第2章 高效液相色谱分析法

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1、3 高效液相色谱法高效液相色谱法仪器分析 定义：定义：以液体为流动相而设计的色谱分析仪器称为液相色谱仪；采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。组成部分：高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统本实验室的高效液相色谱仪（岛津本实验室的高效液相色谱仪（岛津 LC-10A）3.1 流程流程液体流动相液体流动相高压输液泵高压输液泵色谱柱色谱柱进样器进样器检测器检测器废液废液信号输出信号输出3.2 特点特点 特点：高压、高效、高速、高灵敏度特点：高压、高效、高速、高灵敏度 适用范围广，特别对高沸点、热不稳定有机及生化试样的适用范围广，特别对高沸点、热不稳定有机

2、及生化试样的高效分离分析具有极大的优势。高效分离分析具有极大的优势。3.3 主要部件主要部件(1)高压输液泵主要部件之一，用于输送液体流动相。主要部件之一，用于输送液体流动相。高柱效的固定相粒度很小（高柱效的固定相粒度很小（甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳环己烷环己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)4.选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题（a）尽量使用高纯度试剂作流动相，

3、防止微量杂质）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质 长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（b）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。（如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧柱子。（如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。）化铝固定相等。）（c）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。淀并在柱中沉积。（d）流动相还应满足检测器的要求。当使用紫外检测）流动相还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。器时，流动相

4、不应有紫外吸收。1 1 液液-固吸附色谱固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatographyliquid-solid adsorption chromatography 固定相：为固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常使：为固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是用的是510 m的硅胶吸附剂；的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相上的吸附与解吸；：组分在固定相上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高

5、选择性；官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；3.4 主要色谱分离类型与基本原理有机氯农药残留量分析有机氯农药残留量分析 固定相固定相：薄壳型硅胶薄壳型硅胶(37 50 m)流动相：正己烷流动相：正己烷 流流 速：速：1.5 mL/min 色谱柱：色谱柱：50cm 2.5mm(内径内径)检测器：差示折光检测器检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。残留量进行分析。2.液液-液分配色谱液分配色谱 liquid-liquid partition chromatography 固定相与流动相

6、均为液体（互不相溶）；固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（流动相的极性小于固定液的极性（正相正相 normal phase），），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相反相 reverse phase）。）。正相与反相的出峰顺序相反。正相与反相的出峰顺序相反。液-液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型载体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采由氧化硅、氧化铝

7、、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料。以下的小颗粒，化学键合制备柱填料。（2）表面多孔型载体 （薄壳型微珠担体）（薄壳型微珠担体）3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 2m的多的多孔硅胶。孔硅胶。表面积小，柱容量底；表面积小，柱容量底；化学键合固定相化学键合固定相:稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用 最广最广、性能最佳的固定相；、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：硅氧碳键型：SiO

8、C b.硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSi C c.硅碳键型：硅碳键型：SiC d.硅氮键型：硅氮键型：SiN 3 化学键合相色谱法化学键合相色谱法 将各种不同基团通过化学反应将各种不同基团通过化学反应 键合到硅胶（载体）表面的键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上。游离羟基上。4.离子交换色谱离子交换色谱 ion-exchange chromatography 固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶酸性水溶液液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用；阳离子离子交换

9、树脂作固定相，采用碱性水溶液碱性水溶液；基本原理：组分在固定相上发生反复离子交换反应；：组分在固定相上发生反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长。在形式等有关。亲和力大，保留时间长。阳离子交换：RSO3H +M+=RSO3 M +H+阴离子交换：RNR4OH +X-=RNR4 X+OH-应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。5.尺寸排斥色谱尺寸排斥色谱size-exclusion chromatography 原理：按分子大小分离。

10、小分：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离。范围内的化合物按质量分离。M.W.tR高效液相色谱分析的应用高效液相色谱分析的应用1.茶多酚的检测茶多酚的检测 高效液相条件：色谱柱：Diamonsil C18（5um，250m

11、m*4.6mm）流动相：等浓度洗脱 CH3OH-H2O-TFA（23：77：0.05）A：甲醇（色谱纯）B：0.05%的TFA水溶液（微孔过滤超声）洗脱程序（先等度再梯度）：23%A（20min）10min 40%A(5min)5min 90%A(5min)5min 23%A 检测波长：280nm 流速：1ml/min 柱温：35 样品含量公式：样品含量=（标品取样量*样品峰面积*标品纯度）/标品峰面积色谱图色谱图1.25%甲醇溶液甲醇溶液2.23%甲醇溶液甲醇溶液2.图形分析图形分析气相图：气相图：l存在的问题：峰型不规则，有拖尾现象。存在的问题：峰型不规则，有拖尾现象。l可能的原因：色谱柱

12、温度偏低；色谱柱柱效较差；流动可能的原因：色谱柱温度偏低；色谱柱柱效较差；流动 相流速偏低；进样速度慢。相流速偏低；进样速度慢。l解决办法：升高柱温度；对柱子进行老化（高温加解决办法：升高柱温度；对柱子进行老化（高温加 热）；增大流速。热）；增大流速。液相图：液相图：lC-18柱（柱（ODS柱柱)l可能的原因：流动相极性偏大、流速偏小。可能的原因：流动相极性偏大、流速偏小。l解决的办法：降低极性，增加流速。解决的办法：降低极性，增加流速。问题：两个峰出峰时间相隔太远。方法：增加流动相极性；增加流动 解决办法：使用梯度洗脱。解决办法：使用梯度洗脱。液相色谱液相色谱-质谱联用质谱联用样品样品色谱色谱接口接口质谱质谱计算机处理系统计算机处理系统结果结果ABCD.M+N+O+P+.质谱检测质谱检测样品样品色谱分离色谱分离课堂作业课堂作业什么是梯度洗脱，梯度洗脱的特点及应用。什么是正向柱和反向柱？在正相液相色谱的分离过程中,极性 _ _的组分先流出色谱柱,极性_ _的组分后流出色谱柱。下列几种物质，应选择哪种色谱进行分析？乙醇，玫瑰精油，-淀粉酶，脂肪酸，多糖