解(e.g.Dicer,E.coli,RNase III)；4、siRNA表达载体在细胞中表达形成shRNAs；5、PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达。一、化学合成：1、高质量，高纯度。2、高成本适用于已经验证过抑制效率的靶点序列不适于筛选靶点序列二、体外转录：1、成本适中2、省时适用于筛选靶点序列不适用于长期的研究或者
7、针对某个特定靶点序列的大量研究应用T7 RNA polymerase 体外转录方法常需要RNA的起始两个核苷酸是 GG or GA，这样合成效率才有保障。(Milligan 1987）三、长片断dsRNA酶解法：200-1000nt的dsRNA体外被Rnase家族成员切割成siRNA不需要验证筛选多个靶点序列适用于LOF表型分析不适用于长期研究或者特定siRNA序列的研究四、siRNA表达质粒或者病毒载体在细胞中表达siRNAsRNA polymerase III(pol III):human U6 promoters mouse U6 promoters the human H1 promo
8、ter商品化载体的siRNA策略示意图载体介导的细胞内表达siRNA 方法的特点1、操作简便，稳定性好;2、siRNA表达载体一旦构建成功，可以无限制的应用于研究;3、可能建立可以调节表达的系统;4、受转染等因素的影响比较大。适用于长期的对于某个基因的研究，尤其是带有筛选标记的载体，能够用于构建特定基因缺陷（knockdown）的细胞株五、siRNA Expression Cassettes(SECs)方法快速、不需要克隆测序等步骤适用于筛选多个候选靶点序列的抑制效率RNAi实例：Target gene：c-myc 2、3、or 1、检索文献获取有实验证明有效的靶点序列（核对）目的基因mRNA
9、获取：利用生物学软件利用生物学软件组配组配长链长链 oligooligo，（合成单链，（合成单链DNADNA（直接带有（直接带有4 4个个bpbp的酶切位点粘性末端的酶切位点粘性末端)；载体构建：载体构建：dsDNAdsDNA形成：形成：annealingannealing 载体的酶切和回收载体的酶切和回收 连接连接 转化转化 鉴定鉴定转染：转染：瓶颈之一瓶颈之一 含有真核细胞筛选标志含有真核细胞筛选标志 含有荧光标志含有荧光标志效应检测：效应检测：mRNAmRNA水平和蛋白水平兼顾水平和蛋白水平兼顾Down but not out!由由RNAi结果总结的结论应该客观。结果总结的结论应该客观。目的蛋白的生物学功能特点目的蛋白的生物学功能特点组成型？组成型？诱导型？诱导型？高表达？高表达？低表达？低表达？转录调节为主？转录后调节？转录调节为主？转录后调节？谢谢 谢！谢！
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