激光扫描共聚焦显微镜技术课件

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1、激光扫描共聚焦显微镜技术激光扫描共聚焦显微镜技术Medicago（苜蓿）cross section of a stem showing ligninlignin（木质素）（木质素）autofluorescenceautofluorescence in blue and chloroplast autofluorescence in red.This image was taken with the Leica AOBS confocal microscope 主要内容主要内容 激光扫描共聚焦显微镜技术（激光扫描共聚焦显微镜技术（Laser scanning Confocal Laser sca

2、nning Confocal MicroscopyMicroscopy，简称，简称LSCMLSCM）是近代生物医学图象仪器的最重）是近代生物医学图象仪器的最重要发展之一，它是在要发展之一，它是在荧光显微镜荧光显微镜成象的基础上成象的基础上加装激光扫加装激光扫描装置描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图象处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光进行图象处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，以及在亚细胞水平上观察诸如图象，以及在亚细胞水平上观察诸如CaCa2+2+、pHpH值、膜电位值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。等生

3、理信号及细胞形态的变化。广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、组织广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、组织胚胎学、免疫学和神经生物学等领域，对生物样品进行定胚胎学、免疫学和神经生物学等领域，对生物样品进行定性、定量、定时和定位研究具有很大的优越性，为这些领性、定量、定时和定位研究具有很大的优越性，为这些领域新一代强有力的研究工具。域新一代强有力的研究工具。有关共聚焦显微镜的某些技术原理，早在有关共聚焦显微镜的某些技术原理，早在19571957年就已年就已提出，提出，2020年后由年后由BrandengoffBrandengoff在高数值孔径透镜装置上改在高数值孔径透镜装置上改

4、装成功具有高清晰度的共聚焦显微镜，装成功具有高清晰度的共聚焦显微镜，19851985年年Wijnaendts Wijnaendts Van ResandtVan Resandt发表了第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在发表了第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在生物学中应用的文章，到了生物学中应用的文章，到了19871987年，才发展成现在通常意年，才发展成现在通常意义上的第一代激光扫描共聚焦显微镜。义上的第一代激光扫描共聚焦显微镜。1 水银弧光灯2 中密度滤片3 光镧4 场镧5 激发滤片6 分光镜（BSP)7 物镜8 样品9,10 发射滤片11 目镜 Basics of conventional fl

5、uorescence microscope Fluorescent MicroscopeObjectiveArc LampEmission FilterExcitation DiaphragmOcularExcitation FilterConfocal PrincipleObjectiveLaserEmission PinholeExcitation PinholePMTEmissionFilterExcitation FilterDifferences between conventional and confocal microscope 1122观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅

6、接收焦平面上的光量，而且来自焦平观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构）。物学标本是层次区别的重叠结构）。共聚焦扫描显微镜的成像原理共聚焦扫描显微镜的成像原理l激光激光作为光源作为光源 采用采用点光源点光源照射标本，在焦平面上形成照射标本，在焦平面上

7、形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光器将荧光直接送到探测器。l扫描扫描方式成像方式成像 激光激光逐点扫描逐点扫描样品，探测针孔后的光电样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。焦图像。l光点光点共聚焦

8、共聚焦 光源和探测器前方都各有一个针孔（照明光源和探测器前方都各有一个针孔（照明针孔和探测针孔）。直径约针孔和探测针孔）。直径约100-200nm100-200nm；相对于焦平面上的；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终同时同时聚焦聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。都被挡在探测孔之外而不能成像。Confocal Princ

9、ipleConfocal Principle照明针孔照明针孔探测针孔探测针孔二色镜或分光镜二色镜或分光镜激光光源激光光源激光光源激光光源扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器）扫描镜、检测器）自动显微镜自动显微镜控制系统（数字信号处理器、计算机）控制系统（数字信号处理器、计算机）图象输出设备（显示器、打印机、存储器）图象输出设备（显示器、打印机、存储器）多重染色样品的观察多重染色样品的观察共聚焦显微镜的主要优点共聚焦显微镜的主要优点 高分辨率：高分辨率：图像与图像与对比度增强，使用对比度增强，使用短波长的紫外光，短波长的紫外光，大大提高了分辩率。

10、大大提高了分辩率。是普通荧光显微镜是普通荧光显微镜分辨率的分辨率的1.41.4倍倍（0.51/0.37)0.51/0.37)普通荧光显微镜分辨率共聚焦显微镜分辨率共聚焦显微镜应用常见错误认识共聚焦显微镜应用常见错误认识 在实际应用中尽管几乎所有标本都采用的是荧光标记，但决不能将LSCM认为就是一种“高质量图像的荧光显微镜高质量图像的荧光显微镜”.共聚焦显微镜并不总是并不总是荧光检测的最好工具。共聚焦显微镜能同时或序贯检测多种荧光通道，但不能将共聚焦显微镜简单地作为一种共存研究的工具。共聚焦显微镜真正的威力是依赖于其强烈抑制焦平面外荧光信号的能力抑制焦平面外荧光信号的能力，有很好的深度分辨能力或

11、光学切片功能。基于该性质的应用包括:样品的显微断层扫描(microscopic CT)Z扫描切片的3-D 重建 厚样品的分辨率 多通道同时检测，可实时检测细胞的生理活动和形态变化:生理学研究：如细胞内各种离子浓度随时间的变化情况.活细胞多种标记物同时进行成像，动态观察不同形态学事件的发生。如分泌颗粒的分泌过程。vestigial apterousCiD(cyanine 5).Not just the structure of a single cell,the relationship of adjacent cells at different plane can also be viewe

12、d clearly like below:CriteriaFixed CellsLiving CellsLimits of illuminationFading of fluorophorePhototoxicity and fading of dyeAntifade reagentPhenylenediamine,etc.NONE!MountantGlycerol(n=1.51)Water(n=1.33)Highest NA lens1.41.2Time per imageUnlimitedLimited by speed of phenomenon;light sensitivity of

13、 specimenSignal averagingYesNoResolutionWave opticsPhoton statisticsHertel L.A.,Stricker S.A.and Loker E.S.2000.Calcium dynamics of hemocytes of the gastropod Biomphalaria glabrata:effects of digenetic trematodes and selected bioactive compounds.Invertebrate Biology,v.119(#1):27-37.腹足纲一种淡水螺Biomphala

14、ria glabrata 血细胞的钙离子动态变化探针：Calcium Green Fura Red Calcium GreenFura Red10 s肾上皮细胞有丝分裂共聚焦显微镜观察mCherryH2B_mEmEB3骨肉瘤细胞内的内质网mEmerald_ER负鼠肾上皮细胞内体EGFP_Endosomes负鼠肾上皮细胞内溶酶体HeLa细胞的过氧化物酶体A focus motor can move the stage in precise increments so that multiple images from consecutive planes can be individually

15、scanned and saved.步进电机0.1mLodgepole pine(黑松)Nature Cell Biology 5,15(2003)Yellow and red fluorescence represents acridine orange-stained secondary cell walls and chloroplastic autofluorescence,respectively.The 3D image was reconstructed from optical sections obtained on a confocal microscope(FV500,O

16、lympus).Scale bar represents 20 m.motor nerve-Cy2muscle bag fiber-Cy3 Nucleus-DAPI 细胞膜（细胞膜（AlexaFluor 488）AlexaFluor 594AlexaFluor 594标记的标记的单壁碳纳米管单壁碳纳米管 透射光通道透射光通道 重叠图像重叠图像 Hela细胞内化碳纳米管过程12h at 37C A confocal optical section demonstrates that during telophase,microtubules(red)form a phragmoplast(phr

17、agmoplast(桶状纺缍体桶状纺缍体 )array and peroxisomes(green)aggregate immediately inside these.The DNA in the nuclei is stained blue.Image from Collings et al.(2003).PeroxisomesMicrotubulesDAPIPeroxisomal aggregation in onion may be involved in membrane production and/or metabolism during cell division The ro

18、le of hyaluronan in renal stone disease 透明质酸 Hyaluronan is expressed by proliferating renal tubular cells in subconfluent cultures(2 days post-seeding).At cell-cell contact(4 days post-seeding)this staining starts to fade away to completely disappear when the tight junctions are assembled(5-6 days p

19、ost-seeding).The hyaluronan receptor CD44 is also expressed at the luminal surface in subconfluent cultures(2 days post-seeding),at cell-cell contact CD44 is targeted to lateral spaces,whereas at confluence(6 days post-seeding),CD44 is exclusively expressed at basal domains of the plasma membrane.Th

20、e above two images are taken from the same field of the plant of 60 m thick by different means.The first one is taken by CCD camera in the wild field microscope configuration.the second one is taken by confocal microscopy with pinhole size at one Airy unit.共聚焦扫描显微镜在生命科学研究中的应用共聚焦扫描显微镜在生命科学研究中的应用l细胞结构

21、、蛋白质（如受体、抗原、抗体、酶、细胞细胞结构、蛋白质（如受体、抗原、抗体、酶、细胞 骨架蛋白等基因表达产物）、骨架蛋白等基因表达产物）、DNADNA、RNARNA等等l细胞膜流动性（荧光光漂白恢复技术）细胞膜流动性（荧光光漂白恢复技术）l细胞内活性氧变化细胞内活性氧变化l细胞内钙离子浓度变化细胞内钙离子浓度变化l膜电位膜电位u量子点量子点 (Quantum Dots(Quantum Dots，QDs)QDs)（Luminescence Luminescence Semiconductor nanocrystals Semiconductor nanocrystals 发光半导体纳米晶体）发光

22、半导体纳米晶体）u由于量子点具有独特的光学特性由于量子点具有独特的光学特性,20,20世纪世纪70 70 年代，应年代，应用主要集中在电子与光学方面用主要集中在电子与光学方面u2020世纪世纪80 80 年代，生物学家已经对量子点产生了浓厚的年代，生物学家已经对量子点产生了浓厚的兴趣，但由于它的荧光量子产率低，工作集中在研究兴趣，但由于它的荧光量子产率低，工作集中在研究量子点的基本特性方面量子点的基本特性方面u1997 1997 年以来，量子点制备技术的不断提高年以来，量子点制备技术的不断提高,量子点已量子点已越来越可能应用于生物学研究。越来越可能应用于生物学研究。u量子点可作为生物探针是从量

23、子点可作为生物探针是从19981998年年Alivisatos AP.Alivisatos AP.Chan WCChan WC两个研究小组开始，此后量子点的功能进一两个研究小组开始，此后量子点的功能进一步被发现、推广，使之成为生物学领域研究的热点。步被发现、推广，使之成为生物学领域研究的热点。量子点通常以量子点通常以CdSeCdSe为核、为核、CdSCdS或或ZnSZnS为壳的核为壳的核-壳型纳米体，与传壳型纳米体，与传统的有机染料相比，它有其统的有机染料相比，它有其独特独特的性质：的性质：量子点具有较大的斯托克位移和狭窄对称的荧光谱量子点具有较大的斯托克位移和狭窄对称的荧光谱Figs (A)

24、Excitation(dashed)and fluorescence(solid)spectra of fluorescein(B)a typical water-soluble nanocrystal sample in PBS 单个波长可激发所有的量子点单个波长可激发所有的量子点,而不而不同染料分子的荧光探针需多个激发波长同染料分子的荧光探针需多个激发波长应用范围广：可用于多领域和多仪器应用范围广：可用于多领域和多仪器多种颜色：颜色取决于量子点的大小，多种颜色：颜色取决于量子点的大小，在同一激发波长下，可发出多种激发光，在同一激发波长下，可发出多种激发光，达到同时检测多种指标的要求。达到同

25、时检测多种指标的要求。抗光漂白性抗光漂白性安全：细胞毒性低，可用于活细胞及安全：细胞毒性低，可用于活细胞及体内研究体内研究荧光时间长：荧光时间较普通荧光分荧光时间长：荧光时间较普通荧光分子长数千倍，便于长期跟踪和保存结果子长数千倍，便于长期跟踪和保存结果长颈瓶中不同尺寸的硒长颈瓶中不同尺寸的硒化镉化镉(CdSe)量子点在紫量子点在紫外线的照射下发出不同外线的照射下发出不同颜色的荧光颜色的荧光 Quantum dot fluorescence image of mouse kidney section QD fluorescence image of mouse small intestine

26、QD可用于非同位素标记的生物分子的超灵敏检测，如在QD表面连接上巯基乙酸（HS-CH2COOH),从而使量子点既具有水溶性，还能与生物分子（如蛋白质、多肽、核酸等）结合，通过光致发光检测出QD，从而使生物分子识别一些特定的物质。Schematic of a ZnSCapped CdSe QD that is covalently coupled to proteinQuantum dots catch cancer early QDs are depicted as gold spheres that attract DNA strands linked to cancer risks.Whe

27、n the QD are exposed to certain types of light,they transfer the energy to fluorescent molecules,shown as pink globes,that emit a glow.This enables researchers to detect and count the DNA strands linked to cancer.(Credit:Yi Zhang/Johns Hopkins University)A QD-EGF binds and activates cells expressing

28、 a GFP-fused EGFR.(a)Red QD-EGF and green GFP-EGFR colocalize on the cell membrane within minutes and(b)are rapidly internalized together into endosomes in the cytoplasm.(c)Individual receptors on long sensory filaments called filopodia can be visualized by QD-EGF binding.Images are single confocal

29、sections through living cells.Snapshots in time showing retrograde transport of QD-EGF-receptor-activated complexes on a filopodium cells expressing the EGFR-EGFP fusion protein after a short incubation with complexes of EGF-QD nanoparticles.(Credit for image and legend:Max Planck Institute for Biop

30、hysical Chemistry).内化过程动态显示Nature Biotechnology 22,198-203(2004)还可进行脉冲追踪实验(pulse-chase experiments),观察融合内体的寿命.In pulse-chase experiments using two different colors of QD-EGF,binding and endocytosis of orange QD-EGF by EGFR was followed 22min later by blue QD-EGF.Few endosomes contain both colors of

31、QDs(purple dots)when the pulses are separated by more than 15min Bioluminescent quantum dotsNature Methods 3,240-241(2006)通过与特定蛋白质偶联(如萤虫素酶)，形成生物传感器，测定生物体内物质的特性Smart Nanoprobes Light Up Disease:Quantum Dots Programmed To Glow In Presence Of Enzyme Activity Quantum dots glowing after targeting to canc

32、er cells.温度的高低直接影响到量子点颗粒的大小，一般情况温度越高，制得量子点的颗粒越小，发出的荧光波长越短，因此颗粒大小不同的量子点，可以显示出不同的颜色：用于追踪神经细胞膜中的氨基乙酸受体的活动性及扩散性生物芯片技术：量子点色彩的多样性满足了对生物高分子（蛋白质、DNA）所蕴含海量信息进行分析的要求：将聚合物和量子点结合形成聚合物微珠，微珠可以携带不同尺寸（颜色）的量子点，被照射后开始发光，经棱镜折射后传出，形成几种指定密度谱线（条形码），这种条形码在基因芯片和蛋白质芯片技术中有光明的应用前景用量子点检测肿瘤细胞Quantum dots modified with antibodies to human prostate specific membrane antigen light up murine tumors that developed from human prostate cells.小结小结 总的来说，由于量子点技术有其独特的标记特点,它必将成为今后生物分子检测的尖端技术,为DNA 检测(DNA 芯片)、蛋白质检测(蛋白质芯片)和探索蛋白质蛋白质之间(抗原抗体、配体受体、酶底物)反应原理提供更先进的方法。同时也将极大的推动生物显像技术和生物制药技术的迅猛发展,给疾病的诊断和治疗带来巨大进步。谢谢！