大肠杆菌高效表达重组蛋白策略

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1、大肠杆菌高效表达重组蛋白策略、八 前言重组蛋白的制备在蛋白结构分析和医疗应用领域十分重要。药物蛋白的研究 需要高纯度的重组蛋白来进行药物动力学和物理化学的研究1。重组蛋白在检测 酶活、连接配体、蛋白相互作用等生物学领域广泛应用。已经表达出多种重组蛋 白被证明有很大的应用潜力2,3。通过基因工程改造的方法已经获得了许多性状 优良的宿主菌表达系统，尤其是通过大肠杆菌可以大量表达外源基因编码的重组 蛋白4。但是仍然有两个问题制约着大肠杆菌表达系统对重组蛋白的表达：一个 是表达量低，还有一个就是表达错误折叠的蛋白包涵体5。蛋白的表达和纯化工 艺一直在发展进步，但是超过 30%的重组蛋白为不具有生物活性

2、的包涵体，严重 影响了重组蛋白的生产应用6,7。在理想条件下，重组蛋白由强启动子进行表达，产生大量的具有生物学活性 的可溶性重组蛋白。但是，强启动子会导致重组蛋白的过表达 ,从而影响宿主菌 体的生长并产生包涵体8。在某些条件下可以通过变性、复性的方法使包涵体恢 复活性9，但是复性后的蛋白是否能够完全恢复活性仍然未可知。一般来讲，可 以通过表达条件的优化来促进蛋白的可溶性表达，比如：诱导温度、培养基组成、 宿主菌的种类。还可以通过多种方案来解决蛋白不溶的问题：蛋白重新折叠10， 构建融合蛋白11。另外想要进一步增加蛋白可溶性可以与分子伴侣共表达8或者 低温诱导12。本文对目前主要的促进蛋白可溶表

3、达的方法进行了比较全面的总结1.大肠杆菌表达系统的构建1.1选择表达宿主菌对于大规模的表达重组蛋白，一般选择胞内表达或者周质空间表达。与周质 空间表达相比，胞内表达的表达量更高，因此应用更为广泛。在实验研究和实际 生产中，已经有很多大肠杆菌表达系统广泛应用于。在表达体系中较为常用的大 肠杆菌为 B 菌株和 K12 菌株及它们的衍生菌株(表 113)。美国国立研究院已经 认证了 K12菌株的标准性以及安全的使用方案，因此K12菌株在生产应用中具有 极大的优势。但是由B菌株演变而来的BL系列菌株与K12相比，突变了 Ion和 ompT 两个基因14，因此具有许多表达优势：产物积累少，缺少蛋白酶，防

4、止产 物被降解。这些优势使得 BL 菌株也具有非常广泛的应用15,16,17。通常来讲，针对不同的重组蛋白，宿主菌的选择也是不同的。如果重组蛋白 含有大肠杆菌稀有密码子，就需要宿主能够表达针对这些密码子的tRNA，比如 BL21 (DE3) CodonPlus-RIL, Rosetta (DE3)等菌株。如果重组蛋白具有许多二硫键，则需要宿主表达环境为氧化条件的。 AD494 宿主菌是硫氧还蛋白突变型， 可以促进二硫键的折叠。Origami菌株为硫氧还蛋白突变和谷胱甘肽还原酶突变, 进一步加强了二硫键在细胞内的形成 18。另外一方面，如果表达的重组蛋白对 于宿主菌是有毒性的，则需要表达为包涵体

5、的形式。表1常用于重组蛋白表达的宿主菌及其特点E. coli strainlerivatinnKey (MhnrsA1MM4K-L2frxB mubinJ!; liiLziLilaLi cyh.ipl;txmic diNullidji: bund IbmiiiLiMTiiBL20RR14DcGk:ictiL in 1/MT and fimpT prntGwsML2I tnUBL2IgjB rrmtanli; fncililatc cytnplDmic disulfide hood fomiartion: dcfktcTiil iin 后円?ind 即护7 pnHcas饰BL2 I CodunH

6、ulULBL2IEriliisriccs Che t Kpnmskm ifcl a.ikairyutis.： pfubcin耳 Hhal cixilain Ljudofis rard$ li兀d in E. cWr: AGGr AGAP AL A. CUA; deficicnl in 如 andpwtcasES.BL2 Coifonrius-RPBL2JLnhajKcs thr cxrcssujn of uukaryotLC prutin thdl cunlnuo 匚Ddaits mrcly med in . co/?: AG G, AG. CCC; dcficiiCTit m 临 nndpn

7、nl&ascs.BLRBUIjwH rnuUrnd; trjihi lizcs tandem repents： dcfkienl im M啊 nnd 呷卩丁 protcfisc?BS34B strainMiit suxotmph:Labcb昭U4IE3L2JMutant designed for cspncssLon oi mEmbninc pnMeweC43E3L2JDouble mutiinl diigncd ter expression of nirmbrzinc pinlEEnsHMS174K-12代M muumt Rif rcsisianceJM S3K-12Usable for s

8、ocrctieu nf recombinant ptroEcioH into the periplasmOrigamiK42frxBor jnutHJit: greatly ihcililHtcs cylcplamut diuliadc bond IbnrLLtionOrigami IBBL2frxBDr nrntHJtt: greatly iiacililHtcs cloplaaiLic dLuliadc bond ionruitioji; dcficknt in foti and ompT prateLEESRrLiseLtaBL2Etilhajhcc the c罕 ns怨詁口 4t eu

9、karyoLk: proteins thaJi 匸询 誠口 codons rarely ued in E er罰:AU A, AGG, AGA- COG, CUA CCC? iud GGA: defteinl 5 的 arid umpT pmL血Ho沁曲电amiBL2Etilkajice the c.Kprekn tf eukaetk: proteins thaii elhj lain codons rarely Lied in E 赧):AUAS AGG, AGA, CGG； CLJAh CCC?釧il GGA; deiieienl in 血 and 圖pl (mMeag;曲玳.gnaMyl

10、aciliUlL cyinphsimk- djiiride tiiMLil Lurrkalkm1.2 质粒的设计理想的基因转录是质粒和启动子功能协同完成的。广泛使用的质粒都是由复 制子、启动子、标记位点、多克隆位点、融合蛋白联合调控进行转录的（图 120。） 重组蛋白的表达量与质粒的拷贝数、结构、分离稳定性有关。如果拷贝数低形成 的 mRNA 数量少，蛋白的表达量就会降低。高拷贝数可以提高蛋白的表达量， 但是这也会给宿主造成代谢上的负担。拷贝数很大程度上由起始子的复制情况决 定的，也体现出质粒是严密调控还是松散调控。- 0c Dpl4s) CilEl (15-20 copies)-pKJipM

11、Bl deilvatlve.540 ?0Q copiesB pl5A 10-12 copiwjpKl叽(5 mp3- affinity tags* Pcplide tags Ipoly-Ar- FLAG-P pely-HI cMlyc-. S-r Strep lli-ta Trx,selection marker Anllbktic r?lsl*n 幽P， CrfijTsL Ori,豊忙 J FJaatild addiction sys-LeifiSpromoterI coding sequence forI terminatorb fcTc/4KW5p IJfTJ/tac MCI P,/ F

12、fMPw Pl/PR rspAtag removal* EnCeroklnliE* Thrombin* factor Ka-TEVGST. ubiquilin. 5UMOrFli3)图 1. 质粒的基本构成高拷贝数质粒在生产应用中并不令人满意。首先，宿主为了保存高拷贝数质 粒，不得不在培养基中增加筛选抗生素。但是 FDA 限制临床应用产品中添加剂 的含量。其次，高拷贝数质粒存在分离不稳定性，尤其是在低抗生素的条件下23,24 第三，高拷贝数质粒的表达和维持需要大量能量，不可避免的会影响宿主菌的生 长和蛋白的合成。另外一个缺点就是，大量蛋白的过表达容易产生包涵体。利于蛋白产品高表达的大肠杆菌表达

13、系统应该是严密调控并且高转录效率 的。但是如果目的蛋白有毒性，则会损伤宿主细菌。另外有些特殊的宿主只能与 特定的质粒组合才能获得理想的重组蛋白。表 2. 大肠杆菌表达中经常使用的启动子PtoniotersInduction methodsKey featuresktcIPTGRelative low-level expressjcn: titratable: leakyireIPTGHih-level expression; titratable; leakyT7IPTGVei1 high-level expression; (itratable; leakyPhage ). pR, pLTe

14、mpcruluice shiftHih-level expression: light controlPhoAPhosphate depledonHigh-level expresskin; light control; media limitationpluxHomoserine JacloneHih-level expression; light coniroL: inexpensive inducer有多种启动子已经成功的用于表达各类重组蛋白(表225,26,27,17),。其中，laC 启动子及其衍生物，tac和trc，在研究和工业化中有着重要的应用28,25。tac和trc 启动子比

15、lac启动子更强，这三个启动子都是由IPTG进行诱导的。IPTG可以抑 制lac启动子的阻遏，因此重组表达的水平由培养基中IPTG的浓度进行调控。 但是， IPTG 价格比较昂贵，且对许多菌株有毒性作用。为了解决这些问题，通 突变筛选的方法获得了可以通过温度的调节控制热敏启动子。从T7噬菌体中 得到的T7启动子也广泛的应用于蛋白重组表达。T7噬菌体RNA聚合酶可以识 别T7启动子，DNA链的延长速率比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍。宿主菌染色 体中含有前噬菌体(入DE3)可以编码T7噬菌体聚合酶，在T7启动子衍生物 L8-UV5的调控下可以进行表达。这种新的lac启动子减少了对于AMP的依赖, 也

16、减少了对于葡萄糖抑制的敏感性。因此T7启动子系统被认为比lac启动子系 统更为强大。通过T7启动子系统可以获得重组目的蛋白占总蛋白含量50%，但 是大多以包涵体的形式存在23,30。储热调控启动子系统比如入噬菌体pL和pR启动子，也用于生产治疗性蛋 白。质粒中含有热敏性的CI857阻遏组件，可以通过温度的变化控制pL和pR启 动子。由于温控法容易操作，所以适合于大规模的产业化应用，同时也可以减少 培养基的污染。但是温控诱导也有其局限性，由于热激会抑制菌体的生长，对重 组蛋白的表达也会造成一定压力。但是对于蛋白产品的质量和产量，这些压力都 是可以忽略的。入噬菌体pL和pR启动子也可以在低温下进行

17、调控，应用于表 达可溶蛋白或者热敏感蛋白31。应用营养调控启动子 phoA 和 trp 时，培养基的营养成分要确保菌体的正常 生长并且能够利用磷酸盐进行诱导。这种诱导方法与其他的方法相比，诱导时间 范围非常广泛32。另外一种严谨型启动子1UX,从费时弧菌中分离得到，具有群 体感应元件，在基因表达中由luxI进行调控，通过添加自诱导AHL物进行转录 的激活。AHL的浓度通常为IPTG浓度的1/1000,因此这种方法更加经济利于生 产放大33。2融合标签的选择通过选择蛋白表达环境的方法不一定能够使蛋白可溶，因此进一步采用融合 标签的方法加强可溶蛋白的表达。在重组蛋白中增加融合标签可以增加蛋白的可

18、溶性，并且使亲和纯化的过程更为简便34。尽管这些标签最开始是用于促进目的 蛋白的分选及纯化，近些年的研究表明，融合标签也可以促进蛋白的产量，加强 蛋白的溶解性，并且促进蛋白的正确折叠35。许多大肠杆菌表达质粒都可以在不同的启动子调控下表达多种融合标签：多 聚组氨酸、麦芽糖连接蛋白(MBP)、谷胱甘肽转移酶(GST) 36。选择标签的主要 依据是蛋白本身的特性以及蛋白处理的阶段，比如：是否为治疗蛋白，层析分离 的成本以及过程可控性的影响37。组氨酸标签时目前应用最为广泛的融合标签。通过金属离子螯合层析的方法 可以对组氨酸标签标记的目的蛋白进行分离纯化。蛋白上的组氨酸标签与固载的 金属离子奥何物相

19、互作用页。另外通过MBP标记的蛋白可以通过形成交联直链 淀粉进行一步纯化39，之后用含有10 mM麦芽糖的非变性缓冲液洗脱连接上的蛋 白。GST也是一个亲和力标签，通过固载谷胱甘肽可以对GST标记的可溶蛋白 进行分离。洗脱缓冲液一般含有还原型谷胱甘肽。 GST 标记的重组蛋白也可以 通过酶催化或者免疫测定的方法进行定量检测34。想要系统的分析融合标签对于可溶蛋白的作用还是比较困难的，蛋白加入不 同的融合标签后的反应也不相同6，40。标签的选择十分重要，标签可能会影响天 然蛋白之间的相互作用、翻译后修饰、是否可溶、重组蛋白的表达胞内定位等多 个方面41，42。一些标签在很多条件下(含有盐离子、还

20、原剂、表面活性剂)都可 以实现功能，因此在之后的研究中可以弹性的选择不同的缓冲液组成，与标签的 功能相适应34。3.提高蛋白转录效率蛋白在大肠杆菌中的转录过程可以被分为 4 个部分:起始、延伸、终止、核 糖体循环。在大多数情况下，翻译的起始是蛋白合成决定速率的关键步骤。这个 效率由每条mRNA5末端的翻译起始区(TIR)的序列和结构决定的。翻译起始区 (TIR)由四部分组成：(1)核糖体结合位点(SD)序列，(2)起始密码子，(3)核糖体结 合位点和起始密码子之间的区域，(4)在SD序列上游或是起始密码子下游的翻 译增强子。调控TIR序列可以降低或者提高大肠杆菌中重组蛋白的表达44,45。已

21、经证明了六个核苷酸的SD序列(AGGAGG)比其他更长或者更短的序列在表达绿 色荧光蛋白(rGFP)方面效率更高46。在这个研究中，A/U合并的加强子使rGFP 的表达增强了 13倍。在对TIR区域进行修饰的时候要避免mRNA的二级结构覆 盖SD序列或者起始密码子。在SD区域中进行单点突变会使RNA噬菌体MS2 外壳蛋白的表达降低500倍47。将起始密码子AUG从碱基配对的mRNA结构 中暴露出来，可以有效提高大肠杆菌中IL-10的表达量，比野生型的表达量高10 倍48。最近，科学家研究出了翻译起始的生物学模型，可以通过设计核糖体的 结合位点来改变翻译起始速率。这个技术可以实现速率控制，并且细

22、微精确的调 整重组蛋白的表达43。表达量的精确程度对蛋白的分泌十分重要，如果表达速 率太快会影响细菌的分泌过程，导致最终蛋白产量低。但是为了重组蛋白产量的 最大化，翻译水平通常选择高分泌水平的表达方案49,44。4提高mRNA的稳定性mRNA的稳定性(半衰期)也会影响大肠杆菌中的表达速率。mRNA在 大肠杆菌中的降解主要是由于RNA酶的存在，包括内切酶(RNase E, K and III和 外切酶(RNase II和多核酸磷酸化酶)RNA酶和活性和菌体的生长环境有关50。 对于高表达系统而言，提高 mRNA 的稳定性主要有两个策略：通过宿主的基因 改造或者改变菌体生长条件，使mRNA的两端更

23、具有防护性，避免被RNA酶水 解51。实验证明，在序列5端非编码区中添加ompA基因可以形成一个茎环结构, 有效的延长外源mRNA的半衰期52。在人类IL-2的cDNA翻译终止子的位置添 加来源于苏云金杆菌的penP基因，可以加强mRNA的稳定性，提高IL-2在大 肠杆菌中的表达量52。研究表明，在C末端添加的rne基因，可以编码RNA酶， 导致mRNA的降解，因此对rne基因进行突变可以提高mRNA的稳定性，促进 重组蛋白的表达量53。含有这种突变的菌株已经应用于商业生产领域。5密码子优化除了 TIR序列和mRNA的稳定性以外，大肠杆菌密码子的特异性也影响蛋 白的翻译。表达含有稀有密码子的外

24、源基因会导致菌体生长停滞，蛋白表达过程 中过早结束翻译，基因产生移码，缺失等现象 54。当稀有密码子聚集时，这种 现象更明显55。解决这个问题的办法是根据大肠杆菌偏好性，综合的优化基因 序列，已经有多种方法可以对大肠杆菌和其他宿主菌进行优化 56。经过密码子 优化后的抗体序列在周质空间的表达量为原始基因的 100 倍57。添加稀有密码 子同源的tRNA也可以弥补密码子偏好的问题。大肠杆菌Rosetta (DE3)菌株具有 pRARE质粒可以编码tRNA，识别只有真核细胞中才具有的稀有密码子。通过这 种菌株生产人类重组蛋白时， 68种蛋白中有35种的产量获得了明显的提高58。 这种菌株可以表达在

25、BL21 (DE3)中无法表达的蛋白。应用pRARE质粒提高大肠 杆菌重组蛋白的表达量非常实用，其效果在多个试验中得到了验证59,60。6. 培养基环境对可溶表达的影响在大肠杆菌中想要获得具有生物学活性的可溶蛋白需要平衡DNA转录、蛋 白翻译、蛋白折叠三个过程。大肠杆菌中高效表达可以获得占总蛋白 30%的重组 蛋白，如果加入分子伴侣和调节因子可以获得更多。另外，许多蛋白的正确折叠 需要二硫键的正确形成以及糖基化，而大肠杆菌胞内表达环境不能满足这些调节 所以许多人类重组蛋白在大肠杆菌中表达会出现大量的错误折叠，形成包涵体。 培养条件对于外源基因的表达来说非常重要。一般来讲，可以通过控制合成速率

26、的方法来避免包涵体的形成。主要的影响因素有：不同时间进行诱导，诱导后陪 时间、诱导温度、诱导物浓度。6.1 不同时间进行诱导对表达的影响通常在菌体生长的对数期早期进行诱导，但是也有报道显示可以在对数期末 期61甚至平台期62进行诱导。因此，诱导前的菌体浓度对于重组蛋白的表达来 讲是非常重要的影响因素。6.2 诱导温度和诱导后的培养时间对表达的影响两个影响蛋白可溶表达的重要影响因素是诱导温度和诱导后时间。通过降低 诱导温度的方法可以降低蛋白合成的速率，减少包涵体的形成。通过这种方法已 经成功表达了多种难以表达的蛋白 12。高温可以促进菌体生长，但是易产生质 粒丢失，不利于含有外源基因的质粒的表达

27、63。在连续培养的过程中这种影响 更为明显。总的来说，高温和温度依赖性的疏水作用易与导致聚集沉淀 64。在 菌体中，有一些蛋白适合缓慢、长时间的诱导，那就必然要选择低温条件下65。6.3 诱导剂浓度对表达的影响低诱导剂浓度可能会导致诱导效率降低，重组蛋白产量降低；诱导剂价格昂 贵，如果过量加入不仅会增加成本，还会带来毒性抑制菌体的生长，影响重组蛋 白的表达66。因此，诱导剂浓度应该严格控制，略高于临界浓度。 IPTG 浓度在0-1 mM之间对菌体的生长速率和菌体浓度没有明显影响66。但是，IPTG的浓度 需要与宿主菌、载体、重组蛋白相适应。7. 胞内蛋白折叠调节因素胞内折叠调节因子包括：折叠伴

28、侣(DnaK和GroEL)，维持伴侣(e.g.,IbpA 和B)，降解伴侣(ClpB),这些蛋白都在保持蛋白正确折叠构象方面有着非常重要 的作用。共表达这些分子伴侣可以增强许多种蛋白的溶解性67。共表达 GroEL/ GroES时，表达的B型钠尿肽抗体中有65%时可溶的，比非共表达提高了 2.4倍 68。但是，通过共表达的方法并不一定能够增强蛋白的可溶性，也可能会导致 菌体代谢的负担，降低蛋白的表达水平。不同的宿主菌也可以促进蛋白的折叠可 溶。破坏 txrB 和 gor 基因，可以促进蛋白二硫键的形成和异构化。通过在胞内 过表达二硫键异构酶DsbC可以加强二硫键的形成69。结语：大肠杆菌表达系

29、统是基因工程中最早的表达系统, 但还存在一些问题: 一是 有些来自真核生物的蛋白并没有得到有效的表达; 二是选择一个合适的宿主和 载体系统要经过多次尝试, 费时费力; 三是重组蛋白的分泌表达技术不如胞内表 达技术研究得透彻。要解决这些问题可以通过以下途径: (1)通过基因导入将修饰 机制引入原核表达系统, 如糖基化、磷酸化、乙酰化和酰胺化等; ( 2)构建一套适 应性和功能强大的表达载体系统, 避免大范围尝试; (3)深入研究表达系统的分泌 机制,加强信号肽功能, 分子伴侣和转运通路机制的研究, 获得更多的胞外分泌。 虽然现在已经出现大量真核表达系统 , 但大肠杆菌仍然是基础研究和商业生产 重

30、组蛋白的强大工具, 随着各项研究的深入, 重组蛋白的高效表达技术将会越来 越完善。参考文献1 . Casteleijn M G, Urtti A, Sarkhel S. Expression without boundaries: cell -free protein synthesis in pharmaceutical researchJ. International journal of pharmaceutics, 2013, 440(1): 39-47.2 . Bondos S E, Bicknell A. Detection and prevention of protein ag

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