热休克蛋白70减轻帕金森病细胞模型中α

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1、热休克蛋白70减轻帕金森病细胞模型中a-突触核蛋白毒性的作用(作者:单位: 邮编: )【摘要】目的探讨HSP70在因a-突触核蛋白过表达或突 变所致的帕金森病(PD)细胞模型中的作用及其机制。方法构建过表达 野生型和PD相关突变型(A53T)a-突触核蛋白质粒，转染人神经母细 胞瘤细胞(SH-SY5Y)细胞后得PD细胞模型;然后在细胞模型中转染 表达HSP70的质粒。采用免疫印迹检测转染HSP70细胞模型中a- 突触核蛋白表达量的改变;采用MTT法检测转染HSP70后细胞模型 活力的变化。结果转染HSP70后，细胞模型a-突触核蛋白表达减少, 细胞活性增加。结论HSP70通过降低a-突触核蛋白

2、表达水平对PD 细胞模型发挥保护作用。【关键词】a-突触核蛋白;热休克蛋白70;过表达a-突触核蛋白是一种在中枢神经系统突触前表达的可溶性蛋白， 具有调节膜稳定性和神经可塑性等生理功能。近年研究发现，a突触 核蛋白基因过表达或突变可引起a-突触核蛋白的错误折叠、有毒蛋白 寡聚体和多聚体的形成，使其结构和功能障碍，从而启动一系列级联反应致多巴胺能系统损伤，最终导致帕金森病(PD)。研究认为神经保 护剂可能是治疗PD的一个新的有效途径，而热休克蛋白70(HSP70) 就是其中之一。HSP70是分子伴侣家族中的一员，作为一种重要的应 激蛋白,能与 错误折叠的蛋白相互作用，阻止聚集物的形成;除此之 外

3、，HSP70还有助于错误折叠蛋白的降解1，2。在果蝇及酵母的 PD模型中发现，HSP70能减轻a-突触核蛋白的毒性及其引起的神经 细胞凋亡3, 4，而HSP70抑制a-突触核蛋白毒性可能与其能够与 a-突触核蛋白相互作用，阻止a-突触核蛋白纤维样聚集，降低a-突触 核蛋白表达量有关5，6。为进一步证实HSP70在a-突触核蛋白 所致PD的作用，本实验首次在神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)PD模 型中检测了 HSP70的作用及机制，发现HSP70可以通过降低a-突 触核蛋白水平发挥对PD细胞模型的保护作用。1 材料与方法1.1实验材料SH-SY5丫细胞购自ATCC公司;限制性内切自 Takar

4、a公司;QIAprep TIP100 Kit购自 QIAGEN 公司;人胎脑cDNA 文库、胎牛血清(FBS)、Lipofectamine2000 购自 Invitrogen 公司;蛋抑制剂 cocktail 购自 Sigma 公司;anti-a-synuclein 204 抗体、 anti-beta-actin抗体购自Santa cruz公司;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购 自 Millipore 公司。1.2 方法 1.2.1质粒构建以人胎脑cDNA文库为模板，PCR获得a-突触核蛋白可编码序列(CDS序列)以NotI和HindHI连接到pCDNA3.1真 核表达载体中，通过overlap

5、PCR方法，构建A53T突变体，同样以 Notl和HindHI连接到pCDNA3.1真核表达载体中。按照QIAprep TIP100 Kit Protocol抽取并纯化质粒，测序证实。pCDNA3.1-HSP70 质粒由湘雅二医院肝移植中心李杰群博士惠赠。1.2.2细胞培养与转染SH-SY5丫细胞采用含10%FBS的高糖 DMEM培养液，置于379,5%CO2的培养箱培养。转染严格按照 Lipofectamine2000说明书进行。用不含FBS的DMEM培养基洗涤 细胞2次，24孔细胞培养板每孔加入含2 pl Lipofectamine2000及 0.8 pg质粒DNA、不含FBS的DMEM培

6、养基500 pl，在379, 5%CO2的培养箱中孵育3 h，改用含10%FBS的DMEM培养基继 续孵育 48 h。1.2.3免疫荧光将稳定表达蛋白的SH-SY5丫细胞接种到有盖玻 片的24孔板中，用含10% FBS的DMEM培养于379、5% CO2 培养箱中36 h后，弃去培养基，3.7%的多聚甲醛/磷酸缓冲液(PBS) 室温下固定 15 min。 PBS 洗 2 次， 每次 5 min。 0.2%的 TritonX-100/PBS 透化 10 min ,PBS 洗 2 次，5%牛血清白蛋白(BSA) 圭封闭液，室温圭封闭30 min。加入1:400稀释的anti-a-synucIein

7、204 一抗室温孵育60 min，PBS洗3次，每次5 min。5%BSA封闭液， 室温圭封闭20 min。加入1:200稀释的anti-鼠lgG-Cy2二抗100 pl， 避光室温下孵育60 min。1 xPBS洗3次，每次5 min。4，6-二氨基 -2-苯基吲哚(DAPI)染细胞核，室温，避光反应2 min。PBS洗2次， 每次5 min。去离子水洗1次，封片，用激光共聚焦显微镜扫描和照相。1.2.4免疫印迹取细胞，吸去培养基，加入2x十二烷基硫酸钠(SDS)sample buffer(125 mmol/L Tris HCl，20% Glycerol，4% SDS，0.1% bromph

8、enol blue， pH 6.8)加入蛋白抑制剂 cocktail 裂解细胞，超声后，使用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。均取20 pg总蛋 白经 18% SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳，并电转移至 PVDF 膜上。以5%脱脂奶粉封闭1 h后，加入相应一抗，49过夜，Tris缓冲生理盐水溶液仃BST)洗膜后，加入对应的辣根过氧化物标记的二抗，室温孵育60 min，TBST洗膜后，电化学发光免疫分析法(ECL)发光， 曝光。内参照为鼠抗-actin单克隆抗体。1.2.5细胞活力测定调节SH-SY5丫细胞密度约5x104/ml，以100 pl/孔接种于96孔板，24 h后分别转染pCDNA 3.1+H

9、SP70;a-突触核蛋白野生型+ pCDNA3.1;a-突触核蛋白野生型+HSP70;a-突 触核蛋白A53T+pCDNA3.1;a-突触核蛋白A53T+HSP70;每种处理设 3个复孔，24 h后每孔加5mg/ml四甲基偶氮唑盐(MTT)，继续培养4 h。弃培养基，每孔加二甲基亚砜(DMSO)100pl振荡混匀，待颗粒溶解后置于标仪上，空白孔调零，以570 nm波长检测各孔吸光度值。1.3统计学分析利用SPSS11.5软件进行统计分析用t检验进行两组间差异比较。2 结果2.1PD细胞模型的构建a-突触核蛋白野生型和突变型A53T在 转染 SH-SY5Y 细胞后，胞浆和胞核都有分布，以胞浆分布

10、为主，部 分细胞a-突触核蛋白呈点状分布，可能为其聚集体。免疫印迹也显示， SH-SY5Y细胞中a-突触核蛋白野生型和突变型A53T都得到了过表 达，说明PD细胞模型构建成功。见图1A、B。2.2HSP70对PD细胞模型中a -突触核蛋白的影响了探讨 HSP70对PD细胞模型中过表达的a-突触核蛋白的作用，将HSP70 与a-突触核蛋白进行了共转染，通过免疫印迹检测HSP70对a-突触 核蛋白表达的影响。结果显示，无论是在a突触核蛋白野生型还是突 变型PD细胞模型中，HSP70均能降低a-突触核蛋白的表达。见图2。 A :免疫荧光检测a-syunclein野生型（左图）与A53T突变体（右图）

11、在 SH-SY5Y 中的表达。一抗为 anti a-syunclein 鼠单克隆抗体，二抗 为cy2标记的anti mouse IgG抗体。蓝色为DAPI染色的细胞核。B : western印迹检测a-syunclein在SH-SY5Y中的表达。一抗为anti a -syunclein鼠单克隆抗体，二抗为HRP标记的anti mouse IgG抗体。 内参为细胞骨架蛋白beta actin。图1 a-syunclein过表达PD模型的 建立Western印迹检测a-syunclein与HSP70共转染后，HSP70对 a-syunclein 野生型和突变性表达量的影响。一抗为 anti a-s

12、yunclein 鼠单克隆抗体， antiHSP70 单克隆抗体，二抗为 HRP 标记的 anti mouse IgG抗体。内参为细胞骨架蛋白p-actino图2HSP70降低a -synuclein 的表达量2.3HSP70对PD细胞模型活力的影响转染野生型和突变体a- 突触核蛋白后，SH-SY5Y细胞活性明显降低，说明a-突触核蛋白对SH-SY5丫具有毒性作用，PD细胞模型建立成功。而增加HSP70的 表达后，对比a-突触核蛋白野生型(a-synuclein WT)+ pCDNA3.1组 和a -突触核蛋白突变型(a-synucleinA53T)+pCDNA3.1组，表达 HSP70能分别

13、提高a-synuclein WT和a-synuclein A53T引起的细胞 活性降低(P0.01)见表1。表1MTT检测HSP70对过表达a-syunclein SH-S Y5Y细胞活性的影响3 讨论a -突触核蛋白是一种分布于中枢神经系统突触前末梢，约1520 kD 的可溶性蛋白质。自然状态下呈一种非折叠构象，不形成 明显的三维结构 但其N末端2/3的序列可以形成一系列双极性区域， 可能介导其与膜结构的结合;当高浓度或异常修饰时，构象改变形成 寡聚体甚至是聚集体，具有细胞毒性7， 8。与单体不同，这类寡 聚体富含8 片层结构，在原子力显微镜及电镜下，可以观察到这类寡 聚体形成过程中，一般先

14、呈包含2030个a-突触核蛋白分子的圆状 结构;随后因彼此聚合形成链状结构，最终转化为稳定的纤维状结构 这种由单体向纤维状结构的改变，可能是a-突触核蛋白产生毒性作用 的重要原因5 , 10。研究进一步发现，与家族性PD有关的a-突触 核蛋白A53T及A30P突变蛋白在体外均可以促进寡聚体的形成，同 时，野生型a-突触核蛋白的过量表达也可以导致寡聚体的增加11， 12。当机体无法处理有毒的a-突触核蛋白中间体时，可能会导致a- 突触核蛋白形成聚集体，最终导致PD的发生11，13，14。分子伴侣作为一类介导协助蛋白形成与维持天然构象的重要细胞因子，在a-突触核蛋白蛋白结构状态转换过程中可能发挥着

15、很重要 的调控作用。实验表明，路易小体中除a突触核蛋白外，还含有其他 蛋白质，而HSP是其中重要的蛋白之一15。当a-突触核蛋白本身 结构的改变或分子伴侣、降解系统出现异常时，a突触核蛋白的毒性 作用就体现出来了。在模型动物的研究中发现，分子伴侣(HSP70、 HSP40)的表达可减轻a-突触核蛋白的细胞毒性。譬如，在PD果蝇 模型中，HSP70的表达可以减轻或阻止a-突触核蛋白引起的神经元 损伤;而在酵母中HSP70水平的增加也可以有效地减缓或抑制PD的 发生3，4。因此，分子伴侣蛋白可能通过协助a-突触核蛋白形成 并维持正确构象而防止其聚集产生有毒害作用的聚集体。本研究中， 利用a-突触核

16、蛋白过表达细胞模型发现，过表达HSP70后能使PD 细胞活性增加，说明HSP70对PD细胞模型具有保护作用。过表达 HSP70后，a-突触核蛋白的表达量也降低，而目前已知a-突触核蛋 白是导致 PD 发生的重要因素11， 13， 14。，因此认为 HSP70 对 PD细胞模型的保护作用是通过减少a-突触核蛋白的表达量的表达量 而实现的。由于a-突触核蛋白的细胞毒性作用与其由单体向寡聚体转化有关9，10。，因此推测，HSP70可能通过参与维持a-突触 核蛋白的正确构象，减少其向有毒的寡聚体和聚集体状态进行转化， 减少细胞的毒性作用。【参考文献】1Hartl FU,Hayer-Hartl M.Mo

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