第二章植物组织培养的基本技术与设施ppt课件

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1、 第一节第一节 植物组织培育的操作方法概述植物组织培育的操作方法概述 一、外植体的选择一、外植体的选择 二、外植体的灭菌二、外植体的灭菌 三、外植体的接种和培育三、外植体的接种和培育 四、外植体的成苗途径四、外植体的成苗途径 五、污染的缘由及其预防措施五、污染的缘由及其预防措施 六、外植体的褐变及其防止措施六、外植体的褐变及其防止措施 七、培育物的玻璃化景象及其防止措施七、培育物的玻璃化景象及其防止措施 八、试管苗的驯化与移栽八、试管苗的驯化与移栽 J 外植体外植体ExplantsExplants：指植物离体培育的各种接种：指植物离体培育的各种接种资料，包括植物体的各种器官、组织、细胞和原生质

2、资料，包括植物体的各种器官、组织、细胞和原生质体。体。一、一、外植体的选择外植体的选择J 外植体的选择根据外植体的选择根据J 优良的种质优良的种质J 强壮的植株强壮的植株J 大小适宜的外植体大小适宜的外植体J 适宜的发育时期适宜的发育时期J 适宜的部位适宜的部位J 适宜生理形状和发育年龄的器官适宜生理形状和发育年龄的器官J 细胞培育资料的选择细胞培育资料的选择 二二 外植体灭菌的普通步骤外植体灭菌的普通步骤 二、外植体的灭菌二、外植体的灭菌一常用灭菌剂的运用及其效果三各种外植体的灭菌方法三各种外植体的灭菌方法一常用消毒剂一常用消毒剂消毒剂使用浓度（）去除的难易 消毒时间（分）效果次氯酸钙次氯酸

3、钠漂 白 粉溴 水过氧化氢升 汞酒 精抗 菌 素硝 酸 银9102饱和溶液1210120.11707545（mg/L）1易易易易最易较难易中较难5305305302105152100.223060530很好很好很好很好好最好好较好好自:曹孜义二二 外植体灭菌的普通步骤外植体灭菌的普通步骤 3.将适当浓度的消毒液(0.1%升汞或2%次氯酸钠)(含有几滴活化剂Tween20或Tween 80)，使资料完全浸没在消毒液中，盖上盖，把玻璃瓶置入超净任务台灭菌一定时间。在灭菌期间须把玻璃瓶摇动23次。4消毒处置后，将瓶盖翻开，将消毒液倒出，注入适量的无菌蒸馏水，再盖上盖，摇动数次，将水倒掉，反复34次。

4、1预处置，先对植物组织进展修整，去掉不需求的部分，将预备运用的植物资料在流水中冲洗干净。经过预处置的植物资料，其外表仍有很多细菌和真菌。2将植物组织块置于一个有丝盖的玻璃瓶中，注入75%的酒精溶液埋没资料，浸泡10S左右。倒出酒精，用无菌水冲洗一次。1 1、茎尖、茎段及叶片等的消毒、茎尖、茎段及叶片等的消毒消毒前要经自来水较长时间的冲洗。消毒前要经自来水较长时间的冲洗。消毒时要用消毒时要用70%70%的酒精浸泡数秒，无菌水冲洗的酒精浸泡数秒，无菌水冲洗2 23 3次，然后用次，然后用2%2%10%10%的次的次氯酸钠溶液浸泡氯酸钠溶液浸泡101025min25min，假设资料有茸毛最好在消毒液

5、中参与几滴吐温，假设资料有茸毛最好在消毒液中参与几滴吐温-80-80，或者用，或者用0.10.10.20.2升汞浸泡消毒升汞浸泡消毒5 51010分钟消毒后，用无菌水冲洗分钟消毒后，用无菌水冲洗3 3次后方可接种。次后方可接种。2 2、果实及种子的消毒、果实及种子的消毒用自来水冲洗用自来水冲洗10102020分钟或更长，用纯酒精迅速漂洗一下。分钟或更长，用纯酒精迅速漂洗一下。果适用果适用2%2%次氯酸钠溶液浸次氯酸钠溶液浸 10min10min后，用无菌水冲洗后，用无菌水冲洗2 23 3次。次。种子要先用种子要先用10%10%次氯酸钠浸泡次氯酸钠浸泡 202030min30min甚至几小时。对

6、难以消毒的还可用甚至几小时。对难以消毒的还可用0.l%0.l%升汞或升汞或1%1%2%2%溴水消毒溴水消毒5min5min。胚或胚乳培育时，对种皮太硬的种子，可先去掉种皮，再用胚或胚乳培育时，对种皮太硬的种子，可先去掉种皮，再用4%4%10%10%的次氯的次氯酸钠溶液浸泡酸钠溶液浸泡8 810min10min，经无菌水冲洗后，即可取出接种。，经无菌水冲洗后，即可取出接种。三几种外植体的灭菌方法三几种外植体的灭菌方法 70酒精擦洗花蕾，或浸泡数秒钟饱和漂白粉上清液：浸泡10分钟；或次氯酸钠液25：810分钟无菌水冲洗几次后，吸去水分，剥取花药或胚珠接种。3 3、花药的消毒、花药的消毒 预先用自来

7、水洗涤，再用软毛刷刷洗，且用刀切去损伤及污染严重部位，吸水纸吸干后，再用酒精漂洗。可采用0.1%0.2%升汞浸510min或2%次氯酸钠溶液浸1015min，然后以无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干后可接种。4 4、根及地下部器官的消毒、根及地下部器官的消毒 三、外植体的接种和培育三、外植体的接种和培育 一无菌操作一无菌操作 二外植体的培育二外植体的培育 植物组织培育的接种：把经过外表消毒后的植物资料切碎或分植物组织培育的接种：把经过外表消毒后的植物资料切碎或分别出器官、组织细胞，并把它们转放到无菌培育基上的全部操别出器官、组织细胞，并把它们转放到无菌培育基上的全部操作过程，是一种无菌技术。作过程

8、，是一种无菌技术。在操作过程中引起的污染来源：主要是由资料本身带菌和任务在操作过程中引起的污染来源：主要是由资料本身带菌和任务人员本身引起的。人员本身引起的。一无菌操作一无菌操作 污染的主要来源是空气污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子中的细菌和真菌孢子每次接种前半小时每次接种前半小时地面：用地面：用7070酒精喷雾酒精喷雾使空气的灰尘沉降。使空气的灰尘沉降。紫外线灯照射紫外线灯照射2020分钟。分钟。任务台面要用新洁尔灭任务台面要用新洁尔灭或酒精擦洗。或酒精擦洗。1、接种室的消毒、接种室的消毒 入无菌室前，要洗手。入无菌室前，要洗手。l%l%新洁尔灭溶液内新洁尔灭溶液内5 5分钟分钟入室时

9、要穿上经过消毒的任务服、帽子、口罩和鞋子等。入室时要穿上经过消毒的任务服、帽子、口罩和鞋子等。操作前要用操作前要用70%70%酒精擦洗手，操作中要经常用酒精擦洗手。不准酒精擦洗手，操作中要经常用酒精擦洗手。不准讲话，以免微生物污染资料、培育基和器具。每次重新操作都要把讲话，以免微生物污染资料、培育基和器具。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。工具在火焰上消毒。必需在酒精灯火焰处进展操作，如翻开瓶口，转接资料。盖瓶盖必需在酒精灯火焰处进展操作，如翻开瓶口，转接资料。盖瓶盖前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖上。上。2

10、 2、任务人员要求、任务人员要求 切取和接种较大的资料肉眼察切取和接种较大的资料肉眼察看即可操作分别，较小的资料需看即可操作分别，较小的资料需在双筒解剖镜下操作。在双筒解剖镜下操作。分别工具一定要放好，切割动分别工具一定要放好，切割动作要快，防止挤压使资料损伤而作要快，防止挤压使资料损伤而失败。失败。接种时要防止交叉污染的发生接种时要防止交叉污染的发生 3 3、资料的切取、资料的切取酒精擦拭手外植体消毒浸泡5min器械消毒酒精灯灼烧 4 4、接种的详细操作接种的详细操作旋转灼烧取外植体接种盖好瓶塞 1 1、培育条件：、培育条件：温度：常坚持在温度：常坚持在232322，夜温低，夜温低1212

11、光照时数：大多数情况下为光照时数：大多数情况下为16h16h暗培育不需暗培育不需求光照，例如起始培育的前几天不需求光照求光照，例如起始培育的前几天不需求光照 光照强度：光照强度：10003000lx10003000lx，白色荧光灯，光，白色荧光灯，光的作用是满足形状建成的需求诱导的作用是满足形状建成的需求诱导 相对湿度：培育室的相对湿度普通不控制。相对湿度：培育室的相对湿度普通不控制。根据需求适当调整培育间湿度根据需求适当调整培育间湿度 二外植体培育二外植体培育 接种后37天内，主要是检查其污染情况。增殖、继代培育，建立了无菌培育系。细胞学察看：普通每隔35天察看一次。及时记录。察看方法根据培

12、育方式灵敏掌握：可用显微镜进展定点察看如平板培育可用倒置显微镜察看如液体培育2、定期检查和细胞学察看、定期检查和细胞学察看 1 1外植体先构成愈伤组织，再分化成完好外植体先构成愈伤组织，再分化成完好 的植株。的植株。四、外植体的成苗途径四、外植体的成苗途径 2胚状体发生胚状体发生3 3外植体经诱导后直接构成根与芽，发育外植体经诱导后直接构成根与芽，发育成完好的植株成完好的植株4 4原球茎型原球茎型-图片图片石斛兰的原球茎石斛兰的原球茎外植体愈伤组织 根、芽芽根根芽胚状体根、芽试 管 苗外植体的成苗途径外植体的成苗途径 不定芽构成-多细胞参与胚状体构成过程-单细胞参与体细胞胚的发育过程 低CTK

13、/IAA外植体愈伤组织芽根脱分化再分化低CTK/IAA根 完 整 植 株生长调理物质控制器官分化的方式生长调理物质控制器官分化的方式芽高CTK/IAA低CTK/IAA五、污染的缘由及其预防措施五、污染的缘由及其预防措施 污染污染 概念：是指在组织培育过程中培育基和培育资料繁殖杂菌，导概念：是指在组织培育过程中培育基和培育资料繁殖杂菌，导致培育失败的景象。致培育失败的景象。缘由：缘由：细菌细菌菌斑呈黏液状物。菌斑呈黏液状物。除资料带菌或培育基灭菌不彻底会呵斥成批接种资料被细菌污除资料带菌或培育基灭菌不彻底会呵斥成批接种资料被细菌污染外，操作人员的不慎也是呵斥细菌污染的重要缘由。因此接种染外，操作

14、人员的不慎也是呵斥细菌污染的重要缘由。因此接种人员的手应经常用人员的手应经常用 7070酒精擦净，镊子和接种针在运用前必需在酒精擦净，镊子和接种针在运用前必需在火焰上烧红。火焰上烧红。真菌真菌污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后3 310d10d才干发现，才干发现，呵斥真菌污染的缘由多为周围环境的不清洁、超净任务台的过呵斥真菌污染的缘由多为周围环境的不清洁、超净任务台的过滤安装失效、培育瓶的口径过大、操作不慎等滤安装失效、培育瓶的口径过大、操作不慎等途径：途径：外植体带菌；外植体带菌；培育基及器皿灭菌不彻底；培育基及器皿灭菌不彻底；操作人员未遵守操作规程等。

15、操作人员未遵守操作规程等。防止资料带菌的措施防止资料带菌的措施 用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条先进展预培育。用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条先进展预培育。防止阴雨天在田间采取外植体。防止阴雨天在田间采取外植体。对于资料内部污染的资料采取特殊方法。对于资料内部污染的资料采取特殊方法。外植体的灭菌外植体的灭菌 多次灭菌法多次灭菌法 多种药液交替浸泡法多种药液交替浸泡法金属器械的灭菌金属器械的灭菌普通用火焰灭菌法，即把金属器械放在普通用火焰灭菌法，即把金属器械放在 9595的酒精中浸一下，然后放在火焰的酒精中浸一下，然后放在火焰上熄灭灭菌。这一步骤该当在无菌操作过程中反复进

16、展。上熄灭灭菌。这一步骤该当在无菌操作过程中反复进展。金属器械也可以用干热灭菌法灭菌，即将拭净或烘干的金属器械用纸包好，盛金属器械也可以用干热灭菌法灭菌，即将拭净或烘干的金属器械用纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。在金属盒内，放在烘箱中灭菌。布质制品的灭菌布质制品的灭菌:任务服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的布质品，放入任务服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的布质品，放入高压灭菌器中，在压力为高压灭菌器中，在压力为108kPa108kPa，温度为，温度为121121的情况下，灭菌的情况下，灭菌202030min30min无菌操作室的灭菌无菌操作室的灭菌:无

17、菌操作室的地面、墙壁和任务台的灭菌可用无菌操作室的地面、墙壁和任务台的灭菌可用2 2的新洁尔灭或的新洁尔灭或 7070的酒精擦的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约洗，然后用紫外灯照射约20min20min。运用前用。运用前用7070的酒精喷雾，使空间灰尘落下。的酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定期一二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。一年中要定期一二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。操作人员操作人员 污染的预防措施污染的预防措施六、外植体的褐变及其防止措施六、外植体的褐变及其防止措施 一褐变的缘由一褐变的缘由 1.1.基因型基因型 2.2.外植体的生理形状外植体的生理形状 3.3.培育基的成分培育基的成分 无机盐浓度

18、；植物生长调理物质；外植体脱分化条件；转无机盐浓度；植物生长调理物质；外植体脱分化条件；转移时间过长。移时间过长。二褐变的防止措施二褐变的防止措施 1.1.选择适宜的外植体选择适宜的外植体 2.2.最正确培育基最正确培育基3.3.延续转移延续转移 4.4.加抗氧化剂加抗氧化剂 5.5.活性炭活性炭 七、培育物的玻璃化七、培育物的玻璃化景象及其预防措施景象及其预防措施 一玻璃化景象一玻璃化景象 叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小肿胀，失绿，叶片伸展成植株矮小肿胀，失绿，叶片伸展成纵向卷曲，脆弱易碎；纵向卷曲，脆弱易碎；叶表皮短少角质层蜡质，没有功叶表皮短少角质层蜡质

19、，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织；海绵组织；体内含水量高，但干物质、叶绿体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量素、蛋白质、纤维素和木质素含量低。低。激素浓度激素浓度 激素浓度添加尤其是细胞分裂素浓度提高或细胞分裂素与生激素浓度添加尤其是细胞分裂素浓度提高或细胞分裂素与生长素比例高长素比例高)。琼脂浓度琼脂浓度 琼脂浓度低时玻璃化苗比例添加，水浸状严重。琼脂浓度低时玻璃化苗比例添加，水浸状严重。温度：适宜的温度可以使试管苗生长良好。温度：适宜的温度可以使试管苗生长良好。光照时间光照时间多数植物在多数植物在101012h12h光照下都

20、生长良好，大于光照下都生长良好，大于15h15h时，玻璃化苗明时，玻璃化苗明显添加。显添加。通风条件通风条件愈伤组织和试管苗生长越快，越容易构成玻璃化苗。愈伤组织和试管苗生长越快，越容易构成玻璃化苗。愈伤组织和试管苗长时间培育，不能及时转移，容易出现玻璃化愈伤组织和试管苗长时间培育，不能及时转移，容易出现玻璃化苗。苗。组织培育所用瓶盖棉塞、滤纸、封口纸、牛皮纸通气较好，玻组织培育所用瓶盖棉塞、滤纸、封口纸、牛皮纸通气较好，玻璃化苗的比例较低。璃化苗的比例较低。离子程度离子程度培育基中离子种类及其比例不适宜该种植物，玻璃化苗的比例就培育基中离子种类及其比例不适宜该种植物，玻璃化苗的比例就会添加。

21、会添加。二产生玻璃化苗的要素二产生玻璃化苗的要素 适当控制培育基中无机营养成分；适当提高培育基中蔗糖和琼脂的浓度；适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度；添加自然光照，控制光照时间；控制好温度；改善培育器皿的气体交换情况在培育基中添加其他物质，参与间苯三酚或根皮苷或其他添加物，可有效地减轻或防治试管苗玻璃化。如添加马铃薯汁液法可降低油菜玻璃苗的产生频率；0.5mgL多效唑或10mgL的矮壮素可减少重瓣丝石竹试管苗玻璃化的发生；1.52.5g/L的聚乙烯醇防治苹果砧木玻璃化。参与 0.3的活性炭还可降低玻璃苗的产生频率。三预防措施三预防措施 J 试管苗的特点J 试管苗的驯化 J 试管苗的移栽J 提高试

22、管苗移栽成活率的途径 八、八、试管苗的驯化与移栽试管苗的驯化与移栽一、试管苗的特点一、试管苗的特点 试管苗的生态环境试管苗的生态环境 高温且恒温；高湿；弱光；高温且恒温；高湿；弱光；无菌。无菌。试管苗的特点试管苗的特点 试管苗生长细弱，茎、叶试管苗生长细弱，茎、叶外表角质层不兴隆；外表角质层不兴隆；试管苗茎、叶虽呈绿色，试管苗茎、叶虽呈绿色，但叶绿体的光协作用较差；但叶绿体的光协作用较差；试管苗的叶片气孔数目少，试管苗的叶片气孔数目少，活性差；活性差；试管苗根的吸收功能弱。试管苗根的吸收功能弱。试管苗和普通苗的根解剖比较蓝莓蓝莓二、试管苗的驯化二、试管苗的驯化 驯化的目的驯化的目的:在于提高试

23、管苗对外界环境条件的顺应性，提高其光协作用的才干，促使在于提高试管苗对外界环境条件的顺应性，提高其光协作用的才干，促使试管苗强壮，最终到达提高试管苗的移栽成活率。试管苗强壮，最终到达提高试管苗的移栽成活率。驯化的原那么：驯化的原那么：应从温度、湿度、光照及有无菌态等环境要素进展，驯化开场数天内，应应从温度、湿度、光照及有无菌态等环境要素进展，驯化开场数天内，应和培育时的环境条件类似；驯化后期，那么要与估计的栽培条件类似，从和培育时的环境条件类似；驯化后期，那么要与估计的栽培条件类似，从而到达逐渐顺应的目的。而到达逐渐顺应的目的。驯化的方法驯化的方法:炼苗炼苗由培育室转移到半遮荫的自然光下锻炼，

24、在自然光下恢复植物体内叶绿体由培育室转移到半遮荫的自然光下锻炼，在自然光下恢复植物体内叶绿体的光协作用才干和强壮度的光协作用才干和强壮度翻开瓶盖注入少量自来水使幼苗逐渐降低温度，转向有菌，这样幼苗周围翻开瓶盖注入少量自来水使幼苗逐渐降低温度，转向有菌，这样幼苗周围的环境就会逐渐与自然环境类似。的环境就会逐渐与自然环境类似。试管苗的驯化试管苗的驯化三、试管苗的移栽三、试管苗的移栽 常规移栽法常规移栽法 直接移栽法直接移栽法 嫁接移栽法嫁接移栽法 指选取生长良好的同一植物的实生苗或幼苗作砧指选取生长良好的同一植物的实生苗或幼苗作砧木，用试管苗作接穗进展嫁接的方法。木，用试管苗作接穗进展嫁接的方法。

25、四、提高试管苗移栽成活率的途径四、提高试管苗移栽成活率的途径 试管苗的生理情况 植物生长调理物质 无机盐浓度 活性炭 环境因子 移栽过程中试管苗从无菌向有菌逐渐过渡 1进展植物组织培育需求哪些设备？各有何作用?2植物组织培育主要包括哪些环节?各环节的主要工 作内容是什么?3培育基包括哪些根本成分?其作用是什么?如何配制?4如何对外植体、培育基、培育器皿、接种器械进 行灭菌？5离体培育的植物资料对光、温、湿度有何要求？如何调控？6.何谓玻璃化？何谓褐化？如何抑制？复复 习习 思思 考考 题题第二节第二节 实验室的设计与设备实验室的设计与设备 一、实验室设计一、实验室设计预备间、缓冲室、接种室、培育间预备间、缓冲室、接种室、培育间驯化室、温室驯化室、温室 预备室预备室高压灭菌器电子天平0.0001g，0.01g 酸度计1.紫外线灭菌灯 2.日光灯 3.任务台 4.凳子 5.搁物架 6.窗 7.推拉门 8.缓冲间培育间二、设备、仪器二、设备、仪器超净任务台 一设备 光照培育箱烘箱 摇 床体式显微镜倒置显微镜冷光源 电磁搅拌器摇床 空调机 除湿机 冰 箱电热蒸馏水发生器二各类器皿 1器皿的类型1培育器皿三角瓶、培育瓶、圆形培育瓶、果酱瓶、试管、L形管和T形管 2分注器 3刻度移液管4微量移液器5细菌过滤器三器械器具 打孔器 镊子 解剖刀 接种针 剪刀 电热灭菌器