化学发光法的原理技术要点及评价应用

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1、 化学发光免疫技术化学发光免疫技术第一节第一节 发光与化学发光剂发光与化学发光剂第二节第二节 发光酶免疫测定（发光酶免疫测定（C CLEIALEIA）（chemiluminescence enzyme immunoasssaychemiluminescence enzyme immunoasssay）第三节第三节 化学发光免疫测定技术化学发光免疫测定技术(CLIA)(CLIA)（chemiluminescence immunoassaychemiluminescence immunoassay）第四章第四章 电化学发光免疫测定技术电化学发光免疫测定技术(ECLI)ECLI)(electroch

2、emiluminescence immunoassay)(electrochemiluminescence immunoassay)化学发光免疫技术：化学发光免疫技术：集灵敏的化学集灵敏的化学 发光分析和特异的抗原抗体免疫测发光分析和特异的抗原抗体免疫测 定于一体的检测技术。定于一体的检测技术。概概 念念 特点：特点：特异性高、敏感性高、分离简便、特异性高、敏感性高、分离简便、快速、试剂无毒、安全稳定、快速、试剂无毒、安全稳定、可自动化。可自动化。化学发光免疫技术的类型化学发光免疫技术的类型 按发光剂不同分为按发光剂不同分为 1.1.发光酶免疫测定（发光酶免疫测定（C CLEIALEIA）ch

3、emiluminescence enzymeimmunoasssaychemiluminescence enzymeimmunoasssay 2.2.化学发光免疫测定技术化学发光免疫测定技术(CLIA)(CLIA)chemiluminescence immunoassay chemiluminescence immunoassay 3.3.电化学发光免疫测定技术电化学发光免疫测定技术(ECLI)ECLI)electrochemiluminescence immunoassay electrochemiluminescence immunoassay 按分离方法不同分按分离方法不同分 第一节第一

4、节 发光与化学发光剂发光与化学发光剂一、发光一、发光 一种物质由电子激发态回复到基态时，一种物质由电子激发态回复到基态时，释放出的能量表现为光的发射。释放出的能量表现为光的发射。1.1.光照发光光照发光:发光剂经短波长入射光照射后进入激发光剂经短波长入射光照射后进入激 发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。2.2.生物发光生物发光:反应底物在荧光素酶的催化下利用反应底物在荧光素酶的催化下利用 ATPATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回 复到基态时多余的能量以光子形式放出。复到基态时多余的能量以光子形式放

5、出。3.3.化学发光化学发光:在常温下由化学反应产生的光的发射。在常温下由化学反应产生的光的发射。化学发光是一个多步骤的过程。化学发光是一个多步骤的过程。荧光素酶荧光素酶ATP；O2；Mg2+氧化萤火虫荧光素氧化萤火虫荧光素萤火虫荧光素萤火虫荧光素光光 +AMP+O2+CO2+化学发光化学发光 机制：机制：某些化合物可以利用化学反应产生的能某些化合物可以利用化学反应产生的能 量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子 激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基 态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。态时，以发射光子

6、的形式释放能量（即发光）。化学发光剂或发光底物：化学发光剂或发光底物：在化学发光反应中参在化学发光反应中参 与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量 的化合物。的化合物。发光剂分为发光剂分为荧光素、生物发光剂、化学发光剂荧光素、生物发光剂、化学发光剂 能参与化学发光反应；能参与化学发光反应；与抗原或抗体偶联后形成稳定的结合物试剂；与抗原或抗体偶联后形成稳定的结合物试剂；偶联后仍保留高的量子效应和反应动力；偶联后仍保留高的量子效应和反应动力；应不改变或极少改变被标记物的理化特性，应不改变或极少改变被标记物的理化特性，特别是免疫活性。特别是免疫活性。化学发光

7、剂应符合以下几个条件化学发光剂应符合以下几个条件 是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物。是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物。CLEIACLEIA中常用的酶有中常用的酶有HRPHRP和和APAP HRP HRP的发光底物有鲁米诺、对的发光底物有鲁米诺、对-羟基苯乙酸羟基苯乙酸 APAP的发光底物有的发光底物有AMPPDAMPPD、4-MUP4-MUP（荧光底物）（荧光底物）特点：可作标记物、也可作过氧化物酶的底物特点：可作标记物、也可作过氧化物酶的底物 1.1 1.1 鲁米诺鲁米诺H2O2/OH HRP+N2+H2O+光光对对-羟基苯乙酸（羟基苯乙酸（HPAHPA）HPA HPA在在H

8、 H2 2O O2 2存在下被存在下被HRPHRP氧化成氧化二聚体（荧光氧化成氧化二聚体（荧光 物质），在物质），在350nm350nm激发光作用下，发出激发光作用下，发出450nm450nm波长波长 的荧光，可用荧光光度计测量。的荧光，可用荧光光度计测量。1.2 HPA 1.2 HPAH2O2HRP+荧荧 光光COOHHOCHCOOHHOCH22氧化二聚体氧化二聚体AMPPDAMPPD AMPPD AMPPD在碱性条件下，被在碱性条件下，被APAP酶解生成相当稳定的酶解生成相当稳定的 AMP-DAMP-D阴离子，其有阴离子，其有2 230min30min的分解半衰期，发的分解半衰期，发 出波

9、长为出波长为470nm470nm的持续性光，在的持续性光，在15min15min时其强度时其强度 达到高峰，达到高峰，151560min60min内光强度保持相对稳定。内光强度保持相对稳定。光光AP/OH HPO4 2O OOCH3O-1.3 AMPPD 1.3 AMPPD4-MUP4-MUP 4-MUP 4-MUP被被APAP催化生成催化生成4-4-甲基伞形酮，在甲基伞形酮，在360nm360nm的的 激发光的作用下，发出激发光的作用下，发出448nm448nm的荧光，可用荧的荧光，可用荧 光光度计进行测量。光光度计进行测量。荧荧光光AP 1.4 4-MUP 1.4 4-MUP4-MU4-M

10、U360nm360nm激发光激发光H H3 3POPO4 4+特点：特点：不需催化剂，只需改变溶液的不需催化剂，只需改变溶液的pHpH等条件等条件 就能发光的物质。反应迅速、背景低、就能发光的物质。反应迅速、背景低、信比高，发光量与信比高，发光量与AEAE浓度呈线性关系。浓度呈线性关系。常用试剂：常用试剂：吖啶酯（吖啶酯（acridinium，AEAE）+CO+CO2 2+光光NCH3COORHO+2-NCH3C OORONCH3C OOO 是指通过在电极表面进行电化学反应而发出是指通过在电极表面进行电化学反应而发出 光的物质。光的物质。特点：特点：反应在电极进行；反应在电极进行；电子供体为：

11、三丙胺（电子供体为：三丙胺（TPATPA）化学发光剂：三联毗啶钌化学发光剂：三联毗啶钌三联毗啶钌三联毗啶钌分子结构图分子结构图NNNNNNRuOONOO第二节第二节 发光酶免疫测定发光酶免疫测定（CLEIA）一、原理一、原理 属于酶免疫测定的一种。只是最后一属于酶免疫测定的一种。只是最后一 步酶反应所用底物为发光剂，通过发光反应步酶反应所用底物为发光剂，通过发光反应 发出的光在特定的仪器上进行测定。发出的光在特定的仪器上进行测定。二、技术类型二、技术类型 根据酶促反应底物不同可分为：根据酶促反应底物不同可分为：2.2.化学发光酶免疫测定技术化学发光酶免疫测定技术 根据免疫学反应模式分根据免疫学

12、反应模式分 3.3.固相抗原竞争法：固相抗原竞争法：荧光酶免疫测定技术反应原理图荧光酶免疫测定技术反应原理图EEEEE 洗涤洗涤弃上清弃上清EE碱性磷酸酶 标记抗体E抗体包被塑料微珠样本抗原 4MU激发荧光E 是利用理想的酶荧光底物，生成的产物稳定并有是利用理想的酶荧光底物，生成的产物稳定并有 强的荧光强度，通过测定荧光强度进行定量。强的荧光强度，通过测定荧光强度进行定量。化学发光酶免疫测定技术反应原理图化学发光酶免疫测定技术反应原理图EEEEE 洗涤洗涤弃上清弃上清EE碱性磷酸酶 标记抗体E抗体包被塑料微珠样本抗原AMPPDEAMPPD发光 是利用酶对发光底物催化作用而直接发光，是利用酶对发

13、光底物催化作用而直接发光，通过光强度的测定而直接进行定量。通过光强度的测定而直接进行定量。电化学发光原理图电化学发光原理图 这一过程可在电极表面周而复始地进行这一过程可在电极表面周而复始地进行 产生许多光子，使光信号增强产生许多光子，使光信号增强 激发态激发态不稳定不稳定TPA+TPARu(bpy)3+Ru(bpy)Ru(bpy)2+光子(620nm)333*基态基态电极电极 将已包被了抗体的乳胶微将已包被了抗体的乳胶微 粒和待测标本加入反应杯中，经温育一定时间粒和待测标本加入反应杯中，经温育一定时间 后后,再加入再加入APAP标记抗体，温育标记抗体，温育,形成固相包被抗形成固相包被抗 体体-

14、抗原抗原-酶标抗体复合物酶标抗体复合物 技术要点技术要点 将复合物转移到玻璃纤维上，用缓将复合物转移到玻璃纤维上，用缓 冲液洗涤，没结合的抗原被洗脱，酶标抗体冲液洗涤，没结合的抗原被洗脱，酶标抗体-抗抗 原原-胶乳微粒抗体复合物则被保留在纤维膜上。胶乳微粒抗体复合物则被保留在纤维膜上。加入加入4-MUP4-MUP，酶标抗体上，酶标抗体上APAP将将 4-MUP4-MUP分解，形成分解，形成4-MU4-MU，它在，它在360nm360nm激发光的照激发光的照 射下，发出射下，发出448nm448nm的荧光，经荧光仪记录，放大，的荧光，经荧光仪记录，放大，根据标准曲线由电脑计算出所测物质的含量根据

15、标准曲线由电脑计算出所测物质的含量1.1.磁颗粒分离法：磁颗粒分离法：用抗原或抗体包被磁颗粒用抗原或抗体包被磁颗粒,与标与标 本中相应抗原或抗体和酶标的抗体或抗原通过本中相应抗原或抗体和酶标的抗体或抗原通过 一定模式的免疫学反应后一定模式的免疫学反应后,最终通过磁场将结合最终通过磁场将结合 酶标记物酶标记物ICIC和游离酶标记物进行分离的技术。和游离酶标记物进行分离的技术。分离技术分离技术2.2.微粒子捕获法：微粒子捕获法：所用颗粒是无磁性微粒子作为所用颗粒是无磁性微粒子作为 抗体或抗原的包被载体抗体或抗原的包被载体,然后用纤维膜柱子进然后用纤维膜柱子进 行酶标记物的结合状态和游离状态的分离。

16、行酶标记物的结合状态和游离状态的分离。3.3.包被珠分离法：包被珠分离法：用聚苯乙稀等材料制成小珠用聚苯乙稀等材料制成小珠,在在 小珠上包被抗原或抗体小珠上包被抗原或抗体,经抗原抗体反应后经抗原抗体反应后,将将 结合状态和游离状态的酶标记物进行分离结合状态和游离状态的酶标记物进行分离.第三节第三节 化学发光免疫测定技术化学发光免疫测定技术（CLIA）一、原理一、原理 用化学发光剂直接标记抗原或抗体用化学发光剂直接标记抗原或抗体,与与 待测标本中相应待测标本中相应AbAb或或AgAg、磁颗粒性的、磁颗粒性的AgAg或或AbAb反反 应，通过磁场把结合状态（沉淀部分）和游离应，通过磁场把结合状态（

17、沉淀部分）和游离 状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入 发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的 检测进行定量或定性检测检测进行定量或定性检测 。二、技术类型二、技术类型 1.1.分离方法分离方法 常用磁颗粒分离技术常用磁颗粒分离技术 2.2.免疫学反应模式免疫学反应模式 同酶发光免疫测定技术同酶发光免疫测定技术 3.3.不同只是相应标记物是吖啶酯而不是酶不同只是相应标记物是吖啶酯而不是酶 将包被将包被McAbMcAb的磁颗粒和待的磁颗粒和待 测标本加入到反应管中，标本中待测测标本加入到反应管中，标本中待测Ag

18、Ag与磁珠与磁珠 上上AbAb结合，再加上结合，再加上AEAE标记标记AbAb，经过温育，形成，经过温育，形成 磁珠磁珠AbAb-AgAg-AE-AE标记标记AbAb复合物。复合物。技术要点技术要点 在电磁场中进行在电磁场中进行2-32-3次洗涤后，很快次洗涤后，很快 地将未结合的多余地将未结合的多余AgAg和标记和标记AbAb洗去。洗去。3.3.化学发光反应化学发光反应 经洗涤的磁经洗涤的磁珠珠中，加入中，加入H H2 2O O2 2和和 pHpH纠正液纠正液NaOHNaOH，这时，这时AEAE不需要催化剂即分解并不需要催化剂即分解并 发光，由集光器接收，经光电倍增管放大，记发光，由集光器接

19、收，经光电倍增管放大，记 录录1 1S S内所产生的光子能，其积分与被测物含量内所产生的光子能，其积分与被测物含量 成正比，按标准曲线，仪器可计算出被测物含量。成正比，按标准曲线，仪器可计算出被测物含量。1.AE 1.AE其低背景噪音、化学反应简单、快速而无催其低背景噪音、化学反应简单、快速而无催 化剂。化剂。方法评价方法评价 2.AE2.AE与大分子的结合并无减少所产生的光量，与大分子的结合并无减少所产生的光量，从而增加灵敏度，灵敏度可达从而增加灵敏度，灵敏度可达10-15g/ml10-15g/ml。3.AE3.AE标记试剂有效期长，可达一年。标记试剂有效期长，可达一年。4.4.固相分离剂为

20、极为幼细的磁粉，除增大包被固相分离剂为极为幼细的磁粉，除增大包被 面积，加快反应外，亦同时使清洗及分离更面积，加快反应外，亦同时使清洗及分离更 简易、快捷。简易、快捷。第四节第四节 电化学发光免疫测定技术电化学发光免疫测定技术（ECLI）一、原理一、原理 是一种在电极表面由电化学引发的特是一种在电极表面由电化学引发的特 异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化 学发光二个过程。学发光二个过程。ECLECL是电启动发光反应，而是电启动发光反应，而CLCL 是通过化合物混合启动发光反应。用化学发光是通过化合物混合启动发光反应。用化学发光 剂三联吡啶钌剂三联吡

21、啶钌Ru(bpy)3Ru(bpy)32+2+标记标记AbAb，通过，通过Ag-AbAg-Ab 反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极 上发出的光强度对待测的上发出的光强度对待测的AgAg或或AbAb进行定量进行定量/定性。定性。二、技术类型二、技术类型 1.1.分离方法分离方法 常用磁颗粒分离技术常用磁颗粒分离技术 2.2.免疫学反应模式免疫学反应模式 同酶发光免疫测定技术同酶发光免疫测定技术 3.3.相应标记物是三联吡啶钌而不是酶相应标记物是三联吡啶钌而不是酶 同时加入一个反应杯中孵育反应同时加入一个反应杯中孵育反应 技术要点技术要点 2.2.将链霉

22、亲和素（将链霉亲和素（SASA）包被磁珠加入反应杯中，再次）包被磁珠加入反应杯中，再次 孵育，使生物素（孵育，使生物素（B B）通过与亲和素（）通过与亲和素（A A）的结合，）的结合，将磁珠、将磁珠、AbAb连接为一体，形成双连接为一体，形成双AbAb夹心法。夹心法。3.3.蠕动泵将形成的蠕动泵将形成的 Ru(bpy)Ru(bpy)3 3 2+2+-Ab-Ag-Ab-B-SA-Ab-Ag-Ab-B-SA-磁珠磁珠 复合体吸入流动测量室，磁珠被工作电极下面的磁铁复合体吸入流动测量室，磁珠被工作电极下面的磁铁 吸附于电极表面。同时，游离的吸附于电极表面。同时，游离的AbAb也被吸出测量室。也被吸出

23、测量室。4.4.蠕动泵加入蠕动泵加入TPATPA，电极加电压，启动，电极加电压，启动ECLECL反应过程。反应过程。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，其与光电倍增管检测光强度，其与Ru(bpy)3Ru(bpy)32+2+的浓度呈的浓度呈 线性关系线性关系,故可测出待测故可测出待测AgAg的含量。的含量。原理图原理图抗体包被抗体包被 样本样本 Ru(byp)2+TPA缓冲缓冲的磁珠的磁珠 抗原抗原 标记抗体标记抗体 液洗涤液洗涤 3方法评价方法评价标记物的再循环利用，使发光时间更长、强标记物的再循环利用，使发光时间更长、强 度更高、易于测定；度更高、易于测定；敏感度高，可达敏感度高，可达pgpgmlml或或pmolpmol水平；水平；线性范围宽线性范围宽10104 4；反应时间短，反应时间短，20min20min以内可完成测定；以内可完成测定；试剂稳定性好，试剂稳定性好，2 255可保持一年以上。可保持一年以上。五、临床应用五、临床应用11.11.过敏性疾病过敏性疾病 12.12.治疗药物监测治疗药物监测