两虫方法确认材料

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1、生活饮用水中贾第鞭毛虫和隐孢子虫的测定 免疫磁分离荧光抗体法测定方法验证报告（GB/T 5750.12-2006）1. 目的 通过能力确认，确认实验室检出限、回收率，方法重复性方面是否都达到标准要求，实验室是否具备开展用免疫磁分离荧光抗体检测定生活饮用水及水源水的贾第鞭毛虫和隐孢子虫的检测能力。2. 适用范围本标准规定了用免疫磁分离荧光抗体法测定生活饮用水及水源水中的贾第鞭毛虫和隐孢子虫（以下简称为“两虫”）的含量。本标准适用于生活饮用水及水源水中的“两虫”的测定。3. 职责3.1 检测人员负责按操作规程操作，确保测量过程正常进行，消除各种可能影响试验结果的意外因素。3.2复核人员负责检查原始

2、记录。3.3技术负责人负责审核检测结果。4. 测试方法4.1 术语和定义贾第鞭毛虫（Giardia）：一种可能在水中或其他介质中发现的原虫类寄生虫。有两个种，宿主是：G.intestinalis（人类）和G.muris（鼠类）。隐孢子虫（cryptosporidium）：一种可能在水中或其他介质中发现的原虫类寄生虫，有6个种哺乳类动物，包括人类；鸟类；鼠类；爬行类和鱼类。4.2试剂4.2.1 Easy seed G/C质控标样（贾第鞭毛虫孢囊1001.6，隐孢子虫卵囊1001.2）；4.2.2 挪威Dynal贾第鞭毛虫/隐孢子虫免疫磁分离试剂盒；4.2.3 美国Waterborne贾第鞭毛虫/

3、隐孢子虫染色试剂盒；4.2.4 PBS缓冲溶液： NaCl，8g； KCl，0.2g； Na2HPO4，1.15g； KH2PO4，0.24g； 纯水，1000mL，用氢氧化钠或盐酸调pH至7.20.1，在4可存储1个星期。4.2.5 PBST淘洗缓冲液：NaCl，8g；，KCl，0.2g；Na2HPO4，1.15g；KH2PO4，0.2g；TWeen-20，0.1mL；纯水1000mL，将磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠加入到900mL超纯水，搅拌20min至完全溶解，加入0.1mLTween-20并继续搅拌10min，然后用超纯水稀释至1000mL；4.2.6 0.1mol/LHCl

4、；4.2.7 1mol/LNaOH；4.2.8 去离子水4.3器材Dynal MPC-1 磁极、Dynal MPC-S 磁极、Dynal MX1 混合器、FM xpressV2.0快速淘洗装置系统、蠕动泵、IKA涡旋震荡混混合器、空气压缩机、四川蜀科离心机、Dynal L10 试管、BK-FL正置荧光显微镜 、移液枪。4.3检验步骤4.3.1水样过滤/淘洗/浓缩过程（Filta）4.3.1.1采样体积 原水20L，处理水100L；根据水样类型决定。将过滤模块（螺栓头朝下）安装在支架上，拧紧盖子（盖子即为进样口）。将过滤装置连接到需采样的水源。中间连接上蠕动泵及流量控制阀4L/min。开动泵，根

5、据水样量来确定采样时间，记下过滤后水的体积V2，单位为L。4.3.1.2淘洗打开压力淘洗器，过滤装置进样口朝上，移开样品阻留器，连接出样口分流装置。将过滤装置倒转，用快接头连接到压力淘洗器上，连接盛有缓冲液的瓶子，加4.0巴压缩空气，。并将500mL锥形离心瓶放置在样品收集器支架上，关闭压力淘洗装置。淘洗装置按控制面板的F1键，开始自动淘洗，2min后收集约500mL的淘洗液。4.3.1.3浓缩将装有淘洗液样本的500mL离心管置2000g离心机离心15min，慢慢减速，并记录下沉淀物体积V0。将沉淀物上层8mL10mL处的悬浮物小心吸出。4.3.2免疫磁分离（IMS）4.3.2.1使用贾第鞭

6、毛虫/隐孢子虫免疫磁分离试剂盒中的试剂制备1SL-A型缓冲液，用试剂水作为稀释剂。加1mL10SL-A型缓冲液和1mL10SL-B型缓冲液到L10单平面试管中。4.3.2.2定量转移10mL(V1)水样浓缩物再悬浮液到含有SL-缓冲液的L10单平面试管中。4.3.2.3将抗隐孢子虫抗体和抗贾第鞭毛虫的磁微粒原液置于Dynal MX1 混合器上搅拌，以便使珠粒悬浮。并在上述L10单平面试管中各加入100L上诉述悬浮的微粒。4.3.2.4将样品试管固定到Dynal MX1 混合器，在25r/min的条件下至少旋转1h。4.3.2.5将试管从搅拌器上取下，然后将其放在磁力浓缩器（MPC-1）上，收集

7、磁珠，弃去清液。4.3.2.6将试管从MPC-1上取下，加1mL1SL-A型缓冲溶液。非常柔和的将试管中的所有物质再悬浮。将样品试管中的的所有液体定量转移到贴有标签的1.5mL微量离心管中。将微量离心管放到另一磁粒子浓缩器（MPC-S)中，对磁珠进行浓缩，再次纯化，并吸走上清液。4.3.2.7加入50L0.1mol/L的盐酸（HCl）至上述微量离心管中，用Dynal MX1 混合器混合10s，使磁珠与孢（卵)囊充分解离。准备一个井型载玻片，然后加5L1mol/L的氢氧化钠溶液至样本井中。将所有样品从MPC-S的微量离心管中转移到有氢氧化钠的样品井中。4.3.3染色与镜检(FA)4.3.3.1将

8、有样品的井型载玻片放到37的培养箱中，蒸发干，在每一含有干样品的井中滴加50L纯甲醇，然后让它空干3min5min。4.3.3.2加50L上述异硫氰酸荧光素（FITC）单克隆抗体工作稀释液至样本井中。将载玻片放到温室中于37培养30min左右。之后，取出载玻片，然后用一个干净的巴斯德移液管轻轻地从每个井边吸掉过量的荧光素标记单克隆抗体。在每个井中加70L的PBS（或者Wash Buffer稀释液），静置1min2min后，吸掉多余的PBS。4.3.3.3加50LDAPI溶液（使用时配制，即加10L，2mg/mL溶于甲醇的DAPI于50mL的PBS中）到每个井中，然后让它在室温静止2min左右，

9、吸掉过量的DAPI溶液。加L的Wash Buffer稀释液到每个井中，静置1min2min后，吸掉多余的PBS。4.3.3.4加70L的试剂水到每个井中，静止1min后，吸掉多余的水分。4.3.3.5让载玻片在暗处干燥后，加一滴含防荧光减弱的封固剂到每个井的中心，在井型载玻片上盖上载玻片，准备镜检观察。注意：为确保染色过程准确可靠，进行染色试剂阴性对照和阳性对照试验。阴性对照：用纯水进行染色试验；阳性对照：用试剂盒中自带的阳性样本进行染色试验。4.3.3.6打开显微镜和汞灯。预热10min后，在200倍的荧光显微镜下检查，在400倍的荧光显微镜下进一步证实。全井计数X，即计数样本的体积中孢囊或

10、卵囊的数目。结果判断依据如下表。（在对样品进行计数前，要先计数阴性和阳性对照实验样品；阴性样品不得检出任何的“两虫”，阳性样品中要检出特征正常、规则、染色均匀、数量正常的“两虫”）。4.3.3.7贾第鞭毛虫的孢囊是椭圆形的，长度为814m，宽度为710m会发出苹果绿的荧光，在紫外光下，DAPI阳性孢囊会出现4个亮蓝色的核。隐孢子虫的卵囊为微椭圆形，直径26m，卵囊壁会发出苹果绿的荧光，在紫外光灯下，DAPI阳性孢囊会出现4个亮蓝色的核。表1 贾第鞭毛虫孢囊和隐孢子虫卵囊阳性判断免疫荧光检验DAPI相差干涉检验结果报告阳性阳性阳性确认为卵囊或孢囊阳性阳性阴性确认为卵囊或孢囊阳性阴性阳性确认为卵囊

11、或孢囊阳性阴性阴性怀疑为卵囊或孢囊阴性阴性阴性无卵囊或孢囊检出5. 检出限、回收率和精密度5.1检出限5.1.1检出限方法：直接处理100L处理水，按照4.3的检验步骤进行测定，其中结果见附表1，由检测限计算公式：D=V/(V1V2)得 处理水的“两虫”检测限为：D=10mL/（10mL100L）=0.1个/10L 水源水的“两虫”检出限为：D=10mL/（10mL20L）=0.5个/10L5.2回收率和精密度在10L蒸馏水中搀加一剂Easy seed G/C质控标样（贾第鞭毛虫孢囊1001.6，隐孢子虫卵囊1001.2）两虫质控标样，用磁力搅拌器混匀10min后，进行过滤，待10L原虫水基本

12、全部过滤完后，再加10L的水到10L玻璃瓶中，后继续过滤水样。总过滤体积为20L，再按照淘洗、浓缩、磁分离、染色、镜检的分析过程进行检测，重复做4次，结果见附表。（1）由平均值公式得， 贾第鞭毛虫平均回收率为 =（31%+42%+38%+45%）/4=39%隐孢子虫平均回收率=（29%+39%+43%+41%）/4=38.0%（2）由标准偏差公式 得： 贾第鞭毛虫标准偏差SD=0.06 隐孢子虫标准偏差 SD=0.06（3）由相对标准偏差得； 贾第鞭毛虫相对标准偏差RSD=0.06/39.0%=15.5% 隐孢子虫相对标准偏差 RSD=0.06/38.0%=16.4%6 结论 Filta-Max xpress法过滤淘洗/免疫磁分离/荧光染色法定量检测水中贾第鞭毛虫和隐孢子虫的方法，其中贾第鞭毛虫平均回收率为P=39.0%，隐孢子虫平均回收率为p=38.0%，贾第鞭毛虫精密度RSD=15.5%，隐孢子虫精密度RSD=16.4%，均满足GB/T 5750.12-2006方法的要求。8