中国药典版药品微生物检验指导原则

《中国药典版药品微生物检验指导原则》由会员分享，可在线阅读，更多相关《中国药典版药品微生物检验指导原则（87页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、中国药典2010版药品微生物检查指导原则我国微生物检查发展概况抑菌剂效力检查法指导原则药品微生物检验替代方法验证指导原则微生物限度检查法应用指导原则药品微生物实验室规范指导原则我国微生物检查发展概况 我国开展药品无菌检查和微生物限度检查已有数十年的历史。新中国第一部药典（1953年版）收载了无菌检查法，以后每部进行了不断的修订和完善，从样品的取样量到培养时间的变化都更加的科学，合理。我国药品微生物限度检查起步较晚，始于1972年。2010版药典起草的指导思想版药典起草的指导思想 一、以科学发展观为统领，服务于资源节一、以科学发展观为统领，服务于资源节约型社会、环境友好型社会的要求；落实科学约型

2、社会、环境友好型社会的要求；落实科学监管理念，着力解决发展中的问题。监管理念，着力解决发展中的问题。二、与时俱进，广泛吸纳先进技术与成果；二、与时俱进，广泛吸纳先进技术与成果；坚持自主与创新；积极推进药品标准化战略，坚持自主与创新；积极推进药品标准化战略，提高我国药品标准总体水平，着力提升提高我国药品标准总体水平，着力提升中国中国药典药典在国际社会中的地位和作用，提高综合在国际社会中的地位和作用，提高综合竞争力，促进医药产业的健康发展，为构建社竞争力，促进医药产业的健康发展，为构建社会主义和谐社会作出贡献。会主义和谐社会作出贡献。2010版药典起草的基本原则版药典起草的基本原则 一、坚持保障药

3、品质量、维护人民一、坚持保障药品质量、维护人民健康的原则健康的原则 二、坚持继承、发展、创新的原则二、坚持继承、发展、创新的原则 三、坚持科学、实用、规范的原则三、坚持科学、实用、规范的原则 四、坚持质量可控性原则四、坚持质量可控性原则 五、坚持标准先进性原则五、坚持标准先进性原则 六、坚持标准发展的国际化原则六、坚持标准发展的国际化原则 2010版药典在2005版的基础上增订了白色念珠菌的检查，规定眼用制剂按无菌制剂要求，明确用于烧伤或严重创伤的外用剂型均按无菌要求。中药橡胶膏剂首次提出不得检出致病菌检查要求。新增抑菌效力检查法指导原则、药品微生物检验替代方法验证指导原则、微生物限度检查法应

4、用指导原则、药品微生物实验室规范指导原则等，以缩小附录在微生物检查方面与国外药典的差距。2010版中国药典，我国药品无菌、微生物限度检查方法和标准在科学性、合理性以及与国际接轨方面均有了长足进展，使我国药品无菌和微生物限度检查步入了一个崭新的时期。抑菌剂效力检查法指导原则 如果药物本身无足够的抗菌力，在正常储存和使用过程中（尤其是多剂量制剂）可能发生微生物污染和大量繁殖，对患者造成感染或引起药物变质。最近我国白内障病人感染铜绿假单胞菌事件，以及目前国外尚在调查的博士伦护理液的问题，足以提醒我们此类制剂微生物污染的严重后果。在生产过程中添加适合的抑菌剂可以保证药品在正常储存和使用过程中的质量。目

5、前欧洲、美国、英国等国药典均已在附录中收载了抑菌剂效力测定，我国2010版药典增订抑菌剂效力检查法指导原则，目的在于缩短与欧美国家的距离，评价最终产品的抑菌效力，同时也可用于指导生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂的确定。所有抑菌剂都具有一定的毒性，而且在贮存过程中其有效性有可能因药物的活性成分提高或降低，为保证药品的质量和用药安全，添加抑菌剂的量应根据制剂本身是否具抗菌活性，保持最低有效量。抑菌剂效力的测定可为生产过程中添加抑菌剂提供指导，随着科学发展，新型抑菌剂大量出现，抑菌剂效力的测定更为重要；使生产者正确掌握产品中添加抑菌剂的效力，有助于选择合适的抑菌剂，也可对抑菌剂使用的正确性给予评价。抑

6、菌剂效力检查法系用于测定灭菌、非灭菌制剂中抑菌剂的活性，以评价最终产品的抑菌效力，同时也可用于指导生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂的确定。如果药物本身不具有充分的抗菌活性，那么应根据制剂特性（如水溶液制剂）添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常贮藏和使用过程中可能发生的微生物污染和繁殖使药物发生变质而对使用者造成危害，尤其是多剂量包装的制剂。在药品生产过程中，抑菌剂不能用于替代药品生产的GMP管理，不能作为非灭菌制剂降低微生物污染的唯一途径，也不能作为控制多剂量包装制剂灭菌前的生物负载的手段。所有抑菌剂都具有一定的毒性，制剂中抑菌剂的量应为最低有效量。同时，为保证用药安全，最终包装容器中的抑菌剂有效

7、浓度应低于对人体有害的浓度并在药品包装上注明添加抑菌剂的名称和数量。在制剂通则中要求具有抗菌活性的制剂，不管是添加的抑菌剂，还是药物本身具有抗菌活性，在药物研发阶段，均应确认其抗菌效力。抑菌剂的抗菌效力在贮存过程中有可能因药物的成分或包装容器等因素影响而提高或降低，因此，应验证最终容器中的抑菌剂效力在效期内不因贮藏条件而降低。本试验方法和抑菌剂抑菌效力判断标准用于包装未启开的成品制剂。抑菌剂效力测定实验 1.培养基：胰酪胨大豆肉汤培养基；胰酪培养基：胰酪胨大豆肉汤培养基；胰酪胨大豆琼脂培养基；沙氏葡萄糖液体培养基；胨大豆琼脂培养基；沙氏葡萄糖液体培养基；沙氏葡萄糖琼脂培养基。沙氏葡萄糖琼脂培养

8、基。用于抑菌剂效力测定的培养基必须通过用于抑菌剂效力测定的培养基必须通过适用性检查。适用性检查。测定细菌用胰酷胨大豆琼脂培养基，测测定细菌用胰酷胨大豆琼脂培养基，测定真菌用沙氏葡萄糖琼脂培养基。定真菌用沙氏葡萄糖琼脂培养基。2.菌种：同培养基适用性检查，若需要，菌种：同培养基适用性检查，若需要，制剂中常见的污染微生物也可作为试验菌株。制剂中常见的污染微生物也可作为试验菌株。制备成浓菌液（制备成浓菌液（108cfu/ml）。）。3.供试品接种：为了达到试验目的，根据供供试品接种：为了达到试验目的，根据供试品的给药途径和用途将供试品分为四类，以试品的给药途径和用途将供试品分为四类，以便标准的制定和

9、执行。便标准的制定和执行。1 类类 注射剂、其他非肠道制剂，包括乳剂、注射剂、其他非肠道制剂，包括乳剂、耳用耳用 制剂、无菌鼻用制剂及眼用制剂制剂、无菌鼻用制剂及眼用制剂 2 类类 局部给药制剂、非灭菌鼻用制剂及用于局部给药制剂、非灭菌鼻用制剂及用于 黏膜的乳剂黏膜的乳剂 3 类类 口服非固体制剂（非抗酸制剂）口服非固体制剂（非抗酸制剂）4 类类 非固体抗酸制剂非固体抗酸制剂 抑菌剂效力可能受试验用容器特征的影响，抑菌剂效力可能受试验用容器特征的影响，如容器的材质、形状、体积及封口的方式等。因如容器的材质、形状、体积及封口的方式等。因此，只要供试品每个包装容器的装量足够试验用，此，只要供试品每

10、个包装容器的装量足够试验用，同时容器便于按无菌操作接入试验菌液、混合及同时容器便于按无菌操作接入试验菌液、混合及取样等，一般应将试验菌直接接种于供试品原包取样等，一般应将试验菌直接接种于供试品原包装容器中进行贮存。每一容器接种一种试验菌，装容器中进行贮存。每一容器接种一种试验菌，接种量按供试品类别确定。若因供试品的性状或接种量按供试品类别确定。若因供试品的性状或每个容器装量等因素需将供试品转移至无菌容器每个容器装量等因素需将供试品转移至无菌容器时，该容器的材质不得影响供试品的特性（如吸时，该容器的材质不得影响供试品的特性（如吸附作用），特别应注意不得影响供试品的附作用），特别应注意不得影响供试

11、品的pH，pH对抑菌剂的活性影响很大，同时容器的口径大对抑菌剂的活性影响很大，同时容器的口径大小应便于供试品的进出及混匀。小应便于供试品的进出及混匀。取包装完整的供试品至少取包装完整的供试品至少5份，直接份，直接接种试验菌，或取适量供试品分别转移接种试验菌，或取适量供试品分别转移至至5个适宜的无菌容器中（若试验菌株数个适宜的无菌容器中（若试验菌株数超过超过5株，应增加相应的供试品份数），株，应增加相应的供试品份数），每一容器接种一个试验菌。每一容器接种一个试验菌。1、2、3类供试品类供试品1g或或1ml接种菌接种菌量为量为105106cfu，4类供试品中类供试品中1g或或1ml接种菌量为接种菌

12、量为103104cfu，接种菌，接种菌液的体积不得超过供试品体积的液的体积不得超过供试品体积的05%1%，充分混合，使供试品中，充分混合，使供试品中的试验菌均匀分布。的试验菌均匀分布。4.贮存：接种的供试品在试验期间贮存：接种的供试品在试验期间置置2025避光贮存，控制温度变化尽可避光贮存，控制温度变化尽可能小，并防止被污染。能小，并防止被污染。5.存活菌数测定：根据产品类型及存活菌数测定：根据产品类型及表表2规定的时间，分别从上述每一容器取规定的时间，分别从上述每一容器取供试品供试品1ml（g），用），用pH7.0无菌氯化钠无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成蛋白胨缓冲液稀释成1：10；1：100

13、；1：1000等稀释级，按等稀释级，按验证过的菌数测定方法验证过的菌数测定方法（由于供试品中含有抑菌活性，所以菌（由于供试品中含有抑菌活性，所以菌数测定方法应进行验证）测定供试品中数测定方法应进行验证）测定供试品中所含的菌数，并换算成所含的菌数，并换算成lg值。值。6.结果判断：计数结果与初始值（结果判断：计数结果与初始值（0时时菌数）的常用对数值比较，根据表菌数）的常用对数值比较，根据表2进行进行判断。试验结果按有效数字的修约规则进判断。试验结果按有效数字的修约规则进舍，保留一位小数。结果符合表舍，保留一位小数。结果符合表2要求可要求可判断该产品抑菌效力符合规定。判断该产品抑菌效力符合规定。

14、表 防腐剂抗菌效力标准 实例实例 1、氯化钠注射液、氯化钠注射液、碳酸氢钠注射液不含抑菌剂碳酸氢钠注射液不含抑菌剂加入菌从初始到加入菌从初始到6h就开始无限增加，不具抑菌力，就开始无限增加，不具抑菌力，抗病毒口服液从初始到抗病毒口服液从初始到24 h对数值无变化，对数值无变化，72h后明后明显降低，具一定的抑菌力。显降低，具一定的抑菌力。2、呋麻滴鼻液、硫糖铝混悬液、阿昔洛韦滴眼、呋麻滴鼻液、硫糖铝混悬液、阿昔洛韦滴眼液、鲸脂滴耳液、洁尔阴洗液从初始值到液、鲸脂滴耳液、洁尔阴洗液从初始值到7天后计算天后计算值大于值大于1.0 lg降低值，从初始值到降低值，从初始值到14天后计算值大于天后计算值

15、大于3.0 lg,具较强的抑菌效力。具较强的抑菌效力。3、波斯特是特效抑菌剂具极强的抑菌效力，、波斯特是特效抑菌剂具极强的抑菌效力，72h抑菌效力达抑菌效力达100%。采用对数值计算简便、结果准确、易于判断采用对数值计算简便、结果准确、易于判断。药品微生物检验替代方法 验证指导原则 本指导原则是为所采用的试验方法能否替代药典规定方法用于药品微生物的检验提供指导。三类微生物检验的新技术 （1）基于微生物生长信息的检验技术，如生物发光技术、电化学技术、比浊法等；（2）直接测定被测介质中活微生物的检验技术，如固相细胞计数法、流式细胞计数法等；（3）基于微生物细胞所含有特定组成成分的分析技术，如脂肪酸

16、测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。微生物检验的新技术与传统的检验方法比较，具有检验简便，速度快的特点，有实时或近实时监控的潜力，能够对生产过程的关键工艺环节作出及时的微生物质量评价，使生产早期采取纠正措施及监控和指导优良生产成为可能，同时，新技术的使用也促进了生产成本降低及检验水平的提高，因此在医药行业完全有必要也有可能使用微生物检验的替代方法。采用非药典规定的替代方法进行微生物检验时，应进行替代方法的验证，确认其应用效果优于或等同于药典的方法。若替代方法只是针对药典方法的某一环节进行技术修改，则验证仅针对该替代技术而非整个检验方法。药品微生物检验方法分为定性试验和定量试验。定性试验

17、是测定样品中是否存在活的微生物；定量试验是测定样品中存在的微生物数量。替代方法的验证也分为定性和定量两类，不同类型需要验证的参数不同，验证参数的设定借鉴了美国和欧洲药典的规定，但又结合了我国国情。具体参数的设定见下表。参数定性检验定量检验准确度精密度专属性检测限定量限线性范围重现性耐用性注：表示需要验证 表示不需要验证替代方法的一般要求n 在以替代方法对样品检验的适用性进行验证前，必须证明所选用的替代方法具有方法适用性，即表明在不含样品的情况下，替代方法的专属性、精密度、检测限等参数。n 确认方法的适用性后，用样品按上表规定的参数进行验证。验证至少用2个批号的样品，每批样品每个菌应至少平行进行

18、三次独立实验。n 参数验证的菌种应包括培养基适用性检查规定的菌种，必要时，还应根据替代方法及样品的特性增加相应的菌种。定性检验的方法验证 1、专属性：是指检测样品中可能存在的特定微生物种类的能力。强调应关注样品存在对检验结果的影响 在使用依赖培养技术（以微生物生长作为判断）的替代方法时，样品的存在会导致检验出现假阴性，应特别确认培养基的促生长试验及样品的存在对检验结果的影响。对于不依赖培养技术的替代方法，样品的存在还可能导致检验出现假阳性，应特别确认检测系统中的外来成分不得干扰试验，确认样品的存在不会对检验结果造成影响。采用替代方法进行控制菌的检验，还应选择与控制菌具有类似特性的菌株作为验证对

19、象。2、检测限：是指在替代方法设定的检验条件 下，样品中能被检出的微生物的最低数量，该数量是指在稀释或培养之前初始样品所含有的微生物数量，而不是指检验过程中某一环节的供试液中所含有的微生物数量。验证的关键是确定接种菌的最低数量（每单位不超过5cfu），分别用药典方法和替代方法对该菌进行检验，比较两种方法的差异。与国外药典规定相同，要求试验菌的接种量应能够在采用药典方法检验时，有50的检出率。检测限验证至少应重复进行5次。3、重现性：是指相同的样品在正常的实验条件（如实验场所、实验人员、仪器、试剂的批次等）发生变化时，所得检验结果的精密度。反映了微生物检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力

20、。验证的关键是使接种菌的量在检测限以上，评价验证结果时，应排除样品均一性的影响 4、耐用性：是指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方法正常使用时的可靠性提供依据。对替代方法进行耐用性评价，确定方法操作的关键注意点。在开展了上述评价后，可以不必比较替代方法的耐用性与药典方法的差异。定量检验的方法验证 1、准确度：是指替代方法的检验结果与药典方法检验结果的一致程度。准确度的确认应在检验的范围内。通常用微生物的回收率（）来表示准确度。验证的菌浓度应该在检测范围内，一般应选择能够准确计数的最高浓度，系列稀释至较低浓度，并且至少应该有5种浓度，每种浓度重复检验5次。替代方法的回收率应

21、该达到70以上。当替代方法并不依赖微生物生长出菌落或出现混浊来进行定量时，可能出现回收率高于药典方法的情况，此时应结合专属性的内容对准确性进行评价。2、精密度：是指在检验范围内，对同一个均匀的样品多次重复取样测定，其检验结果的一致程度。通常采用标准偏差或相对标准偏差（变异系数）来表示。验证的菌浓度同准确度，每种浓度重复检验10次。可以接受的相对标准偏差（RSD）应不大于35。一般来说，替代方法的相对标准偏差（RSD）应不大于药典方法。在该项目上，USP 的规定是1535，研究表明，当含菌浓度在30300cfu/ml时，计数结果的RSD完全可能在15以内，因此，指导原则中对该指标作了修改。3、专

22、属性：是指通过检测适宜的试验菌，以证明检验方法与其设定目的相适应的能力。例如，菌落计数平皿法其设定目的在于检出一定数量的微生物，则其专属性验证应证明当样品中存在一定数量的试验菌时，通过平皿法检验，能够检出试验菌，而样品的存在不会对结果造成影响。验证的关键是合理评价样品的存在对检验结果的影响，当替代方法不依赖微生物生长出菌落或出现混浊就可以定量时，这种评价显得尤为必要。4、定量限：是指样品中能被准确检验的微生物最低数量。验证的关键是在检验范围的低限，选择尽可能低的5种菌浓度，每种浓度重复测定5次，替代方法的定量限不得大于药典方法。5、线性：是指在检验范围内，检验结果与样品中微生物数量成比例关系的

23、程度。线性验证时必须覆盖能够准确检测的所有浓度范围。每株菌至少应该有5种浓度，每种浓度至少测定5次。在对验证数据进行处理时，应以样本中预期的菌浓度为自变量，以不同方法的计数结果为因变量，进行线性回归分析，计算相关系数，替代方法的相关系数不得低于0.95。6、范围：是指能够达到一定的准确度、精密度和线性，检验方法适用的高低限浓度或数量的区间。7、重现性：是指相同的样品在正常的实验条件（如实验场所、实验人员、仪器、试剂的批次等）发生变化时，所得检验结果的精密度。反映了微生物检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力。验证的关键是使接种菌的量在检测限以上，评价验证结果时应制备均一的实验样本 8、耐

24、用性：是指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方法正常使用时的可靠性提供依据。当检验方法采用基于培养的技术时，一般的参数变化是指对培养温度和时间进行调整，上述调整对检验结果的影响并不显著。微生物限度检查法应用指导原则微生物限度检查法应用指导原则 此原则的制定是为了更好应用微生物限度检查法，对标准和方法中的特定内容及标准的应用做进一步说明。应用此原则应结合2010年版中国药典微生物限度检查法详细解读。主要对以下各条作了明确。1.对所用试剂的要求：有效性和无毒性。2.检验方法的选择：尽量选择操作简便，快速及避免损伤供试品中污染的微生物的方法。3.对离心沉淀法的重新认识：尽量避免采

25、用该方法，更不宜采用高速离心沉淀集菌。4.对照培养基的说明：由中检所研制及分发。5.无法消除供试品的抑菌作用时，可根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则选择更高稀释级试验。6.控制菌的进一步确认应选择已被认可的菌种鉴定方法。7.药品的生产、贮存、销售及新药标准制定、进口药品标准复核、考察药品质量、仲裁中，除品种或制剂通则项下另有规定外，其微生物限度均以药典的“药品微生物限度标准”为依据。8.2010年版二部化学药制剂通则项下有微生物限度要求的制剂，微生物限度为必检项目；对于只有原则性要求的制剂（如：丸剂、口服片剂、胶囊剂、颗粒剂），应对其被微生物污染的风险进行评估。在保证产品对患者安全

26、的前提下，通过回顾性验证或在线验证积累的微生物污染数据表明每批均符合微生物限度标准的要求，那么可不进行批批检验，但必须保证每批最终产品均符合微生物限度规定。上述固体制剂若因制剂本身及工艺上述固体制剂若因制剂本身及工艺的原因导致产品易受微生物污染，应在品的原因导致产品易受微生物污染，应在品种项下列出微生物限度检查项及微生物限种项下列出微生物限度检查项及微生物限度标准，如生化类制剂。度标准，如生化类制剂。9.对局部给药制剂控制更严格。对局部给药制剂控制更严格。用于手术、烧伤及严重创伤的局部给用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法要求。对于创伤药制剂应符合无菌检查法要求。对于创伤程度

27、无法判断的局部给药制剂，若没有证程度无法判断的局部给药制剂，若没有证据证明药品不存在安全性风险则应符合无据证明药品不存在安全性风险则应符合无菌检查法要求。菌检查法要求。10.制定药品的微生物限度标准时，除了依据制定药品的微生物限度标准时，除了依据“药品微生物限度标准药品微生物限度标准”外，还应综合考虑原料来源、外，还应综合考虑原料来源、性质、生产工艺条件、给药途径及微生物污染对患者性质、生产工艺条件、给药途径及微生物污染对患者的潜在危险等因素，提出合理安全的微生物限度标准，的潜在危险等因素，提出合理安全的微生物限度标准，因此，必要时，特殊品种为保证其疗效、稳定性及避因此，必要时，特殊品种为保证

28、其疗效、稳定性及避免对使用者的潜在危害性，应制定更严格的微生物限免对使用者的潜在危害性，应制定更严格的微生物限度标准，并在品种项下规定，如眼用液体制剂，目前度标准，并在品种项下规定，如眼用液体制剂，目前其生产工艺及生产条件尚难达到无菌产品的要求，但其生产工艺及生产条件尚难达到无菌产品的要求，但从使用者的安全性考虑，建议按无菌产品的要求进行从使用者的安全性考虑，建议按无菌产品的要求进行控制。控制。制定辅料、化学原料药、中药提取物的微生物限制定辅料、化学原料药、中药提取物的微生物限度标准时，除参照相应制剂的微生物限度标准外，还度标准时，除参照相应制剂的微生物限度标准外，还应综合考虑相应制剂及其生产

29、工艺的特性。应综合考虑相应制剂及其生产工艺的特性。11.2010年版一部对动物类原药材粉作年版一部对动物类原药材粉作了明确规定，利于标准的正确理解和执行。了明确规定，利于标准的正确理解和执行。具体规定如下：具体规定如下：含动物类原药材粉的口服中药制剂要含动物类原药材粉的口服中药制剂要求不得检出沙门菌。其中的动物类原药材求不得检出沙门菌。其中的动物类原药材粉是指除蜂蜜、王浆、动物角、阿胶外的粉是指除蜂蜜、王浆、动物角、阿胶外的所有动物类原药材粉，如牡蛎、珍珠等贝所有动物类原药材粉，如牡蛎、珍珠等贝类，海蜇、等水产品，冬虫夏草、人工牛类，海蜇、等水产品，冬虫夏草、人工牛黄等。黄等。药品微生物实验室

30、规范指导原则药品微生物实验室规范指导原则 药品微生物实验室规范指导原则用于指导药品微生物实验室规范指导原则用于指导药品微生物检验实验室的质量控制。药品微生物检验实验室的质量控制。药品微生物的检验结果受到很多因素的影药品微生物的检验结果受到很多因素的影响，如实验人员在取样或试验过程中可能引入响，如实验人员在取样或试验过程中可能引入了污染微生物；微生物学分析方法本身的误差了污染微生物；微生物学分析方法本身的误差较大；样品中或环境中微生物可能分布不均匀较大；样品中或环境中微生物可能分布不均匀等因素均影响药品微生物实验结果。因此，在等因素均影响药品微生物实验结果。因此，在药品检验中，为保证微生物试验数

31、据的可靠性药品检验中，为保证微生物试验数据的可靠性和重现性，药品微生物实验室必须使用经验证和重现性，药品微生物实验室必须使用经验证的检测方法并按良好的实验室规范指导试验。的检测方法并按良好的实验室规范指导试验。药品微生物实验室规范包括药品微生物实验室规范包括以下几个方面：人员、培养基、以下几个方面：人员、培养基、菌种、实验室的布局和运行、设菌种、实验室的布局和运行、设备、文件、实验记录、结果的判备、文件、实验记录、结果的判断等。断等。一、人员一、人员 从事药品微生物试验工作的人员均要受到教从事药品微生物试验工作的人员均要受到教育、培训及具备相关工作的经验。育、培训及具备相关工作的经验。微生物实

32、验人员应具备微生物学或相近专业微生物实验人员应具备微生物学或相近专业知识的教育背景。知识的教育背景。实验室应依据实验人员的岗位及职责对其进实验室应依据实验人员的岗位及职责对其进行相应的培训，在确认他们可以承担某一试验前，行相应的培训，在确认他们可以承担某一试验前，他们不能独立从事该项微生物试验。应保证所有他们不能独立从事该项微生物试验。应保证所有人员在上岗前接受胜任工作所必需的设备操作、人员在上岗前接受胜任工作所必需的设备操作、微生物检验技术和实验室生物安全等方面的培训，微生物检验技术和实验室生物安全等方面的培训，经考核合格后方可上岗，同时，实验室应制定所经考核合格后方可上岗，同时，实验室应制

33、定所有级别实验人员的继续教育计划。有级别实验人员的继续教育计划。微生物实验室管理人员包括工作人员和监督人微生物实验室管理人员包括工作人员和监督人员，其专业技能和经验水平应与他们的职责范围相员，其专业技能和经验水平应与他们的职责范围相符。符。管理人员也应接受系统的教育和微生物实验室管理人员也应接受系统的教育和微生物实验室的培训如：管理技能、实验室安全、试验按排、预的培训如：管理技能、实验室安全、试验按排、预算、实验室研究、实验结果评估和数据偏差的调查算、实验室研究、实验结果评估和数据偏差的调查及技术报告书写等。及技术报告书写等。应熟练的应用应熟练的应用SOP有关内容到管理工作中；如有关内容到管理

34、工作中；如制定不同工作岗位实验人员的培训课程和继续教育制定不同工作岗位实验人员的培训课程和继续教育计划，随时掌握和了解试验人员的水平，根据每个计划，随时掌握和了解试验人员的水平，根据每个人的技术水平分配适宜的工作岗位。人的技术水平分配适宜的工作岗位。对所有人员的培训、考核内容和结果均应记对所有人员的培训、考核内容和结果均应记录。录。二、培养基二、培养基 培养基是绝大多数微生物试验的基础。培养基是绝大多数微生物试验的基础。因此，培养基的质量是微生物试验成功与因此，培养基的质量是微生物试验成功与否的关键因素。适宜的培养基制备方法、否的关键因素。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质

35、培养贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保证。基的保证。培养基的制备：培养基的制备：可按处方制备也可使用按处方生产的可按处方制备也可使用按处方生产的符合规定的商品化成品培养基，脱水培养符合规定的商品化成品培养基，脱水培养基除附有处方和使用说明外还应注明有效基除附有处方和使用说明外还应注明有效期、贮存条件、适用性试验的质控菌株和期、贮存条件、适用性试验的质控菌株和用途。配制时应按使用说明上的要求操作，用途。配制时应按使用说明上的要求操作，受潮结块不能使用，以确保培养基的质量受潮结块不能使用，以确保培养基的质量符合要求。符合要求。配制培养基使用的容器应是玻璃器皿或搪配制培养基使用的容器应是玻璃

36、器皿或搪瓷器皿如搪瓷筒、量筒、漏斗、三角烧瓶、刻瓷器皿如搪瓷筒、量筒、漏斗、三角烧瓶、刻度吸管、试管、培养皿等。使用度吸管、试管、培养皿等。使用的器皿应的器皿应 洗洗净，用蒸馏水冲净，烘干后方可使用。净，用蒸馏水冲净，烘干后方可使用。禁用金禁用金属容器如铁、铜、铝容器，避免金属离子与培属容器如铁、铜、铝容器，避免金属离子与培养基成分结合，生成有害物质，影响细菌生长养基成分结合，生成有害物质，影响细菌生长。配制培养基最常用的溶剂是纯化水，特殊配制培养基最常用的溶剂是纯化水，特殊情况下需要用去离子水和蒸馏水，对热敏感的情况下需要用去离子水和蒸馏水，对热敏感的培养基应用灭菌水和无菌容器配制与分装，配

37、培养基应用灭菌水和无菌容器配制与分装，配制时若需加热助溶应注意温度不要过高。制时若需加热助溶应注意温度不要过高。配制培养基必须矫正配制培养基必须矫正pH，干燥培养基也必须，干燥培养基也必须对对pH进行验证，高压灭菌前的进行验证，高压灭菌前的pH应比最终应比最终pH高高0.2左右。左右。配制好的培养基应按照生产商提供或使用者验配制好的培养基应按照生产商提供或使用者验证的参数进行灭菌。商品化的成品培养基必须附证的参数进行灭菌。商品化的成品培养基必须附有所用灭菌方法的资料，培养基灭菌一般采用湿有所用灭菌方法的资料，培养基灭菌一般采用湿热灭菌技术热灭菌技术,特殊培养基可采用薄膜过滤除菌。特殊培养基可采

38、用薄膜过滤除菌。对配制培养基的过程作详细的记录，记录内容对配制培养基的过程作详细的记录，记录内容包括：配制日期、培养基名称、成分、配制数量、包括：配制日期、培养基名称、成分、配制数量、灭菌条件、质量监控结果等进行全面详细记录。灭菌条件、质量监控结果等进行全面详细记录。（2）培养基的贮藏）培养基的贮藏 商品化培养基应根据使用说明书上的要商品化培养基应根据使用说明书上的要求进行储存。培养基标签上应标有批号，生求进行储存。培养基标签上应标有批号，生产日期、有效期及培养基的有关特性。所采产日期、有效期及培养基的有关特性。所采用的保藏和运输条件应使培养基最低限度失用的保藏和运输条件应使培养基最低限度失去

39、水分并提供机械保护。去水分并提供机械保护。配制好的培养基应保存在避光的环境。若配制好的培养基应保存在避光的环境。若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般在一年内使用，若保存于密闭容器中，一般在一年内使用，琼脂培养基不得在琼脂培养基不得在0或或0以下存放，防止以下存放，防止冷冻破坏凝胶特性。若培养基要长期保存，冷冻破坏凝胶特性。若培养基要长期保存，琼脂平板应密闭包装或置于密闭容器中以防琼脂平板应密闭包装或置于密闭容器中以防止水分流失。止水分流失。培养基灭菌后应立即取出，不得储藏培养基灭菌后应立即取出，不得储藏在高压灭菌器中，避免影响培

40、养基的质量。在高压灭菌器中，避免影响培养基的质量。固体培养基灭菌后的再融化应在加热固体培养基灭菌后的再融化应在加热的水浴中或采用流通蒸汽进行，只允许一的水浴中或采用流通蒸汽进行，只允许一次，融化的培养基应放在次，融化的培养基应放在4550的水浴的水浴中，不得超过中，不得超过8小时。小时。（3）培养基的质量控制）培养基的质量控制 所有配制好的培养基均应进行验证，验证所有配制好的培养基均应进行验证，验证方法参照方法参照中国药典中国药典2010年版年版附录无菌检查附录无菌检查或微生物限度检查项下有关规定进行。实验室或微生物限度检查项下有关规定进行。实验室配制的培养基的常规监控项目是外观、性状、配制的

41、培养基的常规监控项目是外观、性状、pH、促生长试验、定期的稳定性检查以及培、促生长试验、定期的稳定性检查以及培养基有效期的确定。养基有效期的确定。在实验室中，由同一批脱水培养基配制培在实验室中，由同一批脱水培养基配制培养基时，若采用已验证的配制和灭菌程序，那养基时，若采用已验证的配制和灭菌程序，那么可不进行批批促生长试验。如果培养基制备么可不进行批批促生长试验。如果培养基制备的方法未经验证，那么，配制的每一批培养基的方法未经验证，那么，配制的每一批培养基必须进行促生长试验。必须进行促生长试验。用于环境监控的培养基应特别小心防用于环境监控的培养基应特别小心防护。尤其是用于关键区域监控的培养基最护

42、。尤其是用于关键区域监控的培养基最好要双层包装和终端灭菌，如果不能采用好要双层包装和终端灭菌，如果不能采用终端灭菌的培养基，那么在使用前应进行终端灭菌的培养基，那么在使用前应进行100%的预培养。这样是为了防止将外来的的预培养。这样是为了防止将外来的污染带到环境中及避免出现假阳性结果。污染带到环境中及避免出现假阳性结果。无菌检查用培养基无菌检查用培养基 使用前应进行适用使用前应进行适用性试验，适用性试验包括无菌性检查和灵性试验，适用性试验包括无菌性检查和灵敏度检查，无菌性试验是检查培养基灭菌敏度检查，无菌性试验是检查培养基灭菌是否完全，灵敏度检查是确定培养基的质是否完全，灵敏度检查是确定培养基

43、的质量好坏、稳定与否，这对检验结果有极为量好坏、稳定与否，这对检验结果有极为重要的影响。重要的影响。微生物限度检查培养基微生物限度检查培养基 使用前应进行使用前应进行适用性试验，适用性试验包括促生长、抑适用性试验，适用性试验包括促生长、抑制及指示能力检查。制及指示能力检查。琼脂斜面低温保藏法琼脂斜面低温保藏法 菌种的传代和使用菌种的传代和使用 工作菌种的传代次数应严格控制，不得工作菌种的传代次数应严格控制，不得超过超过5代，（从菌种保藏中心获得的标准代，（从菌种保藏中心获得的标准菌株为第菌株为第0代）防止过度的传代造成菌种代）防止过度的传代造成菌种变异。变异。1代是指将活的培养物接种到新鲜代是

44、指将活的培养物接种到新鲜培养基中，任何亚培养的形式均被认为是培养基中，任何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次。必要时，实验室应对工转种或传代一次。必要时，实验室应对工作菌株的特性和纯度进行确认。作菌株的特性和纯度进行确认。实验室必须建立菌种保存和使用文件化实验室必须建立菌种保存和使用文件化的程序管理制度；的程序管理制度；包括：每支菌种标注名称、标包括：每支菌种标注名称、标准号、接种日期、传代次数、进出、收集、贮藏、准号、接种日期、传代次数、进出、收集、贮藏、保存、确认试验以及销毁的记录、标准菌种的申保存、确认试验以及销毁的记录、标准菌种的申购记录、从标准菌株到工作菌株操作记录，如菌购记录、从

45、标准菌株到工作菌株操作记录，如菌种定期转种传代，鉴定（纯度、特性）、培养基种定期转种传代，鉴定（纯度、特性）、培养基和培养条件、菌种保存的位置和条件及其它需要和培养条件、菌种保存的位置和条件及其它需要的程序。的程序。四、实验室的布局和运行四、实验室的布局和运行 微生物实验室的规划和设计应充分考虑到微生物操微生物实验室的规划和设计应充分考虑到微生物操作规范和实验室安全操作的要求，应具有进行微生物作规范和实验室安全操作的要求，应具有进行微生物检测所需的适宜环境和设施，其中最重要的是尽最大检测所需的适宜环境和设施，其中最重要的是尽最大可能防止微生物对环境、人员、样本造成污染和危害。可能防止微生物对环

46、境、人员、样本造成污染和危害。合理的规划及活动区域的划分将提高微生物实验室操合理的规划及活动区域的划分将提高微生物实验室操作的可靠性。作的可靠性。无菌室应远离交通干道、厕所及污染区，应选上、无菌室应远离交通干道、厕所及污染区，应选上、下水道及其他安装适宜的位置。无菌室的配套设施包下水道及其他安装适宜的位置。无菌室的配套设施包括洗刷、培养基配制、消毒灭菌、灭菌物品存放和传括洗刷、培养基配制、消毒灭菌、灭菌物品存放和传输、培养间、结果观察、试验菌实验和办公室等，要输、培养间、结果观察、试验菌实验和办公室等，要集中，减少污染，便于管理和使用。集中，减少污染，便于管理和使用。通常，实验室应划分成洁净区

47、、无菌区和培养通常，实验室应划分成洁净区、无菌区和培养区等，无菌区域应与培养区完全分开。否则应采用区等，无菌区域应与培养区完全分开。否则应采用其它屏障和无菌技术来减少偶然污染的可能性。这其它屏障和无菌技术来减少偶然污染的可能性。这些屏障包括防护服、卫生处理和消毒措施及采用隔些屏障包括防护服、卫生处理和消毒措施及采用隔离器技术生物安全柜。微生物检验的实验室应符合离器技术生物安全柜。微生物检验的实验室应符合中国药典中国药典无菌检查、微生物限度检查试验环境无菌检查、微生物限度检查试验环境的要求，无菌检查、微生物限度检查、无菌采样等的要求，无菌检查、微生物限度检查、无菌采样等应有独立设置的洁净室（区）

48、或隔离系统，并配备应有独立设置的洁净室（区）或隔离系统，并配备相应的细菌（真菌）实验室、培养室、培养基及实相应的细菌（真菌）实验室、培养室、培养基及实验用具准备（包括灭菌）区、样品接收和储藏区、验用具准备（包括灭菌）区、样品接收和储藏区、标准菌株储藏区、污染物处理区和文档处理区等辅标准菌株储藏区、污染物处理区和文档处理区等辅助区域，同时，应对上述区域明确标识。助区域，同时，应对上述区域明确标识。实验室对所用的消毒剂应定期更换，使用的消毒剂应无菌。污染微生物的样品，需进一步分析鉴定，均应在阳性菌实验室进行。被检样品应有传递、储存、处置和识别管理程序。待验样品应在合适的条件下储存并能够，应明确规定

49、和记录储存条件。实验室应有妥善处理废弃样品和有害废弃物的设施和制度，对疑似于带菌培养物溢出的意外事件应制定处理规程。五、设备 实验室应配备与检验能力和工作量相适应的仪器设备，其种类和型号、测量范围和准确度等应满足检验的要求，设备的安装和布局应便于操作，易于维护、清洁和校准。实验室应建立完整的仪器设备管理制度,包括新进仪器设备的验收；如仪器设备的检定、校准、验证、确认其性能，并形成相应的操作、维护和保养的标准操作规程后方可正式使用。为保证设备处于良好工作状态，应定期维护和期间核查，并保存相关记录。重要的仪器设备，应由专人负责，保证其运行状态正常和受控，同时应有相应的备用设备以保证试验菌株和微生物

50、培养的连续性；对于培养箱、冰箱、高压灭菌锅等影响实验准确性的关键设备应在其运行过程中对关键参数（如温度、压力）进行连续观测和记录（有条件的情况下尽量使用自动记录装置），如果发生偏差，应评估对以前的检测结果造成的影响并采取必要的纠正措施。对于一些容易污染微生物的仪器设备如水浴锅、培养箱、冰箱和生物安全柜等应定期进行清洁和消毒。对试验需用的无菌器具应有明确标识，实施正确的清洗、灭菌措施，并形成相应的标准操作规程 六、文件 保证检测质量是任何实验室管理中的核心。每一个进行检验的实验室必须建立并遵守质量保证（QA）的政策和程序，用所建立的QA政策和程序来监测和评价整个检验过程。所有QA活动都必须文件化

51、。七、记录 正确的试验研究和实验记录是微生物试验成功的关键。要使实验结果可信最基本的原则是试验应按SOP规定的内容进行操作；如正确的试验操作、完整的实验记录，以便确认数据的完整性。实验记录至少应包括以下内容：编号、实验日期、实验材料、操作程序、实验结果、误差、文件参数（使用的设备、菌种、培养基），每一个关键的实验设备的校准过程及设备维护均需记录，如设备温度（水浴，培养箱，灭菌器）、检验依据、实验人员签名、复核人签名、管理人员签名。必须记录和监测。为保证实验记录的真实性，实验记录应是原始记录，用签字笔或蓝黑墨水记录，当记录出现错误时，不得抹去或被覆盖，应用单线划线并签字。所有的实验数据都要登记、

52、存档。八、结果的判断 一、影响试验结果的因素 药品微生物检验较为特殊，因是活微生物，受到外界影响因素较，因此检验结果分析比较困难，其影响因素有以下几方面：1、微生物在自然界中普遍存在。2、实验人员在样品处理过程或其它操作步骤可能受微生物污染。3、微生物在样品或环境中分布不均匀等。以上原因造成试验结果的误差大和重现性差，因此，在试验时应尽最大程度的避免外来的污染。应对实验结果进行全面分析，如果实验结果不符合标准规定，应立即通知实验室管理人员，组织进行原因调查分析。分析内容包括：实验室环境 抽样区的防护条件 样品本身是否具有影响微生物存活或繁殖的成分和作用 实验操作是否规范 以上都是评价实验结果真

53、实性的重要依据。如果依据分析调查结果发现，试验全过程如果依据分析调查结果发现，试验全过程中任何一个环节有错误，可判实验结果无效，中任何一个环节有错误，可判实验结果无效，那么应重新制定实验方案，按照正确的方案那么应重新制定实验方案，按照正确的方案进行实验，在这种情况下，应特别认真对试进行实验，在这种情况下，应特别认真对试验过程及正确的试验操作进行监控，实验室验过程及正确的试验操作进行监控，实验室必须认可复试程序，如果需要，重新抽样，必须认可复试程序，如果需要，重新抽样，但抽样方法不能影响不符合规定结果的分析但抽样方法不能影响不符合规定结果的分析调查，这种情况必须详细记录。调查，这种情况必须详细记录。谢谢！