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1、 血清 ALT活性的测定 生物化学与分子生物学教研室 【 实验目的 】 1掌握血清 ALT活性测定的基本原理。 2了解血清 ALT的测定方法 (赖氏法 )及临床意义。 【 实验原理 】 丙氨酸氨基转移酶 (ALT)， 又称谷丙转氨酶 (GPT)， 在 37 、 pH7.4的条件 下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与 -酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮 酸： 生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的 2,4二硝基苯肼发生加成反 应，生成丙酮酸 -2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的 苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦 即与 ALT活性的高低成正比关系。据此与同样处理的丙酮
2、酸标准液相 比较，便可算出或通过标准曲线查出血清中 ALT的活性。 尽管基质液中余下的 -酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝 醌化合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对 505nm 的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用 标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光 度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，结果比其他 比色法准确。故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续 监测法的单位使用赖氏法。 1981年全国常规生化检验方法 学术讨论会认为赖氏法测定 ALT活性较为合理，全国肝炎 协作会议也建议统一使用改良赖氏法。 ALT活性测定主要有 两类方法： 一是卡门氏（ Karman）
3、分光光度法 ，测定的是酶促反应速率。其原理 如下： 由于 NADH在波长 340nm处有特异吸收峰，因此 ALT的活性可通过 NAD H的减少量，亦即通过 340nm吸光度的减少量间接作出定量测定。这一 方法特异性、准确性高。但是此法除要加入待测酶 ALT的底物外，还需 要加入指示酶 LDH及其辅酶 NADH，又需用紫外分光光度计，因此不 易为一般临床化验室推广。 【 方法评价 】 丙酮酸 +NADH+H+ 乳酸 +NAD+ LDH 二是比色测定法， 如：金氏法（ King法）、穆氏法（ Mohu n 法）和赖氏法（ Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作 步骤及作用温度等完全
4、相同。不同之处在于作用时间： King 法 60min ， Mohun法和 Reiman法 30min。因此它们的单位定义 和标准曲线制备也不同。 赖氏法没有制定自身的单位定义， 而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的 。 1个 卡门 氏单位 的定义是：在温度 25 ， pH7.4，波长 340nm，光径 1cm 的条件下， 1ml血清使 NADH的吸光度下降 0.001的转氨酶活性 。 可见卡门氏单位不是用物质的量浓度，而是用物质的吸光 度表示酶的活性单位的。 若将卡门氏单位的定义条件代入国际单位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位 的换算关系： 1卡门氏单位 =0.4821 IU/L(
5、25) 。 改原赖氏法的反应温度 (40 改为 37) 和底物浓度 (改为低 浓度 )的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色 法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较 为一致，能较好反映酶的真实活性。 由于赖氏法设计的底物浓度 ,如 -酮戊二酸不足，反应速度 只能达到最大速度的 65%；显色剂 2,4-二硝基苯肼的用量只 及反应液中酮酸浓度的一半；保温 30min的酶促反应后， 新生成的丙酮酸和未用完的 a-酮戊二酸存在着无法人为控 制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性 较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。 【 试剂 】 1 0.1mol/L磷酸盐缓冲液 (
6、pH7.4)：将 420mlNa2HPO4溶液和 80ml0.1mo1/LNaH2PO4溶 液混匀，置冰箱保存。 2基质溶液 (DL-丙氨酸 200mmol/L， 酮戊二酸 2mmo1/L)：精确称取 DL-丙氨酸 1. 79g和 酮戊二 29.2mg，溶于 50ml0.1mo1/L磷酸盐缓冲液中，用 1mol/LNaOH溶液 （约 0.5ml）调至 pH至 7.4，再加磷酸缓冲液至 100ml,最后加入麝香草酚（每 L可加 0. 9g）防腐，置冰箱中保存，可用一个月。 3 2.4 二硝基苯肼溶液 (1mmol/L)：称取 2.4 二硝基苯肼 19.8mg,溶 100ml/L盐酸 中，置室温保
7、存。 4 0.4mol/L氢氧化钠溶液： NaOH16g溶于蒸馏水中调至 1000ml。 5丙酮酸标准液 (2mol/L)：丙酮酸钠 22.0mg，置于 100ml容量瓶中，加 0.05mol/L硫 酸至刻度。 6. 0.1mol/LNa2HPO4溶液：称取 Na2HPO42H 2O17.6g溶于少量蒸馏水中，待溶解后加 蒸馏水至 1000ml，至冰箱中保存。 7. 0.1mol/LKH2PO4溶液：称取 KH2PO413.6g溶于少量蒸馏水中，待溶解后加蒸馏水至 1000ml，至冰箱中保存。 【 器材 】 恒温水浴 锅 ， 723型分光光度计，刻度吸量管，滴管，试管等。 【 试剂与器材 】
8、【 步骤 】 加入物 (ml) 管号 0 1 2 3 4 0.1mol/L磷酸盐缓冲液 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 2mmol/L丙酮酸标准液 0 0.05 0.10 0.15 0.20 基质溶液 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 相当于酶活力单位 0 28 57 97 150 （ 2）分别向各管加入 2， 4二硝基苯肼液 0.5ml,混匀后置 37 水浴箱， 20分钟后取出， 分别向各管加入 0.4mol/LNaOH溶液 5.0ml。 （ 3）混匀，放置 10分钟在 505nm波长比色，以蒸馏水调零点，读取各管光密度。各管 光密度值分别减去 0号光密度，
9、以所得差值与相应的卡门氏酶活力单位作图即得标准 曲线。 （ 4）当血清标本的酶活力单位超过 150时，应将血清用生理盐水稀释 5倍或 10倍后再 进行测定。 （ 5）加入 2， 4二硝基苯肼溶液后，应充分混匀，使反应完全。 （ 6）绘制标准曲线：第 1-4管的光密度值值分别减去 0管光密度值值，所得差值为纵 坐标；对应的卡门氏单位为横坐标，作图，画出标准曲线。 （标准曲线已绘） 1标准曲线的制作： (1)取 5支试管，编号，按下表操作 ： 加入物（ ml） 测定管 对照管 血清 0.1 0.1 基质溶液 0.5 混匀，置水浴箱中保温 30分钟 2,4-二硝基苯肼液 0.5 0.5 基质溶液 0
10、.5 混匀，置水浴箱中保温 20分钟 0.4mol/L氢氧化钠溶液 5.0 5.0 2. 在测定前将底物液在 37 水浴中预温 5分钟，然后按下表操作： 【 参考值 】 5 - 25卡门氏单位 。 室温放置 10分钟后，在 505nm波长，以蒸馏水校正零点，读取各管的光密度值， 测定管光密度值减去对照管光密度值后，从标准曲线查出 。 1.酶测定中，温度、时间对酶的活力影响很大，故应控制好测定时的温 度（要求准确到 37 0.5oC），并准确掌握保温时间。 2.丙酮酸的显色受温度影响，故应于季节变化时及底物成份之批号更换 时重新制作标准曲线。 3.因为 -酮戊二酸也能与 2.4-二硝基苯肼作用生
11、成苯腙而显色，为了减 少其对丙酮酸测定的干扰作用，底物中 -酮戊二酸的浓度很低，不能保 证酶反应的充分进行；且 2.4-二硝基苯肼的浓度也比较低，因此标准曲 线不呈直线。 【 注意事项 】 谷丙转氨酶广泛存在于机体组织中，在肝细胞中此酶活性极 强，心肌细胞中此酶活性亦很强，故在肝疾患 (如肝炎、肝癌 等 )及心肌受损时，该酶可大量释放入血，使血清谷丙转氨酶 活性大大增加。临床上常借此帮助诊断。另外，血细胞中亦 含有谷丙转氨酶，若取血时发生溶血，血清谷丙转氨酶也可 增高，故应避免溶血。 【 临床意义 】 1.血清中谷丙转氨酶的测定有何临床意义？ 2.血清谷丙转氨酶的测定有何注意点？为什么要避免溶血？ 【 思考题 】 THANK YOU
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