分子生物学课件第16讲

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1、NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity三、阻遏蛋白与操作子的相互作用三、阻遏蛋白与操作子的相互作用1，lacI基因的表达特点2，lac操作子（lacO）与阻遏蛋白的结合（1）阻遏蛋白与lacO结合的实验证据NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity（2）lacO与阻遏蛋白结合的位点及其结构A，DNA内切核酸酶消化实验证明：受阻遏蛋白保护区域位于-5 +21(26bp)B，阻遏蛋白保护位点C，lacO 的结构及其与阻遏蛋白的结合性质NanjingNanjingNanjing

2、UniversityUniversityUniversityNanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity3，阻遏蛋白对RNA聚合酶功能的影响（1）阻遏蛋白和RNA聚合酶可同时与DNA结合（2）阻遏蛋白与DNA的结合能增强RNA聚合酶结合启动子的能力（RNA聚合酶与的平衡常数从1.9*107增加到2.5*109）NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity（3）阻遏蛋白有效地使RNA聚合酶与lac启动子上形成一个很强的关闭式的转录起始复合物，阻止转录的起始（4）阻遏蛋白的这种作用对

3、操纵元的诱导也有促进意4，上述模式不一定适用于其他系NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity1，阻遏蛋白单体的结构NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity2，阻遏蛋白四聚体的结构3，阻遏蛋白与操作子的结合4，阻遏蛋白需要组成四聚体才能实现完全的阻遏作用（1）lac系统存在多个操作子（2）阻遏蛋白四聚体可以同时与两个操作子结合（3）阻遏蛋白结合第二个操作子影响阻遏的水平NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversityNa

4、njingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversityNanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversityNanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversityNanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversityNanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversityNanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniver

5、sityNanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversityNanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversityNanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversityNanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversityNanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversityNanjingNanjingNanjingUniversityUniversity

6、UniversityNanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversityNanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity调控形式（一）半乳糖代谢1，半乳糖代谢相关的酶（1）半乳糖激酶（2）半乳糖转移酶（3）半乳糖表异构酶NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity2，代谢步骤（1）半乳糖+ATP 半乳糖1-磷酸+ADP+H（2）半乳糖1-磷酸+UDPGlu UDPGal+葡萄糖1-磷酸（3）UDPGal UDPGlu 总反应：半乳糖+

7、ATP 葡萄糖1-磷酸+ADP+H半乳糖激酶半乳糖转移酶半乳糖表异构酶NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity（二）gal操纵元1，gal操纵元组成（1）结构基因（galK，galT，galE）（2）调节基因（galR）与结构基因相距很远 诱导物：半乳糖 galR突变：造成组成型表达（3）P/O位点 galOC突变：造成组成型表达NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity2 2，galgal操纵元的启动子操纵元的启动子（图（图8 89 9）（1 1）gal P1gal P1

8、 转录起始位置：转录起始位置：S1S1（+1+1）转录依赖转录依赖cAMP-CAPcAMP-CAP 功能：葡萄糖不存在时负责功能：葡萄糖不存在时负责galgal操纵元操纵元的转录的转录（2 2）gal P2gal P2 转录起始位置：转录起始位置：S2S2（-5-5）转录不依赖转录不依赖cAMP-CAPcAMP-CAP 功能：葡萄糖存在时负责功能：葡萄糖存在时负责galgal操纵元的操纵元的转录转录NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity（三）（三）cAMP-CAPcAMP-CAP对对galP1galP1和和gal gal P2P2

9、的控制的控制1 1，galgal启动子的启动子的cAMP-CAPcAMP-CAP结合位结合位点点（1 1）位置：）位置：-76-76-47-47（2 2）序列特点（图）序列特点（图8 81010）具有保守性和对称性具有保守性和对称性NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity2 2，cAMP-CAPcAMP-CAP对对S1S1转录的激活转录的激活及对及对S2S2转录的阻遏转录的阻遏对对galP1galP1：有激活作用：有激活作用对对galP2galP2：cAMP-CAPcAMP-CAP结合位结合位点离点离galP2galP2较近，妨碍较

10、近，妨碍RNARNA聚聚合酶与合酶与galP2galP2的结合的结合NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity（四）Gal阻遏蛋白的作用机制1，gal阻遏蛋白的作用位点galOE：位于-60左右galOI：与gal OE相距90bpNanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity2，gal阻遏蛋白可能的作用机制（1）gal阻遏蛋白与galOE结合，可能通过以下途径发挥作用：妨碍了cAMP-CAP与其位点的结合或改变cAMP-CAP对转录的促进作用NanjingNanjingNanj

11、ingUniversityUniversityUniversity（）gal阻遏蛋白与galOI结合可能导致两个操作子之间的DNA形成环状结构，两个阻遏蛋白通过相互作用而强化了阻遏效应NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity（五）gal操纵元双启动子的意义1，半乳糖的双重作用（1）作为细菌的碳源（2）UDPGal是细菌细胞壁的重要前体2，双启动子的作用（1）galP1保证细菌可以利用半乳糖作为碳源（2）galP2保证有葡萄糖存在时，细菌可以合成UDPGalNanjingNanjingNanjingUniversityUniversi

12、tyUniversity二、阿拉伯糖操纵元：具有双重功能（正调控和负调控）的调节蛋白(一)阿拉伯糖代谢酶基因的操纵元1，阿拉伯糖调控元NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity（1）三个参与阿拉伯糖代谢的酶的基因的操纵元ara BADaraE，araFG：E，F，G编码膜结合蛋白，与阿拉伯糖的结合与转运有关调节基因：araC（2）调控元：由一个调节基因控制几个操纵元的系统NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity2，araBAD操纵元的组成（1）结构基因araB：编码L-核酮

13、糖激酶araA：编码L-阿拉伯糖异构酶araD：编码L-核酮糖-5-磷酸-表异构酶NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity（2）操纵元结构（图8-11）araC及araBAD各有启动子，但转录方向相反NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity（二）araBAD操纵元的调控NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity1，araC基因产物及其结合位点（1）araC基因对araBAD正调控的遗传学证据（2）AraC蛋白的2

14、种形式Crep：未结合阿拉伯糖的AraC蛋白Cind：结合阿拉伯糖的AraC蛋白NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity（3）AraC结合位点araO1(-110-140)：与araPC重叠araO2(-265-294)araI(-40-78)：下游与RNA聚合酶结合位点紧密相连，上游与CAMP-CAP结合位点（-107-78）紧密相连NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity2，对araBAD操纵元起调控作用的因素（1）Crep 对araBAD 及araC的作用A，Cre

15、p 与araO1结合有效阻遏araC基因的转录对araBAD有轻微的阻遏NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversityB，Crep 与araO2结合 与araO2结合的Crep 通过与结合在启动子上的其他蛋白质发生相互作用，实现对araBAD的有效阻遏。两种蛋白质之间的DNA形成环状结构，其间插入非螺旋整倍数目的核苷酸将改变两种蛋白质在DNA双螺旋侧面上的位置关系，从而降低阻遏效率 Crep 二聚体同时结合araO2和araI，实现对araBAD的有效阻遏NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityU

16、niversity（2）Cind对araBAD 及araC的作用Cind与araI结合激活araBAD基因的转录Cind与araO1结合阻遏araC基因的转录（3）cAMP-CAP是araBAD和araC表达的正调控因子NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity3，araBAD操纵元的调控（图812）（1）无AraC及cAMP-CAP时，araC转录，但很快会被Crep所阻遏（自身调控）（2）有AraC，无cAMP-CAP时，araBAD和araC均不转录（3）有AraC，阿拉伯糖及cAMP-CAP时，araBAD转录（4）Cind

17、和cAMP-CAP促进araBAD转录的机制 促进RNA聚合酶与araBAD的结合并形成开放性启动子复合物NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity 三、色氨酸操纵元：可阻遏系统（一）trp操纵元的结构1，结构基因及其编码的酶 trpE，trpD：编码邻氨基苯甲酸合成酶的2个亚基，各为60KD trpC：编码吲哚甘油磷酸合成酶，分子量为45KD trpB，trpA：编码色氨酸合成酶的亚基（50KD）和亚基（29KD）NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity2，前导序列 tr

18、pO与trpE之间有一段162bp的序列可以转录到mRNA中3，终止子 在trpA基因下游36bp处有一个不依赖于因子的终止子t 在t的下游250bp处有一个依赖于因子的终止子t4，调节基因 调节基因trpR与Trp操纵元相距较远，编码阻遏蛋白NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity（二）Trp操纵元的阻遏调控1，Trp的作用Trp有两方面的作用（1）对 已 有 的 酶 起 反 馈 抑 制（feedback inhibition）（2）作为trp无活性的阻遏蛋白的辅阻遏物NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity2，TrpR的作用（1）TrpR的活性形式TrpR单体：12.5KDTrpR活性形式:四聚体Trp与Trp结合后才能与trpO结合NanjingNanjingNanjingUniversityUniversityUniversity（2）TrpR的作用机制trpP范围（-40+18）trpO范围（-21+1）TrpR作用机制：trpO 位于trpP内，活性TrpR与trpO的结合完全排斥了RNA聚合酶的结合