3胰岛素释放试验

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1、实验三 胰岛素释放试验胰岛素是一分子量约为6000D的激素肽，由胰岛的0细胞分泌，经门静脉和 肝脏进入血循环。血清（浆）胰岛素水平受血糖浓度调控，血糖水平升高可刺激胰 岛细胞分泌胰岛素。糖尿病时，由于胰岛0 细胞分泌功能障碍和胰岛素生物学效 应不足（肝脏和外周组织对胰岛敏感性降低，对胰岛素的促进葡萄糖摄取作用抵 抗）,从而产生高血糖症，亦可伴高胰岛素血症。检查胰岛素分泌功能对诊断 IDDM 有重要意义。在胰岛素依赖型糖尿病病人血清中常发现有胰岛素抗体,此抗体使胰岛素不 能发挥其生物活性，而且还会使胰岛分泌功能逐渐减退，甚至完全消失。因而胰 岛素浓度测定或 OGTT 不能得到准确的结果。胰岛素释

2、放试验（insdn release test）是反映胰岛0细胞储备能力的试验，与 OGTT方法相同：即在空腹及服糖后30、60、120及180分钟采血分别测胰岛素和 C-肽，以直接了解胰岛0细胞功能。胰岛素测定方法有放射免疫法（RIA）和时间分辨荧光及化学发光免疫比浊法。【原理】采用双抗体夹心法，整个过程18分钟完成。第1步：20?l标本、生物素化的抗胰岛素单克隆抗体和钉（Ru）标记的抗 胰岛素单克隆抗体混匀，形成夹心复合物。第2步：加入链霉亲和素包被的微粒，让上述形成的复合物通过生物素与链 霉亲和素间的反应结合到微粒上。第3步：反应混和液吸到测量池中，微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的 物质

3、被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定。 检测结果由机器自动从标准曲线上查出。此曲线由仪器通过2点定标校正，由从 试剂条形码扫描入仪器的原版标准曲线而得。【标本采集和准备】1. 必须选择以下的标本进行测定 血清：使用标准取样试管或含分离胶的试管采集。血浆：肝素锂、 EDTA-K3 或柠檬酸钠抗凝。2. 溶血有干扰，因为红细胞释放可降解胰岛素的肽酶。3. 标本在15 25C可稳定4小时，2 8C可稳定24小时，20C可稳定6个 月。只可冻融一次。4. 含沉淀的标本使用前需离心。5. 不要使用加热灭活的标本。6. 标本和质控品禁用叠氮钠防腐。7. 标本、定标液和质控品在测定

4、前的温度应与室温平衡；放入仪器后应在2 小时内测定以避免蒸发的影响。【试剂】厂家提供原装试剂，可直接使用。1. 试剂： 胰岛素试剂盒， 100人份测试。M：链霉亲和素包被的微粒，6.5ml。链霉亲和素包被的微粒浓度0.72mg/ml,生物素结合能力470ng生物素/ml 粒子。含防腐剂。R1：生物素化的抗胰岛素单克隆抗体，10ml。生物素化的抗胰岛素单克隆抗体浓度 1.0mg/l，MES 缓冲液 0.05mol/l， PH6.0。含防腐剂。R2： Ru（bpy）32+标记的抗胰岛素单克隆抗体，10ml。Ru（bpy）32+ 标记的抗胰岛素单克隆抗体浓度 1. 75mg/l ， MES 缓冲液

5、0.05mol/l, pH6.0。含防腐剂。2. 试剂的储藏和稳定性：存放在2-8C，切莫倒置，保证磁珠在测定前能完全地被仪器自动混匀。 未开封，可稳定至标明的保质期。开封后，2-8C12周； 放在仪器上， 4 周； 放在仪器上， 4周（室温2 - 25 C ；开盖时间累计不超过20小时）。【质控】1. 仪器配套质控品或其它合适的质控品。2. 各浓度区域的质控至少每24 小时或每一次定标后测定一次。质控间隔期 应适用于各实验室的具体要求。检测值应落在确定的范围内，如出现质控值落在 范围以外，应采取校正措施。请注意：商用质控品可能含动物来源的胰岛素。分析结果时，应考虑相应的交叉 反应。【仪器】

6、全自动电化学发光、化学发光分析仪【仪器校准】1. 应用胰岛素定标液定标。2. 定标频率：每批试剂必须用新鲜试剂（试剂经仪器注册24 小时以内）标 定一次，如再次标定即根据下列要求：2.1 仪器：2.1.1 同一批号试剂一个月；2.1.2 同一试剂盒放置仪器上7天。3. 各种分析仪均适用的情况，根据要求进行标定：如质控结果超出范围时。 【操作步骤】1. 开机：在开机前，必须检查数据备份盘是否存在。开机后仪器自动启动， 此时触摸屏幕显示的状态是仪器上次关机时的状态。若无任何提示，请在屏幕上 随意触摸一下。2. 标本检测前的准备工作2.1 目测检查：各针是否良好，是否有粘附物；管道是否被夹和被折；标

7、 品/试剂加载区、孵育池表面是否干净（吸样区和孵育池上的液体可能引起加样 头或反应杯被黏着，是造成抓手机械故障的隐患。2.2 检查各耗品、试剂、废液等2.3 检查蒸馏水：当蒸馏水用完时，键显红色，提示加水。必要时应对蒸 馏水桶进行清洗。2.4 清空废液桶：当废液桶已满，键显红色，提示清空。注意：清空后， 将废液桶外面的水滴擦去。2.5清空固体废物盘：当Tip和Cup达到1100个左右时，键显红色，提示 清空。注意：在仪器处于 Stand-By 状态，才可将废物盘取出。3标本录入：按Orders进入标本录入屏幕，输入样本编号，试剂盘编号，选择该样本要测的项目，按 Register 键保存输入的标

8、本信息。4. 病人测试运行：按 star 键即可运行。【计算】对每一个标本，仪器会自动计算结果，单位是?U/ml或pmol/l。 换算方法是 pmol/l X 0.144二?U/ml 或?U /ml X 6.945二pmol/l。【生物参考区间】空腹胰岛素为2.624.9“U/ml；服糖后3060min为胰岛素高峰值（与血 糖峰值一样），是空腹胰岛素的510倍。【临床意义】增高见于某些II型糖尿病伴胰岛素抵抗，单纯性肥胖，胰岛素自身免疫综合 症，胰岛素瘤。减低见I型糖尿病，II型糖尿病以胰岛功能衰竭为主，胰腺炎伴发胰岛功能 损害。【注意事项】1. 所有测试结果必须结合临床数据（如：病人症状，其

9、它检测结果，病史， 临床表现，相关信息等）进行有效评估和处理。2. 试剂、标准品和质控品及系统消耗品在有效期内使用。3. 试剂、标准品和质控品:必须严格按照试剂说明书的要求保存和运输试剂， 不得将不同批号的试剂混合使用。4. 系统消耗品：保持消耗品的清洁，必须在原包装条件下保存。5. 溶血有干扰，因为红细胞释放可降解胰岛素的肽酶。标本在15 25C可稳定4小时，2 8C可稳定24小时，20C可稳定6个月。只 可冻融一次。6. 含沉淀的标本使用前需离心。不要使用加热灭活的标本。标本和质控品禁 用叠氮钠防腐。7. 标本、定标液和质控品在测定前的温度应与室温平衡；放入仪器后应在2 小时内测定以避免蒸

10、发的影响。【评价】化学发光免疫比浊法检测范围：0.200-1000?U/ml 结果若低于检测限，仪器将报告结果0.200?U/ml。 结果若高于测定范围，仪器将报告结果1000?U/ml。 分析灵敏度（最低检测限）： 0.200?U/ml化学发光免疫比浊法（y）与酶法（x）比较，99份标本相关 系数为0.958,标本浓度在3.9至80?U/ml。回归方程y=1.00x -1.16。【干扰因素】1该方法不受黄疸（胆红素90mg/dl）、脂血（脂质1800mg/dl）和生物素 60ng/ml 干扰。2. 溶血会产生干扰。3接受高剂量生物素（5mg/天）治疗的病人，至少要等最后一次摄入生物 素8小时

11、后才能采血。不受类风湿因子干扰（18900U/ml）。20种常用药物经试 验对本测定无干扰作用。胰岛素浓度高到 20000?U/ml 也不出现钩状效应。4. 接受过牛、猪或人胰岛素治疗的病人有时会有抗胰岛素抗体，对检测结果 会有影响。5. 接受过小鼠单抗治疗或体内诊断的病人可能会出现假阳性反应。偶尔会遇 到抗钌抗体的干扰。6. 胰岛素测定结果应结合病人的病史、临床症状和其他检查结果进行诊断。C-肽测定c-肽与胰岛素以等摩尔从胰岛素P细胞释放，因此其测定意义与胰岛素相 同。c-肽半寿期为1011分，比胰岛素长，且不被肝脏破坏，只在肾脏降解和 代谢，特别对用胰岛素治疗的病人，测血浆c-肽水平更能准

12、确反映胰岛素功能。 认为糖尿病病人若空腹血浆C-肽三1.9g/L, 口服甲苯磺丁脲后5分钟，C-肽 增致20.4p g/L,此类病人90%在治疗中不需用胰岛素；可通过限制食物和应用 降低血糖的药物来控制病情。若病人空腹C-肽1.9卩g/L（正常人空腹血浆C-肽 为2.2g/L），则需用胰岛素治疗，且C-肽测定与胰岛素测定及胰岛素释放试验、 OGTT 同时进行。【原理】采用双抗体夹心法，整个过程 18分钟完成。第一次孵育：20l标本和一份生物素抗C肽特异性单克隆抗体一起孵育， 一份钌复合体标记的 C 肽特异性单克隆抗体后，反应形成抗原抗体复合体。 第二次孵育：加入链亲和素包被的微粒，复合体在链亲

13、和素和生物素相互作用下 形成固相。将反应液吸入检测池中，检测池中的微粒通过电磁作用吸附在电极表面。未 结合的物质通过 ProCell 除去。在电极上加以一定的电压，使复合体化学发光， 用光电倍增器检测发光的强度。通过检测仪的定标曲线得到最后的检测结果，定标曲线是通过 2 点定标校 正，由从试剂条形码扫描入仪器的原版标准曲线而得。【试剂】 厂家提供原装试剂，可直接使用。1试剂：C-肽试剂盒，100人份测试。M链亲和素包被的微粒6.5ml；链亲和素包被的微粒，0.72mg/ml；结合力: 470ng生物素/mg微粒；经过防腐处理。R1生物素抗C-肽单克隆抗体9ml；生物素抗C-肽单克隆抗体（大鼠）

14、1mg/L； 磷酸盐缓冲液50mmol/L，PH值6.0；经过防腐处理。R2钉复合体标记的抗C-肽特异性单克隆抗体9ml；钉复合体标记的抗C- 肽单克隆抗体（大鼠）0.4mg/L；磷酸盐缓冲液50mmol/L，PH值6.0；经过防腐 处理。2. 试剂的储藏和稳定性：存放于2 8C。请垂直摆放仪器 C 肽试剂盒，以确保使用前自动混合过程中微粒完全有 效。稳定性：2 8C（未开封）：有效期内均可使用。开封后，2 8C:可存放12周。在分析仪上：可保存 8 周。 只有按如下方法收集的标本才适合用本试剂盒检测。【标本采集和准备】血清：必须用标准试管或内有分离胶的试管收集。使用肝素锂和 EDTA-K3

15、血浆。尿液：以 Elecsys Diluent MultiAssayl： 10 稀释在 15-25C可保存 4 小 时；2-8C可保存24小时，在-20C可保存1个月。样品最多可以冻融1次。在使用原始试管处理标本时，应遵循试管生产商所提供的指导。如标本中 有沉淀出现，必须先作离心处理再进行分析。已经加热失活的标本无法分析。使 用叠氮化物作为稳定剂的标本或质控液无法分析。检测前，请确保患者标本、定标液及质控液放置在20-25C的环境中。由 于蒸发因素的影响，标本、定标液及质控液在放入分析仪后请在 2 小时内完成测 定。【仪器】 电化学发光 化学发光【仪器校准】每换一个每批 C 肽试剂的试剂盒上都

16、有条形码记录各批号试剂特异的定标 信息。预先确定的主曲线适用于该仪器配套试剂盒进行测定。1. 定校间隔：对不同批号的试剂盒必须重新进行定标（在试剂盒被分析仪识 别后的 24 小时内）。除此之外，以下情况必须重新进行定标： 电化学发光分析仪：同一批号的试剂盒在分析仪上使用超过1个月（28天）。 同一试剂盒在分析仪上使用超过 7 天2. 根据需要：如质控数据超过额定的限度。3. 定标核实：没有必要对定标进行核实。分析仪的软件会自动对定标结果的 准确性进行分析，当出现任何偏差时系统会自动提醒。【质控】1. 仪器配套试剂和其它适合的试剂均可作为测定时的质控液。2. 在测定时，对于不同浓度范围的标本，每

17、2 4小时内必须进行一次质控测 试。每次更换试剂盒或进行定标后也须进行质控测试。每个实验室须根据各自的 情况确定合适的质控间隔和范围。测定值必须处于规定的范围内。3. 若测定值不在规定的范围内，则每个试验室必须建立相应的矫正方法。 【操作步骤】1. 准备标本：复核标本条码并编号 Yxx， 于 Lis 系统同位素组核收检验申请。2. 开机 在开机前，必须检查数据备份盘是否存在。开机后仪器自动启动，此时触摸屏幕显示的状态是仪器上次关机时的状态。若无任何提示，请在屏幕上随意触摸 一下。3. 标本检测前的准备工作3.1 目测检查 各针是否良好，是否有粘附物；管道是否被夹和被折； 标品/试剂加载区、孵育

18、池表面是否干净（吸样区和孵育池上的液体可能引起加样头或反应杯被黏着，是造成抓手机械故障的隐患。3.2 检查各耗品、试剂、废液等3.3 检查蒸馏水 当蒸馏水用完时，键显红色，提示加水。必要时应对蒸馏水桶进行清洗。3.4 清空废液桶 当废液桶已满，键显红色，提示清空。注意：清空后，将废液桶外面的水滴擦去。3.5 清空固体废物盘当Tip和Cup达到1100个左右时，键显红色，提示清空。注意：在仪器处于 Stand-By 状态，才可将废物盘取出。4. 标本录入按 Orders 进入标本录入屏幕，输入样本编号，试剂盘编号，选择该样本要测 的项目，按 Register 键保存输入的标本信息。5. 病人测试

19、运行：按 start 键即可运行。【计算】分析仪自动计算得出每份标本的测定浓度（单位可为 ug/L 或 ng/mL）。 【生物参考区间】空腹时：1.14.4ng/mL；服糖后3060min出现峰值（为空腹值的510 倍）。【临床意义】1高血糖：11型糖尿病或继发性糖尿病时，由于存在胰岛素抵抗，c-肽和胰岛 素释放曲线较高，空腹血糖及糖耐量曲线也较高。2低血糖：血糖、胰岛素和C-肽三者的血清水平并非平行改变。 胰岛0细胞瘤时，糖耐量曲线低平，胰岛素和C-肽浓度均升高。 胰岛0细胞瘤术后，血清C-肽仍升高，提示肿瘤未切除完全或复发。 外源性胰岛素过量导致低血糖时，血清胰岛素升高，而C-肽降低。3.

20、 肝硬化:血清C-肽水平升高。【注意事项】1. 试剂、标准品和质控品及系统消耗品在有效期内使用。2. 试剂、标准品和质控品:必须严格按照试剂说明书的要求保存和运输试剂， 不得将不同批号的试剂混合使用。3. 系统消耗品：保持消耗品的清洁，必须在原包装条件下保存。【评价】1. 所有测试结果必须结合临床数据（如：病人症状，其它检测结果，病史， 临床表现，相关信息等）进行有效评估和处理。2. 最低限则报告为 0.003nmol/L（0.01ng/L），而高于检测上限则报告 为13.3nmol/L（40ng/L），（如果 10 倍稀释标本则为 133nmol/L，400ng/mL）。【干扰因素】1. 测

21、定结果不受黄疸、溶血、高脂血和生物素的影响。 标准：回收率 90110。2对于因某些疾病需要而接受高剂量生物素治疗的患者（ 5mg/天），必须 在末次生物素治疗 8 小时后采集标本。3. 浓度达1200IU/mL的类风湿因子对检测没有干扰。4当C肽浓度达60nmol/L（180ng/mL）时，未出现高剂量钩状效应。5. 由于本试剂盒使用单克隆鼠抗体，所以因治疗或者诊断需要而接受单克隆 鼠抗体的患者，其标本检测结果可能有误。6. 极少数标本中可出现大量链亲和素和抗钌抗体而影响测定结果。Elecsys C 肽附带有试剂添加剂以减少以上不良影响。 所以，在诊断中必须结合患者病史、各项实验室检查及其它临床资料来综合评估 测定结果。