十五艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法

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1、HIVHIV生活周期生活周期HIVHIV基因组模式图基因组模式图注：上标字母相同表示组间无显著差异，上标字母不同表示组间差异显著注：上标字母相同表示组间无显著差异，上标字母不同表示组间差异显著全球基金支持经费全球基金支持经费配套经费配套经费项目总经费项目总经费广西广西3,605,6091,060,6364,666,245贵州贵州2,365,191697,4453,062,636湖南湖南2,487,791724,4503,212,241江西江西1,735,176506,2112,241,387四川四川2,623,645771,1363,394,781新疆新疆3,137,663922,7394,0

2、60,402云南云南4,470,6641,310,9545,781,618中央中央3,511,1781,002,3204,513,498合计合计23,936,9176,995,89130,932,808什么是耐药性什么是耐药性?药物的作用靶点与机制药物的作用靶点与机制?与病毒的哪些基因有关与病毒的哪些基因有关?耐药性是怎么产生的耐药性是怎么产生的?那些因素促使耐药性病毒株出现那些因素促使耐药性病毒株出现?耐药性分类与耐药机制。耐药性分类与耐药机制。如何检测耐药株如何检测耐药株?检测中注意事项。检测中注意事项。HIV耐药性是指病毒通过自身的遗传变耐药性是指病毒通过自身的遗传变异，产生对药物抑制作

3、用，使药物敏感性异，产生对药物抑制作用，使药物敏感性降低或不敏感的现象。降低或不敏感的现象。药物浓度药物浓度病毒抑制率病毒抑制率(%)野生型病毒野生型病毒耐药株耐药株1000IC50,WTIC50,MT50耐药倍数耐药倍数IC50=50%抑制浓度抑制浓度全国艾滋病定点医院检测技术研讨班全国艾滋病定点医院检测技术研讨班Nucleotide RTI TenofovirEntry Inhibitors T20 病毒自身因素病毒自身因素内因内因药物的选择压力药物的选择压力外因外因病毒自身因素病毒自身因素内因内因 HIV-l的逆转录酶（RT）不具有DNA聚合酶的校正功能，因此，在复制过程中，病毒核酸表现

4、出高度的错误倾向性。在病毒的高速复制过程中，高频率突变在很短的时间内随 时发生。每个复制周期产生一个突变点；每天产生109 1010 个新病毒；病毒基因组中平均每个碱基每天突变一次药物的选择压力药物的选择压力外因外因 在药物选择压力下，耐药变异株完全取代药物敏感株最快 能发生在14 至28天内。耐药株是在病毒自发性的、高频率的基因突变中产耐药株是在病毒自发性的、高频率的基因突变中产生，在药物选择性的压力下优势复制的结果。生，在药物选择性的压力下优势复制的结果。1.病毒学失败率病毒学失败率(%)0204060801009590-9580-9070-8070服药依从性服药依从性(%)82.171.

5、466.754.621.72.服药依从性服药依从性(%)2.药物配伍不当药物配伍不当药代显著不同药物配伍药代显著不同药物配伍3.024483612时间时间(小时小时)药物浓度药物浓度潜在病毒复制区IC90IC50最后一次用药最后一次用药单药治疗S.Taylor et al.11th CROI Abs 1313.药物配伍不当药物配伍不当缺乏对某一时相细胞内病毒抑制或抑制不足缺乏对某一时相细胞内病毒抑制或抑制不足4.其他因素其他因素1、原发性耐药(Primary resistance):病人在接受抗病毒治疗前产生了药物作用靶点的变异，或者感染了耐药毒株，均降低抗病毒药物的敏感性。在已经开展HAAR

6、T的国家普遍存在，感染了耐药毒株的病人很容易引起药物治疗失败。2、继发性耐药(Secondary resistance):病人已经接受了抗病毒治疗并产生治疗失败，在药物的选择压力下产生的耐药。核苷和核苷类似物1、破坏核苷类似物结合病毒破坏核苷类似物结合病毒DNA的能力的能力 M184V 突变:RT酶第184位密码子 的氨基酸由蛋氨酸(M)变成为缬氨酸(V)。拉米夫定(Lamivudine)Q151M mutation:在HIV-1中出现低于 5%；HIV-2中出现频率较高。2、切除病毒DNA链末端的核苷类似物Thymidine analogues mutations:突变引起ATP或者焦磷酸介

7、导的切除DNA链3末端核苷类似物。核苷和核苷类似物非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)突变降低了抑制剂对酶的结合力。不同于核苷逆转录酶抑制剂，其单一突变就能导致高度耐药。如K103N、Y181C。HIV蛋白酶由两个同样的蛋白质链组成。这两个蛋白质链在一起就如同核桃的两半，而蛋白酶的活性位点就在两个半壳的中间。基因的突变通常以字母数字字母的书写方式来表示，第一个字母代表野生型病毒株特定密码子处的氨基酸，第二个字母代表在特定密码子处替换了的氨基酸，中间数字表示突变点的位置。例如：逆转录酶（RT）K103N的突变表示逆转录酶第103位密码子的氨基酸由天冬酰胺（K）变成为赖氨酸（N）。目前耐药性检测有两

8、种方法，即表型检测及基因型检测。表型检测通过用药期间的病毒培养进行，而基因型检测则通过分子生物学方法检测与耐药性相关的病毒基因突变。基因型检测的费用较低，技术也相对容易，可在样品收集后12周得到结果，但分析基因型耐药检测时，需要掌握大量相关知识，如突变与抗病毒药物及其它药物的交叉耐药等，才能对结果进行正确的分析。表型检测可以直接检测病毒的耐药性，但操作复杂、耗时，技术要求高，且非常昂贵，因此目前国际上广泛应用于临床的是基因型耐药检测。TranslationintolinearstringofaminoacidsFoldingintofunctionalprotein表型检测表型检测基因型检测基

9、因型检测基因型和表型检测基因型和表型检测 在病人仍在治疗失败的方案上收集样品，可保 证耐药株占总病毒量的20%以上；病毒载量 1000时,可出现假阴性。检 测 流 程病人血浆标本HIV RNA病毒 cDNAHIV RT和PR基因片段序列测定结果解释RNA提取逆转录PCR扩增特定的解释系统标本新鲜EDTA抗凝血浆，或-80保存，避免反复冻融病毒RNA提取（Qiagen公司试剂盒）裂解标本，灭活RNA酶加到离心柱中，RNA与硅胶膜结合洗两次，去除杂质用无RNA酶的缓冲液洗脱RNA收集RNA备用优点：操作简便、快速、得率高逆转录 RNA cDNA 反应体系：10XBuffer 1l dNTP 0.5

10、l 外侧反向引物 1l RNase inhibitor 0.25l M-MuLV RT 0.25l DEPC水 2l RNA模板 5l42水浴1小时，95 5分钟灭活RT巢式PCR扩增病毒蛋白酶和逆转录酶基因第一轮扩增反应体系：10XBuffer 5l MgCl2 3l dNTP 1l 外侧正向引物 1l 外侧反向引物 1l Taq酶 0.5l 水 29.5l cDNA模板 10l 945min，9430sec，5530sec，722.5min 30循环巢式PCR扩增病毒蛋白酶和逆转录酶基因第二轮扩增反应体系：10XBuffer 5l MgCl2 3l dNTP 1l 内侧正向引物 1l 内侧

11、反向引物 1l Taq酶 0.5l 水 29.5l 第一轮扩增产物 10l 945min，9430sec，5530sec，722.5min 30循环扩增产物鉴定：琼脂糖凝胶电泳扩增产物纯化QIAquick Gel extraction试剂盒核酸序列测定双脱氧链末端终止法:Protease:CCTCAAATCACTCTTTGGCAACGACCCCTCGTCACAGTAAAGATAGGGGGGCAATTAAAGGAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGAAATGAATTTGCCAGGAAAATGGAAACCAAAAATGATAGGGGGAATTGGAGG

12、TTTTATCAAAGTAAGACAGTATGATCAGGTATCCATAGAAATCTGTGGACATAAGGCTGTAGGTACAGTATTAATAGGACCTACACCAGTCAACATAATTGGGAGAAATCTGTTGACTCAGATTGGTTGCACTTTRT:AAATTTTCCCATTAGTCCTATTGAAACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAGGAATGGATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGCCATTGACAGAAGAAAAAATAAAAGCATTAGTAGAAATTTGTACAGAAATGGGAAAGGAAGGAAAAATTTCAAAAATTGGGCC

13、TGAAAATCCATACAATACTCCAGTATTTGCCATAAAGAAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGAGAACTCAATAAAAGAACTCAAGACTTTTGGGAAGTTCAATTAGGAATACCACATCCCGCAGGATTAAAACAGAAAAAATCTGTAACAGTCCTGGATGTGGGTGATGCATATTTCTCAGTCCCTTTAGATAAAGACTTCAGGAAGTACACTGCATTTACCATACCTAGTGTAAACAATGAGACACCAGGGATTAGATATCAGTACAATGTACTTCCACAGGG

14、ATGGAAAGGATCACCAGCAATATTCCAATGTAGTATGACAAAGATCTTAGAGCCTTTTAGGAAACAAAATCCAGACATAGTTATCTATCAATACATGGATGATTTGTTAGTAGGATCTGACTTAGAAATAGGGCAGCATAGAGCAAAAATAGAGGAACTGAGACAACATCTGTTGAGGTGGGGATTTACCACACCAGACAAAAAACATCAGAGAGGACCTTCCATA利用网络工具确定耐药性突变并进行耐药性解释 Web站点：http:/hivdb.stanford.edu HIV Drug Resistance A

15、lgorithm2 HIV Drug Resistance Algorithm3 HIV Drug resistance database HIV Drug Resistance Algorithm1高度耐药：大于60分中度耐药：3059分低度耐药：1529分潜在低度耐药：1014分敏感：09分耐药性突变计分HIV-1耐药性检测的临床指征：（1）抗病毒治疗病毒学失败需要改变抗病毒治疗方案时应进行耐药性检测以协助选择有效的抗病毒药物。（2）抗病毒治疗病毒载量下降不理想时可进行HIV-1的耐药性检测。（3）抗病毒治疗失败需要进行耐药性检测时，应该在病人仍在服药时或停药后立即（4周内）进行检测。HI

16、V-1耐药性检测的临床指征：（4）急性HIV1感染的病人进行抗病毒治疗，最好进行耐药性检测，对于选择合适的抗病毒药物、取得最佳抗病毒效果很有益处。（5）对于未经抗病毒治疗的慢性HIV感染者不一定要做耐药性检测，但当有迹象显示感染的是耐药性HIV毒株时（例如感染来自于正在服用抗病毒药物的病人），就应当进行耐药性检测。（6）不推荐对病毒载量1000cp/ml的病人做病毒载量检测，因为病毒水平太低很难扩增出目的基因片段 耐药性检测结果的解释HIV-1的耐药性不是全或无的现象，基因型和表型耐药性检测结果的分析和解释都有困难所有抗病毒治疗都是联合用药，他们之间是相互协同的，即对一种药物的敏感性降低并不干扰同一治疗方案中其他药物的抗病毒活性。药物即使有耐药性也可能有益处，因为有耐药性突变的病毒比敏感毒株的复制适应性要差得多。血清中药物的水平，特别是蛋白酶类药物是高度变化的，如果能够提高血清中蛋白酶类药物的浓度，低水平的蛋白酶耐药性有时能够被克服。本文参考了邵一鸣博士，李敬云教授，徐本文参考了邵一鸣博士，李敬云教授，徐建青博士的幻灯。建青博士的幻灯。