蛋白分离的缓冲液系统比较

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1、解离/非解离native缓冲液系统 很多应用蛋白质聚丙烯酰胺凝胶区带电泳（zone electrophoresis）的研究使用 一种缓冲液系统，该系统的设计把所有的蛋白质分解成单一多肽亚单位。最常用 的解离试剂是十二烷基硫酸钠（SDS）, 种离子型去污剂，它通过包围在多肽骨 架的周围变性蛋白质。在包含有过量的SDS和巯基试剂的蛋白质样品，100C加 热时，二硫键被打开，蛋白质完全解离成它的亚单位。在这些情况下，大部分的 多肽以一个恒定的重量比率（1.4gSDS:lg多肽）结合多肽。与去污剂所提供的 负电荷相比较，多肽固有的电荷变得微不足到。因而，根据多肽的大小，相同大 小的SDS-多肽复合物基

2、本上具有相同的负电荷、形状和凝胶中的迁移率。这种 方法简洁而快速，加之只需要微克量蛋白这一事实，使SDS-PAGE成为最广泛使 用的，用来确定多肽样品分子量的方法。由于几乎任何来源的蛋白质很容易被 SDS溶解，所以这种方法通常都可以适用。与之相反，用来进行非解离native电泳的非解离native缓冲液系统，则设计用 来分离蛋白质混合物，而亚单位之间的相互作用、蛋白质构象和生物学活性被保 留。在非解离native缓冲液系统中，蛋白质的分离基于它们的荷/质比率。连续缓冲液系统在连续缓冲液系统中，凝胶的缓冲液和电泳缓冲液的组成基本上是相同的。它们 由单一的分离胶组成，而且全部的样品、胶和电极槽使用

3、相同pH的同样的缓冲 液离子。在连续缓冲液系统中，分子电荷密度和胶孔大小是仅有的影响分子的堆积和条带 的锐度的因素，。使用连续系统时，蛋白质在样品孔中比在凝胶中移动的速度更 快。在缓冲液和分离胶的交界面，分子移动减慢，样品浓缩条带形成。这种浓缩 的方法有一定的局限，尤其是分离的分子在大小上变化较大。小分子在溶液中运 动和在凝胶中的运动没有太大的差别，因而在锐度方面不如对于大分子有利。不连续缓冲液系统不连续缓冲液系统，凝胶和电极槽中使用不同的缓冲离子和pH值，将样品加入 到位于小孔分离胶的上面、非限制的大孔胶中，该胶称为浓缩胶。不连续缓冲液系统的主要优势在于，相对较大体积的稀释的样品可以应用到胶

4、 中，而且分辨率也比连续液系统获得的要高。蛋白质在通过大孔的浓缩胶时，浓 缩或堆积成狭窄的条带：在小孔的分离胶中和给定的条件下，去堆积或分离，直 接的结果是分辨率的增高。Ornsten和Davis描述的通过不连续系统产生细的起 始条带（1，2）。离子的迁移和蛋白的堆积 离子的迁移依赖于分子电荷的密度和电压梯度，在给定的pH值下，只有一部分 蛋白会被分离，这些分子的移动将取决于有效迁移和电压梯度，因而，如果电压 和有效迁移的乘积相等，移动慢的离子可以象移动快的离子移动的一样快。在Ornsten和Davis系统，样品和堆积胶包含Tris-HCl缓冲液，而上电极槽包 含Tris-Glycine缓冲液

5、。在样品缓冲液和堆积胶的pH值（pH6.7）时，Glycine 弱离子化，因而移动较慢。Chloride完全离子化，具有较高的迁移率，而蛋白 的迁移介于甘氨酸和氯离子之间。一旦加以电压，氯离子（先导）离子迁移离开 甘氨酸（尾随）离子，产生一个低电导、高电压梯度和高pH区带。这个区带加 速了甘氨酸的迁移，以使它跟上氯离子。随着甘氨酸/氯离子边界移动通过样品 和堆积胶，前面的蛋白迅速地被快速迁移的氯离子超过，在正在移动界限的后面， 蛋白比甘氨酸移动速度快，因此，移动的边界处理这些蛋白，有序地浓缩它们到 移动减慢的薄区带。一旦蛋白质被堆积后什么会发生？ 首先，堆积蛋白可能跟在移动界面或染料前沿后面，

6、通过低浓度胶，保持堆积或 不分离。第二，蛋白可能从移动界面去堆积或分离。Ornstein和Davis描述了 两种不同的去堆积的方法。去堆积能够被完成通过：a堆积形成后减慢蛋白的移 动速度，或b 旦蛋白已经被堆积，加速后随离子的泳动速度。第一种方法，在较高浓度的分离胶上制备低浓度的分离胶，当堆积蛋白进入高浓 度分离胶中，它的移动减慢，因而要比甘氨酸离子移动速率慢。一旦这种情况发 生，蛋白摆脱堆积作用，可以在相同的、较低的、局部的电场力作用下移动，就 象在连续胶中一样。第二种去堆积的方式是改变pH值，从而加快尾随离子的移动速度。对于甘氨酸 /氯系统，浓缩胶制备时，甘氨酸区带要调整到比分离胶低的pH

7、值。当甘氨酸进 入到高pH值的分离胶时，它的净负电荷将增加它的有效移动。结果，甘氨酸开 始赶超一些蛋白，最后直接跟在氯离子的后面移动，从而引起蛋白的分离。Ornstein和Davis通过在Tris-chlorde/Tris-glycine不连续缓冲系统中，用 pH值为6.8的低浓度浓缩胶覆盖pH值为8.8的高浓度分离胶，合并了这两种去 堆积的方法。以后Laemmli应用这种系统到SDS蛋白电泳，基本上保持了相同的 特点（3）。堆积和pH值在SDS PAGE系统的相对的重要性我们经常被问到，是否Novex预制胶有浓缩胶，如果有，pH是多少。答案是肯 定的，有浓缩胶（Novex, Tris-gly

8、cine，和Trince胶），但是浓缩胶和分离胶 之间的pH值相同。pH值的变化依赖于胶的成分。请参看每一个产品以确定pH 值。在应用中发现，与SDS系统中离子种类的不一致相比较，pH值的不一致在浓缩 蛋白时具有较小的作用。在Laemmli系统，尽管浓缩胶的6.8的pH值对堆积系统有一个额外的促进作用，但是实际上堆积SDS/蛋白复合物并不需要。甚至在Laemmli系统分离胶的pH值(8.8)时，甘氨酸的泳动速度是足够慢，大 约小于70kDa的蛋白在4%的胶中堆积，类似于在pH值6.8的浓缩胶中的堆积。 应该注意到Ornstein和Davis的系统最初形成是用来分离native蛋白。他们发 现有

9、效的堆积这些蛋白中的一些需要一个低pH值的浓缩胶。然而SDS结合蛋白 与native蛋白相比有一个更大的负电荷密度，结果甘氨酸的泳动速度是足够慢， 即使浓缩胶配制成与分离胶相同的pH值，也能在甘氨酸区带的前缘堆积SDS结 合蛋白。70kDa大小的蛋白会在pH值8.6-8.8的4%的胶和在pH值6.8-7.2的 4%的胶中保持相同的堆积。较大的蛋白也将被分离成单独的条带。堆积发生在游离样品溶液和浓缩胶之间的 界面，增加了教大蛋白条带的锐度，尽管小蛋白和大蛋白在游离溶液中移动相同， 但是当大蛋白接触到浓缩胶，它们的速度比小蛋白减慢的多，因而被有效的浓缩。 使用典型的上样体积，浓缩效应产生覆盖全部范

10、围的区带，这些区带与使用pH 值6.8浓缩胶获得的区带有同样的锐度。References:1 Ornstein,L.(1964) Ann.NY Acad.Sci.,121:3212 Davis,B.J.(1964) Ann.NY Acad.Sci.,121:4043 Laemmmli,U.K.(1970) Nature 227:680-685不连续缓冲系统的比较在电泳开始的时候，SDS-PAGE利用不连续系统，在浓缩胶中浓缩或堆积样品， 使其成为一条非常锐利的区带。在不连续缓冲系统中，最初胶中的阴离子不同于(或不连续)电泳缓冲液中开始时的阴离子。NuPAGE?系统(Bis-Tris和 Tris

11、-Acetate)和Laemmli(Tris-Glycine)系统二者均为不连续系统的例证，以 相同的方式起作用。但是，作为NuPAGE ?系统中不同离子的结果，这个系统在一 个较低的pH值下工作。Tris-Glycine系统(图1)的情况，主要包括三种离子：a) 氯(-)，由胶缓冲液提供，由于相对于系统中其它的阴离子，阳极对它具有 最高的吸引，因而充当先导离子。b) 甘氨酸(-)，电泳缓冲液提供的主要的阴离子，由于在一个带电的环境中，它 仅仅部分带有负电荷，并且保持在带有更高电荷的氯离子的后面，充当后随离子。c) Tris碱( + )，出现在胶和电泳缓冲液中的共同的离子，在电泳时,Tris-

12、Glycine 系统中凝胶和缓冲液的离子形成了胶分离区域的9.5的工作pH值。图 1 Tris-Glycine Systemi rafflr 卩叩OTIJN切卡 COUfl&M tS/nciiaJ AvtBtfKfT T PROGRE：*HOFftJN T T Tpreenhn Mr gm I and ruriii-lng bult?rCcnimon I cm K Tlfc Gel Butter luns jr iris1 LpH -571 Running BuiIet tons jtp Tris 1 , Gly jnd SDS ftiH 临 CelpH 11 9.5NuPAGE Bis-Tr

13、is系统（图2）的情况，主要包括三种离子：a）氯（-），由胶缓冲液提供，充当快速移动的先导离子。b）MES或MOPS（-）,（取决于电泳缓冲液的选择）充当后随离子。MES: 2-（N-morpholino） ethane sulfonic acidMOPS: 3-（N-morpholino） propane sulfonic acidc）Bis-Tris碱（+）充当出现在胶中的共同离子，Tris （ + ）由电泳缓冲液提供。合并低pH值的胶缓冲液（pH6.4）和电泳缓冲液（pH7.3-7.7）导致了电泳时显 著降低的工作pH值。朮醐些fauJFki TFIM D5 f V.ILE iitoct

14、oEMJCtiWAIQEtletrtNng ioniT V T rROQRES&fQNFflM V V T 匚 WT1110fl ICII KEK-tTK V V T(recent In 甘悼 gwl Gel &tffer om0 is-ms Cl (pH 6.4j Running Buffer Io nsp Tru . MES orMDF5 artlSDS pH 7JJ Cffl Ops aiw pH i“ .ONuPAGE Tris-Acetate系统（图3）的情况，主要包括三种离子:a）Acetate （-），来自于凝胶缓冲液先导离子。b）Tricine（-），来自于电泳缓冲液的后随离子

15、。c）Tris（ +），共同离子（凝胶和电泳缓冲液）。这个系统也在一个比Tris-Glycine系统显著低的pH值下运行。下图总结了每一个系统的浓缩胶的迁移差别。TRI匚 IMGPRCiTBINJHJ S CCPL EX 住扫tWiRrtl!耐屈T T PROGRESSION OF HUN T conifiiCin rwi K rr昌T pT：nl in hpqpl Judmnnim tmnr Col buffer loll； J TP TtlS 1 , ACiMJtQ (pW 7 0)* Runnin& Buffer Ions dr? Ins11 Innfip jndSDSpHB,i) Go

16、】 Operating pH Ls 3.1不同缓冲系统的分子量标准的精确校准通常，SDS胶中蛋白的迁移是处于完全变性状态下蛋白长度的函数（1）。通过 与已知分子量大小的蛋白标准的标准曲线比较，根据样品蛋白的相对移动来推断 它的分子量。但是，当在不同的SDS-PAGE缓冲液系统进行电泳时，相同的分子 量标准可能有轻微不同的迁移，因而导致明显不同的分子量差别。二级结构的作用使用SDS-PAGE进行分子量校准，与一个蛋白的真实的分子量（绝对的校准来自 于已知的氨基酸序列）的轻微的偏离可能发生，主要是由于保留的不同程度的蛋 白的二级结构，即使是存在SDS。在具有高度组织的二级结构的蛋白（例如胶原 蛋白

17、，组蛋白，或咼度疏水的膜蛋白）和相对于肽总的大小，局部二级结构的效 应变得扩大的多肽，这种现象变得更加普遍（2）。pH值的影响当相同的蛋白在不同的SDS-PAGE缓冲系统进行电泳时，也可以观察到蛋白迁移 的轻微差别的发生（2）。每一个SDS PAGE缓冲系统具有不同的pH值，这将影 响蛋白的电荷量和结合SDS的能力。尽管天然蛋白迁移的改变通常很小，但是 非典型或者化学修饰的蛋白，如预染的标准，变化很显著。蛋白移动的例证 有例证表明，当MulitiMark Muli-Colored标准，在Tris-Glycine胶上电泳 时，与在NuPAGE Novex Bis-tris胶上，使用MES SDS

18、或者MOPS SDS电泳缓 冲液比较,发生了蛋白迁移改变的情形。与Tris-Glycine系统比较,MulitiMark 标准在NuPAGE Novex Bis-tris缓冲系统中两个肌红蛋白(myoglobin)(红和 蓝)位置颠倒。这一现象可以通过应用在NuPAGE系统电泳的MulitiMark标准 再次计算值来解决。计算和指示的分子量当前Novex分子量标准提供的表观分子量值来源于在Tris-Glycine SDS-PAGE 系统。我们已经计算和指示了在几种电泳胶/缓冲系统中 Novex pre-stained markers的表观分子量，包括Novex Tricine胶系统和NuPAG

19、E Novex系统。 记住要使用与你的凝胶匹配的分子量，以最精确地校准你的目的蛋白。你也可以 在你的实验室使用选择的缓冲系统用作Novex?标准作标准曲线。批与批之间分子量一致性需要记住的重要一点是，假说凝胶使用相同的缓冲系统，invitrogen生产的所 有的标准，从一个批号到另一个批号，从一块胶到另一块胶，经过严格质量控制 以达到的迁移一致。参考文献1. Rodbard, D.(1976) meth.PROTEIN se2: 145-128.paration2. Patton,W.F.et al(1991)Anal. Biochemistry， 200：25-30.3. Wyckoff,M.et al. (1977)Anal. Biochem. 78：459-482.