农药残留检测质谱基质效应

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1、基质效应化学分析中，基质指的是样品中被分析物以外的组分。基质常常对分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性。例如，溶液的离子强度会对分析物活度系数有影响，这些影响和干扰被称为基质效应（matrix effect）。 目前最常用的去除基质效应的方法是，通过已知分析物浓度的标准样品，同时尽可能保持样品中基质不变，建立一个校正曲线（calibration curve）。固体样品同样有很强的基质效应，对其校正也尤为重要。 对于复杂的或者未知组分基质的影响，可以采用标准添加法（standard addition method）。在这一方法中，需要测量和记录样品的响应值。进一步加入少量的标准溶

2、液，再次记录样品的响应值。理想地说来，标准添加应该增加分析物的浓度1.5到3倍，同时几次添加的溶液也应该保持一致。使用的标准样品的体积应该尽可能小，尽量降低过程中对基质的影响。基质效应的评价方法一种是较简单的采用相对响应值法 A：在纯溶剂中农药的响应值 B：样品基质中添加的相同含量农药响应值 基质效应Matrix Effect (%)=B/A100 另一种方法是比较复杂的标准曲线测定法 配制3组标准曲线。第1组用有机溶剂配制成含系列浓度待测组分和内标的标准曲线，可以做5个重复。第2组标准曲线是将5种不同来源或不同品种的的空白样品经提取后加入与第1组相同系列浓度的待测组分和内标后制得。第3组标准

3、曲线采用与第2组相同的空白样品在提取前加入与第1组相同系列浓度的待测组分和内标后再经提取后制得。通过比较3组标准曲线待测组分的绝对响应值、待测组分与内标的响应值比值和标准曲线的斜率，可以确定基质效应对定量的影响。第1组测定结果可评价整个系统的重复性。第2组测定结果同第1组测定结果相比，若待测组分响应值的相对标准偏差明显增加，表明存在基质效应的影响。对第3组测定结果，若待测组分响应值的相对标准偏差明显增加，表明存在基质效应和提取回收率因样品来源不同而产生的共同影响。各位板油大家好，新一期的【华山论剑】又和大家见面了。本期话题主要就基质效应展开讨论，大家可以就基质效应的定义、基质效应的评价方法、基

4、质效应如何进行系统而准确的评价、如何减少基质效应等方面表述自己的观点和看法，对于原创性的经验或者总结将给予重奖，欢迎积极参与 bigyang 回复于：2008-4-17 13:19:40瞬间离子基体效应 moment ion matrix effect 离子的有效淌度受到周围离子的影响，由其周围离子所形成的包围圈，称为离子基体。如果样品组分从进样点到探测点迁移过程中，在某一时间间隔遇上一个不同组成的基体区带，这个离子基体区带就将对样品组分产生影响，使它们的淌度发生瞬时变化，从而选择性地影响溶质的迁移和分离，这就是瞬时离子基体效应。wangboxzzjs 回复于：2008-4-17 9:55:0

5、5基质指的是样品中被分析物以外的组分。基质常常对分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性。例如，溶液的离子强度会对分析物活度系数有影响，这些影响和干扰被称为基质效应（matrix effect）。目前最常用的去除基质效应的方法是，通过已知分析物浓度的标准样品，同时尽可能保持样品中基质不变，建立一个校正曲线（calibration curve）。固体样品同样有很强的基质效应，对其校正也尤为重要。对于复杂的或者未知组分基质的影响，可以采用标准添加法（standard addition method）。在这一方法中，需要测量和记录样品的响应值。进一步加入少量的标准溶液，再次记录样品的响应

6、值。理想地说来，标准添加应该增加分析物的浓度1.5到3倍，同时几次添加的溶液也应该保持一致。使用的标准样品的体积应该尽可能小，尽量降低过程中对基质的影响。juju11 回复于：2008-5-6 12:23:49原文由 rodger 发表:看看今天各大网站上的新闻吧：“近日，上海药物所李川课题组完成了研究项目“液相色谱电解质效应的发现及液-质联用技术分析中药多成分复杂样品方法学研究” ，该项研究首次发现了“液相色谱电解质效应”，即通过添加微量电解质即可大大提高化合物在质谱中的离子化效率和离子化能力，从而增强分析物的质谱响应信号、扩大分析方法的定量范围。正当各大公司都在想方设法通过改造仪器物理结构

7、来提高检测灵敏度，这一发现为痕量分析提供了一种仪器之外的提高检测灵敏度的方法。同时，加入的微量添加剂还可以克服液质联用分析中的基质效应，因而使定量分析结果更稳定、可靠。这对生化、食品、环境分析中的痕量物质的分析有较大影响和参考价值，也在一定程度上丰富了质谱理论。同时，此项研究还首次建立了用超过滤的方法快速简便地分离中药成分在血浆中的游离药物浓度以更好地了解药物的量效关系、揭示其药效物质基础，为更好地进行中药的药效与药代相关性研究建立了桥梁。 该项目获得了2007年度中国中西医结合学会科学技术奖三等奖。中国中西医结合学会科学技术奖是由中国中西医结合学会于2004年设立的奖项，授予在中西医结合基础

8、研究、临床研究和开发研究中有突出成绩的集体和个人。”有哪位战友能了解到比较详细的信息啊，。 共同关注！badbed 回复于：2008-5-4 16:24:02AC上有一篇关于Matrix effext介绍得很详细的文献，作者B. K. Matuszewski等，2003，75，3019-3030，感兴趣的可以下来学习学习。下面谈谈我的理解。随着质谱的普及，生物样品的定量工作开始普遍使用LC/MS/MS进行。质谱的高选择性决定了其作为检测器与紫外的不同非待测物可以不被检测，这就使得高通量成为现实。然而，生物样品中的共流出物并非不存在，它对待测物的离子化的影响仍然存在。简单的说，基质效应就是样品中

9、的共流出物对待测物离子化过程的影响，其原理至今未有定论，目前普遍认为是共流出物与待测物在离子化时存在竞争关系导致引起的。分为离子抑制和离子增强两种。顾名思义，就是会对待测物的离子化有增强和抑制的作用，这肯定会影响待测物的准确定量。评价方法很简单，就是在做method validation时，分别制备回收率样品和基质效应样品，然后比较二者的峰面积，待测物与内标的分别计算。ME=回收率样品峰面积/基质效应样品峰面积*100%85%-115%之间认为不存在基质效应。其中低、中、高浓度各6份，回收率样品就按照正常方法制备，基质效应样品就是把待测物和内标以流动相稀释到对应浓度即可。（回收率样品说起来也能

10、说很多，此处不谈）了解了原理自然就有办法避免基质效应，一句话说来就是调整色谱保留时间。通常来说死时间的基质效应最严重且多为离子抑制，要尽量避免死时间出峰。当然，也不能说避开了死时间就万事大吉。在方法开发阶段，可以做一对回收率样品和基质效应样品在不同色谱条件下考察基质效应。尽量缩短保留时间提高通量，同时避免基质效应。也看文献说ESI源容易产生基质效应而APCI源较好，这个不太好说，我也用APCI做过基质效应较高的化合物。换源的时间还不如拿来优化色谱条件（个人看法）。另外，优化样品预处理方法也可以在一定程度上避免离子抑制，当然也不绝对，色谱条件选好了沉淀蛋白也能做一个好方法。一家之见，欢迎讨论。4

11、4sbb 回复于：2008-4-19 15:07:47基质效应 1基质（matrix） 尚无统一的解释，曾称为“一种分析物（analyte）的环境（milieu）”，即指标本中除分析物以外的一切组成。以血清胆固醇（Chol）测定而言，就是指Chol以外血清中的一切成分及其物理、化学性质。2.基质效应（matrix effect） 按NCCLS文件的定义，指（1）标本中除分析物以外的其他成分对分析物测定值的影响。（2）基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。广义说来，基质效应也应包括已知的干扰物（如Chol测定中胆红素、血红蛋白、抗坏血酸等都是干扰物），但目前只将基质效应限于生物材料中未知或未

12、定性的物质或因素（如粘度、pH等）的影响。3.基质偏差（matrix bias） 基质效应所致分析结果的偏差称为基质偏差。 用作校准物质或质控物的经过处理的混合血清，由于血清基质的理化性质在处理过程中的改变，在常规测定上往往出现基质偏差。 基质偏差的出现也与分析系统（包括方法、试剂及所用仪器设备）有关，所以有人将基质效应定性为方法、材料与基质的特异性反应。4.制备物（processed material） 用于血脂常规测定的校准液（calibrator）及用于技能对比试验（proficiency test，PT）或室间质量评价（EQA）的样品（如质控血清）。 以Chol测定为例，全酶法测Cho

13、l始于1974年，在此以前用化学反应测Chol时，除了一些已知的干扰因素外尚未提及基质效应问题。1979年才由Cooper指出Chol酶法中校准液与病人血清的反应性不同，可使Chol测定值偏低5%7%。 1994年CAP调查570实验室时用了参考方法定值的新鲜冰冻血清为调查材料，15个同方法测定chol组中仍有11个组出现基质偏差，同时用制备物的4个组中，3个有基质偏差。 有的报告指出TG、HDL-C常规方法与CDC的参考方法比较，有明显偏差，甚至10%。 McNamura等发现血清冰冻可在免疫法（用apoAI与E抗体分离LDL）直接测定LDL-C时出现明显基质效应，血清冰冻保存226周后，L

14、DL-C测定值平均偏低10%左右。 由于新鲜血清与冻干血清的apoAI测定值一致，显示冻干对apoAI测定不产生基质效应，故apoAI参考血清以冻干形式提供。但冻干对apoB有极明显的影响，在不同原理的免疫法中，基质偏差高达-26%+4%，但这种变化也包括apoB分子本身的结构变化在内。所以apoB参考血清是液态冰冻保存的。5.减少基质效应的方法 Naito等（1993年）提出过减少基质效应的研究方向，至今仍有参考价值：改进室间质评样品，使其作用更像新鲜人血清。 改进仪器设计及试剂组成。 选择方法及方法学参数，使其适应性更强，且容易掌握，对制备物（校准物、室间质评样品与质控物）基质的确切性质不

15、敏感。 1#wangboxzzjs 回复于：2008-4-17 9:55:05基质指的是样品中被分析物以外的组分。基质常常对分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性。例如，溶液的离子强度会对分析物活度系数有影响，这些影响和干扰被称为基质效应（matrix effect）。目前最常用的去除基质效应的方法是，通过已知分析物浓度的标准样品，同时尽可能保持样品中基质不变，建立一个校正曲线（calibration curve）。固体样品同样有很强的基质效应，对其校正也尤为重要。对于复杂的或者未知组分基质的影响，可以采用标准添加法（standard addition method）。在这一方法

16、中，需要测量和记录样品的响应值。进一步加入少量的标准溶液，再次记录样品的响应值。理想地说来，标准添加应该增加分析物的浓度1.5到3倍，同时几次添加的溶液也应该保持一致。使用的标准样品的体积应该尽可能小，尽量降低过程中对基质的影响。 3#bigyang 回复于：2008-4-17 13:15:13在LC-MS的基质效应影响的评估中，可以比较实际样品和空白溶剂在1中的响应值。更加一个实际的方法是将被分析物的纯品加入空白基质和纯溶剂中，比较两者的信噪比。如果样品中被分析物浓度已知，则可将分析物加入纯溶剂中，使之达到与样品中分析物的浓度一样。如果样品中分析物浓度未知，或者是纯粹的无分析物的基质无法得到

17、，则可用分析物的同位素内标分别加入到样品和纯溶剂中，比较二者响应差别。通常基质效应可用抑制系数衡量，绝大部分情况下降低信号响应，抑制系数1，少数情况下，也能增强响应信号，此时抑制系数1 4#bigyang 回复于：2008-4-17 13:19:40瞬间离子基体效应 moment ion matrix effect 离子的有效淌度受到周围离子的影响，由其周围离子所形成的包围圈，称为离子基体。如果样品组分从进样点到探测点迁移过程中，在某一时间间隔遇上一个不同组成的基体区带，这个离子基体区带就将对样品组分产生影响，使它们的淌度发生瞬时变化，从而选择性地影响溶质的迁移和分离，这就是瞬时离子基体效应。

18、 5#juju11 回复于：2008-4-17 19:00:43原文由 dickwang2008 发表:各位板油大家好，新一期的【华山论剑】又和大家见面了。本期话题主要就基质效应展开讨论，大家可以就基质效应的定义、基质效应的评价方法、基质效应如何进行系统而准确的评价、如何减少基质效应等方面表述自己的观点和看法，对于原创性的经验或者总结将给予重奖，欢迎积极参与 基质效应产生的原因：一般认为可能源于待测组分与生物样品中的基质成分在雾滴表面离子化过程的竞争 。其竞争结果会显著地降低(离子抑制)或增加(离子增强)目标离子的生成效率及离子强度，进而影响测定结果的精密度和准确度。基质效应的评价：一般是1）

19、用流动相配制高中低三个浓度的待测物，并加入内标，测得响应值； 2）空白血浆提取后加入与1)相同浓度的待测物和内标，测响应值基质效应 ME%=相应值2/相应值1100这样，不同浓度的待测物的基质效应和内标的基质效应均可得到。如果是有机溶剂提取，则很简单，只要把准备作为1）组进样的溶液加到空白血浆提取吹干后的管子里，振荡离心一下进样就可以了，加入的体积就是复溶时的体积；如果时蛋白沉淀，则复杂一些。就是待测物和内标的混合物加入相同体积生物样品基质与其对比的基质后测相应值，前者的结果就是2，需把空白血浆按比例加入沉淀剂，离心后取上清加入即可；后者的结果就是1，只把空白血浆换成水再加入沉淀剂即可。一般基

20、质效应最好做56份（当然越多越好，但是考虑到实际操作，56份比较现实）不同来源的空白基质，这样可以考查待测物在不同基质中的介质效应情况，如果介质效应在不同浓度，不同基质中基本一致，且不影响样品的测定，则个人认为有基质效应也没有关系，因为只要样品在标准曲线和样品中的基质效应一致，则用其定量也是可以的。如果不一致，则最好避免或者减轻基质效应。减轻基质效应的方法主要有：改变前处理方法；改善色谱条件（尽量把峰往后推，保留时间靠前，比较容易受基质效应的影响；如果有切换阀，最好把样品峰出峰前一分钟之前的都切换调）；改用APCI源（ESI源比较容易受基质效应影响）等。 6#sgwu 回复于：2008-4-1

21、9 10:18:59原文由 dickwang2008 发表:各位板油大家好，新一期的【华山论剑】又和大家见面了。本期话题主要就基质效应展开讨论，大家可以就基质效应的定义、基质效应的评价方法、基质效应如何进行系统而准确的评价、如何减少基质效应等方面表述自己的观点和看法，对于原创性的经验或者总结将给予重奖，欢迎积极参与 基质效应也称基体效应，是指样品中共存物质对测量结果的影响。目前使用的各种样品的前处理方法就是为了消除基体效应。具体地说，基体效应包括干扰组分的影响和背景值的影响。干扰组分是必须要分离出去的，而背景值的消除一般是采用标准加入法或基线扣除法。 7#44sbb 回复于：2008-4-19

22、 15:07:47基质效应 1基质（matrix） 尚无统一的解释，曾称为“一种分析物（analyte）的环境（milieu）”，即指标本中除分析物以外的一切组成。以血清胆固醇（Chol）测定而言，就是指Chol以外血清中的一切成分及其物理、化学性质。2.基质效应（matrix effect） 按NCCLS文件的定义，指（1）标本中除分析物以外的其他成分对分析物测定值的影响。（2）基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。广义说来，基质效应也应包括已知的干扰物（如Chol测定中胆红素、血红蛋白、抗坏血酸等都是干扰物），但目前只将基质效应限于生物材料中未知或未定性的物质或因素（如粘度、pH等）的

23、影响。3.基质偏差（matrix bias） 基质效应所致分析结果的偏差称为基质偏差。 用作校准物质或质控物的经过处理的混合血清，由于血清基质的理化性质在处理过程中的改变，在常规测定上往往出现基质偏差。 基质偏差的出现也与分析系统（包括方法、试剂及所用仪器设备）有关，所以有人将基质效应定性为方法、材料与基质的特异性反应。4.制备物（processed material） 用于血脂常规测定的校准液（calibrator）及用于技能对比试验（proficiency test，PT）或室间质量评价（EQA）的样品（如质控血清）。 以Chol测定为例，全酶法测Chol始于1974年，在此以前用化学反应

24、测Chol时，除了一些已知的干扰因素外尚未提及基质效应问题。1979年才由Cooper指出Chol酶法中校准液与病人血清的反应性不同，可使Chol测定值偏低5%7%。 1994年CAP调查570实验室时用了参考方法定值的新鲜冰冻血清为调查材料，15个同方法测定chol组中仍有11个组出现基质偏差，同时用制备物的4个组中，3个有基质偏差。 有的报告指出TG、HDL-C常规方法与CDC的参考方法比较，有明显偏差，甚至10%。 McNamura等发现血清冰冻可在免疫法（用apoAI与E抗体分离LDL）直接测定LDL-C时出现明显基质效应，血清冰冻保存226周后，LDL-C测定值平均偏低10%左右。

25、由于新鲜血清与冻干血清的apoAI测定值一致，显示冻干对apoAI测定不产生基质效应，故apoAI参考血清以冻干形式提供。但冻干对apoB有极明显的影响，在不同原理的免疫法中，基质偏差高达-26%+4%，但这种变化也包括apoB分子本身的结构变化在内。所以apoB参考血清是液态冰冻保存的。5.减少基质效应的方法 Naito等（1993年）提出过减少基质效应的研究方向，至今仍有参考价值：改进室间质评样品，使其作用更像新鲜人血清。 改进仪器设计及试剂组成。 选择方法及方法学参数，使其适应性更强，且容易掌握，对制备物（校准物、室间质评样品与质控物）基质的确切性质不敏感。 8#badbed 回复于：2

26、008-5-4 16:24:02AC上有一篇关于Matrix effext介绍得很详细的文献，作者B. K. Matuszewski等，2003，75，3019-3030，感兴趣的可以下来学习学习。下面谈谈我的理解。随着质谱的普及，生物样品的定量工作开始普遍使用LC/MS/MS进行。质谱的高选择性决定了其作为检测器与紫外的不同非待测物可以不被检测，这就使得高通量成为现实。然而，生物样品中的共流出物并非不存在，它对待测物的离子化的影响仍然存在。简单的说，基质效应就是样品中的共流出物对待测物离子化过程的影响，其原理至今未有定论，目前普遍认为是共流出物与待测物在离子化时存在竞争关系导致引起的。分为离

27、子抑制和离子增强两种。顾名思义，就是会对待测物的离子化有增强和抑制的作用，这肯定会影响待测物的准确定量。评价方法很简单，就是在做method validation时，分别制备回收率样品和基质效应样品，然后比较二者的峰面积，待测物与内标的分别计算。ME=回收率样品峰面积/基质效应样品峰面积*100%85%-115%之间认为不存在基质效应。其中低、中、高浓度各6份，回收率样品就按照正常方法制备，基质效应样品就是把待测物和内标以流动相稀释到对应浓度即可。（回收率样品说起来也能说很多，此处不谈）了解了原理自然就有办法避免基质效应，一句话说来就是调整色谱保留时间。通常来说死时间的基质效应最严重且多为离子

28、抑制，要尽量避免死时间出峰。当然，也不能说避开了死时间就万事大吉。在方法开发阶段，可以做一对回收率样品和基质效应样品在不同色谱条件下考察基质效应。尽量缩短保留时间提高通量，同时避免基质效应。也看文献说ESI源容易产生基质效应而APCI源较好，这个不太好说，我也用APCI做过基质效应较高的化合物。换源的时间还不如拿来优化色谱条件（个人看法）。另外，优化样品预处理方法也可以在一定程度上避免离子抑制，当然也不绝对，色谱条件选好了沉淀蛋白也能做一个好方法。一家之见，欢迎讨论。 9#rodger 回复于：2008-5-6 8:51:18看看今天各大网站上的新闻吧：“近日，上海药物所李川课题组完成了研究项

29、目“液相色谱电解质效应的发现及液-质联用技术分析中药多成分复杂样品方法学研究” ，该项研究首次发现了“液相色谱电解质效应”，即通过添加微量电解质即可大大提高化合物在质谱中的离子化效率和离子化能力，从而增强分析物的质谱响应信号、扩大分析方法的定量范围。正当各大公司都在想方设法通过改造仪器物理结构来提高检测灵敏度，这一发现为痕量分析提供了一种仪器之外的提高检测灵敏度的方法。同时，加入的微量添加剂还可以克服液质联用分析中的基质效应，因而使定量分析结果更稳定、可靠。这对生化、食品、环境分析中的痕量物质的分析有较大影响和参考价值，也在一定程度上丰富了质谱理论。同时，此项研究还首次建立了用超过滤的方法快速

30、简便地分离中药成分在血浆中的游离药物浓度以更好地了解药物的量效关系、揭示其药效物质基础，为更好地进行中药的药效与药代相关性研究建立了桥梁。 该项目获得了2007年度中国中西医结合学会科学技术奖三等奖。中国中西医结合学会科学技术奖是由中国中西医结合学会于2004年设立的奖项，授予在中西医结合基础研究、临床研究和开发研究中有突出成绩的集体和个人。”有哪位战友能了解到比较详细的信息啊，。 10#juju11 回复于：2008-5-6 12:23:49原文由 rodger 发表:看看今天各大网站上的新闻吧：“近日，上海药物所李川课题组完成了研究项目“液相色谱电解质效应的发现及液-质联用技术分析中药多成

31、分复杂样品方法学研究” ，该项研究首次发现了“液相色谱电解质效应”，即通过添加微量电解质即可大大提高化合物在质谱中的离子化效率和离子化能力，从而增强分析物的质谱响应信号、扩大分析方法的定量范围。正当各大公司都在想方设法通过改造仪器物理结构来提高检测灵敏度，这一发现为痕量分析提供了一种仪器之外的提高检测灵敏度的方法。同时，加入的微量添加剂还可以克服液质联用分析中的基质效应，因而使定量分析结果更稳定、可靠。这对生化、食品、环境分析中的痕量物质的分析有较大影响和参考价值，也在一定程度上丰富了质谱理论。同时，此项研究还首次建立了用超过滤的方法快速简便地分离中药成分在血浆中的游离药物浓度以更好地了解药物

32、的量效关系、揭示其药效物质基础，为更好地进行中药的药效与药代相关性研究建立了桥梁。 该项目获得了2007年度中国中西医结合学会科学技术奖三等奖。中国中西医结合学会科学技术奖是由中国中西医结合学会于2004年设立的奖项，授予在中西医结合基础研究、临床研究和开发研究中有突出成绩的集体和个人。”有哪位战友能了解到比较详细的信息啊，。 共同关注！ 11#emoc98311 回复于：2008-5-7 17:08:19基质应该叫除了被测组分以外的成分，基质效应应该是这些成分对被测组分的影响效应 12#rosoooo 回复于：2008-5-22 15:12:53除了建立校准曲線和標準添加外, 還有其他方法嗎

33、? 14#ximeng2007 回复于：2008-7-10 21:53:52从目前文献报道结果看，基质效应主要对ESI离子化方式有显著影响。有关基质效应产生的原因一般认为可能源于待测组分与生物样品中的基质成分在雾滴表面离子化过程中的竞争。由于基质中某些干扰组分的存在会使待测组分离子生成的速度同标准样品相比有显著不同，使得信号响应值产生较大变异。也有人认为基质效应是由于待测组分与基质中内源性物质共洗脱而引起的色谱柱超载所致，这些成分常因在色谱分析中与目标化合物分离不完全或未被检测到而进入质谱后产生基质效应。目前常用的基质效应消除方法有（简单提及）：1：选择合适的样品制备方法，这是最有效的消除基质

34、效应影响的方法，值得注意的是，对于不同的样品制备方法，不能简单地说某种方法优于另一种方法，由于每种组分对基质效应的敏感度不同，其适宜采用的样品制备方法也不同，要通过实验来确定。2：改善色谱分析条件：采用反相色谱分离，适当地增加待测组分的保留时间；减少进样体积；3：优化质谱分析条件：在允许的条件下改变离子化方式；4：选择内标。如何减少基质效应2011-5-31 来源：上海雅吉生物科技有限公司 进入该公司展台 基质效应(matrixeffect)是指：标本中除分析物以外的其它成分对分析物测定值的影响；基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。广义来说，基质效应也应包括已知的干扰物(胆红素、血红蛋白

35、、抗坏血酸等干扰物)，但目前只将基质效应限于生物材料中未知或未定性的物质或因素(如粘度、pH等)的影响。减少基质效应的主要措施包括： 1、改进室间质评样品，使其作用更像新鲜人血清； 2、改进仪器设计及试剂组成； 3、选择方法及方法学参数，使其适应性更强，且容易掌握，对制备物(校准物、室间质评样品与质控物)基质的确切性质不敏感。 王达 二、目前国际上公认的测定葡萄糖参考方法是什么？与其它常用检测方法比较，有何优越性？ 目前国际上公认的测定葡萄糖参考方法是己糖激酶-UV法(HK-UV法)，其测定原理是： 标本中的葡萄糖在ATP的存在下，由己糖激酶的作用生成6-磷酸葡萄糖(G-6-P)，G-6-P又

36、在6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PDH)的作用下，并且在氧化型(NADP)的存在下，转变成6-磷酸葡萄糖酸，此时在波长330350nm(或采用主波长330350nm，副波长405800nm的双波长测定法)下测定生成的还原型(NADPH)的增加量，求出葡萄糖浓度。 参考值 血清：3.35.6 mmol/L(60100 mg/dL) 与常用的葡萄糖氧化酶法(GOD法)比较，其优越性主要表现在： 葡萄糖氧化酶法(SOD法)特异性催化-D-葡萄糖。而葡萄糖和构型各占36%和64%，要使葡萄糖完全反应，必须使-葡萄糖变旋为-构型。国外某些商品试剂中含有变旋酶，可加速变旋过程。也可通过延长孵育时间，自发性

37、变旋完成转化。结果的准确性必然受到影响。 SOD法中，第二步过氧化物酶反应特异性低，一些还原性物质，如尿酸、维生素C、胆红素、血红蛋白、四环素和谷胱甘肽等，可与色原性物质竞争H2O2 ，从而消耗反应过程中所产生的H2O2，产生竞争性抑制，使测定结果偏低。 己糖激酶法是目前国际上公认的测定葡萄糖参考方法，该法通常用终点法测定，反应迅速，适合于各种生化分析仪。 己糖激酶法基本不受溶血、脂血、黄疸、尿酸、维生素C及药物的干扰，其准确度和精密度相对较高。 三、血清碱性磷酸酶(ALP)测定的常用方法有几种，它们之间有何差别？ 正常成人血清ALP主要来自肝脏，而来自骨组织的ALP一般少于总活性一 半。其各

38、自含量与年龄密切相关，但也受性别的影响。还可能存在少量的小肠型ALP，特别是血型为分泌型B型或O型的人。 现已知人体含4型ALP同工酶，即肠型(IALP)、胎盘型(PALP)、生殖细胞型(GALP)和非特异组织型(TUALP)ALP。其中非特异组织型碱性磷酸酶在基因表达后经过不同的修饰形成肝、肾、骨等次级同工酶。 临床意义 肝胆疾病，尤其是阻塞性黄疸患者，该酶活性显著升高。骨骼疾病时血清ALP活性增高。血清ALP活性测定成为鉴别肝胆疾病和诊断骨质增生不可缺少的指标。 测定原理 在碱性条件下，碱性磷酸酶将无色磷酸对硝基苯酚水解为黄色对硝基苯酚，在 405nm测定对硝基苯酚生成的速率，这个速率与血

39、清中ALP活性成正比。反应需要Mg2+作为激活剂。 常用测定方法 测定ALP活性受到组织来源、底物类型、反应温度，特别是缓冲液种类的影 响，目前，世界范围内生化试剂主要生产厂家，生产的ALP检测试剂盒的主要差异就在于所使用的缓冲液不同。常用的激活型缓冲液不仅起缓冲作用，并可作为磷酸的受体参与反应，因而能增进酶促反应的速率。激活型缓冲液中，二乙醇胺(DEA)的激活作用比2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)的激活作用更强。文章链接：中国化工仪器网 LC/MS 中的基质效应（matrix effect）; x2 6 p7 o. a8 T4 y _. Z/ E6 b- p4 t& l: O/ f1

40、基质（matrix） 尚无统一的解释，曾称为“一种分析物（analyte）的环境（milieu）”，即指标本中除分析物以外的一切组成。以血清胆固醇（Chol）测定而言，就是指Chol以外血清中的一切成分及其物理、化学性质。! 3 _% z, A8 i( b( _: o+ p0 9 F/ S) D) c f2.基质效应（matrix effect） 按NCCLS文件的定义，指* l2 e7 r ?: _+ W( CV2 T r（1）标本中除分析物以外的其他成分对分析物测定值的影响。4 , j1 G f B+ M x! nz（2）基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。广义说来，基质效应也应包括

41、已知的干扰物（如Chol测定中胆红素、血红蛋白、抗坏血酸等都是干扰物），但目前只将基质效应限于生物材料中未知或未定性的物质或因素（如粘度、pH等）的影响。; X- b3 A0 Z; |# a( 6 h- i* w+ O d. n* e3.基质偏差（matrix bias） 基质效应所致分析结果的偏差称为基质偏差。 用作校准物质或质控物的经过处理的混合血清，由于血清基质的理化性质在处理过程中的改变，在常规测定上往往出现基质偏差。 基质偏差的出现也与分析系统（包括方法、试剂及所用仪器设备）有关，所以有人将基质效应定性为方法、材料与基质的特异性反应。, f+ q/ |- m9 Q i8 f$ B*

42、# j0 H3 L1 # G4.制备物（processed material） 用于血脂常规测定的校准液（calibrator）及用于技能对比试验（proficiency test，PT）或室间质量评价（EQA）的样品（如质控血清）。 以Chol测定为例，全酶法测Chol始于1974年，在此以前用化学反应测Chol时，除了一些已知的干扰因素外尚未提及基质效应问题。1979年才由Cooper指出Chol酶法中校准液与病人血清的反应性不同，可使Chol测定值偏低5%7%。 1994年CAP调查570实验室时用了参考方法定值的新鲜冰冻血清为调查材料，15个同方法测定chol组中仍有11个组出现基质偏

43、差，同时用制备物的4个组中，3个有基质偏差。 有的报告指出TG、HDL-C常规方法与CDC的参考方法比较，有明显偏差，甚至>10%。McNamura等发现血清冰冻可在免疫法（用apoAI与E抗体分离LDL）直接测定LDL-C时出现明显基质效应，血清冰冻保存226周后，LDL-C测定值平均偏低10%左右。 由于新鲜血清与冻干血清的apoAI测定值一致，显示冻干对apoAI测定不产生基质效应，故apoAI参考血清以冻干形式提供。但冻干对apoB有极明显的影响，在不同原理的免疫法中，基质偏差高达-26%+4%，但这种变化也包括apoB分子本身的结构变化在内。所以apoB参考血清是液态冰冻保存的

44、。- V4 b( * U* f4 q6 a7 ?& G7 e5。减少基质效应的方法 ： Naito等（1993年）提出过减少基质效应的研究方向，至今仍有参考价值：改进室间质评样品，使其作用更像新鲜人血清。 改进仪器设计及试剂组成。 选择方法及方法学参数，使其适应性更强，且容易掌握，对制备物（校准物、室间质评样品与质控物）基质的确切性质不敏感。7 : y: ; J& V( Y1 u W3 c+ BY) G+ y) r& j4 D+ v! c( t( i瞬间离子基体效应 moment ion matrix effect 离子的有效淌度受到周围离子的影响，由其周围离子所形成的包围圈，称为离子基体。如

45、果样品组分从进样点到探测点迁移过程中，在某一时间间隔遇上一个不同组成的基体区带，这个离子基体区带就将对样品组分产生影响，使它们的淌度发生瞬时变化，从而选择性地影响溶质的迁移和分离，这就是瞬时离子基体效应。液质联用技术中基质效应的评价方法1. 前言 在人体生物等效性或临床药代动力学试验中，液质联用（LC/MS，LC/MSn）技术被广泛用于生物样品中药物及其代谢物浓度的检测。液质联用技术具有高灵敏度和高特异性的显著特点，研究者往往会认为采用该技术可以简化或者省去样品的前处理和色谱分离步骤。但由于质谱检测是基于化合物离子化并通过特定的核质比来检测和定量，因此任何干扰待测物离子化的物质都可能影响检测方

46、法的灵敏度和选择性，即引入了基质效应（Matrix Effect，ME）的概念。基质效应是指在样品测试过程中，由待测物以外的其他物质的存在，直接或间接影响待测物响应的现象1。由于质谱检测的高选择性，基质效应的影响在色谱图上往往观察不到，即空白基质色谱图表现为一条直线，但这些共流出组分会改变待测物的离子化效率，引起对待测物检测信号的抑制或提高。这些基质成分包含了生物样品中的内源性成分和样品前处理过程中引入的外源性成分。内源性组分包括无机盐或者胆汁中的有机盐、各种有机化合物（糖类、胺类、尿素、类脂类、肽类）和分析目标物的同类物及其代谢物。外源性组分尽管在生物样品中不存在，但同样会产生基质效应，包括

47、处理样品的塑料管中残留的聚合物、离子对试剂、有机酸、缓冲液、SPE柱材料、抗凝管中的抗凝剂如EDTA或肝素锂等2。FDA在生物分析方法建立的指导原则中明确提出对于基于LC/MSn的方法，在整个分析过程中需通过适当的方法减少基质效应的影响，从而保证方法的灵敏度和选择性1；EMEA在生物分析方法的验证指导原则（草案）中更加细化了基质效应的评判标准3。2. 评价方法 目前评价基质效应的方法主要有两种：（1）柱后灌注法（Post-column infusion method）和（2）提取后加入法（Post-extraction spiking method）4,5。其中柱后灌注法能直观的显示基质效应对

48、被测物色谱保留时间的影响范围和影响程度，适合在色谱方法筛选过程中评估基质效应的影响情况，为色谱条件的优化提供信息。而提取后加入法不仅能量化绝对基质效应的程度，也能提供相对基质效应的数据，因此广泛运用于方法学验证过程。2.1 柱后灌注法（Post-column infusion method）4 柱后灌注法属于动态分析基质效应的方法，将针泵及液相色谱系统通过T型进样阀与质谱仪相连。将空白样品按待测样品的处理方法提取后，利用待测样品的洗脱条件通过HPLC进行色谱洗脱，同时用针泵将特定浓度的被测物以恒定速度注入，两种溶液一并通过T型进样阀进入质谱仪，进行待测物离子信号强度检测。被测物信号响应的变化将

49、直接反应生物基质对于被测物的影响，同时信号强度随时间的变化关系也有助于色谱条件的优化。2.2 提取后加入法（Post-extraction spiking method） 提取后加入法在评定LC-MSn基质效应中使用的最多，而且，此法还可用于评价绝对基质效应（absolute ME，基质效应影响分析的程度）和相对基质效应（relative ME，样品间基质效应大小的差异）。2.2.1 绝对基质效应的评价5 利用下述方法制备两组待测样品。 Set 1：将被测物溶于非生物基质的空白溶液，如：配制成甲醇、乙腈等标准溶液。 Set 2：提取空白生物基质，浓缩复溶形成溶液，将被测物加入此溶液中。 将上述

50、Set1和Set2样品引入LC/MSn系统进行分析，获得待测物和内标的信号强度，其中待测物或内标在Set2和Set1中信号强度的比值(Set2/Set1)为绝对基质效应，可以用基质效应因子(matrix factor，MF)来表示，待测物与内标MF的比值称为内标归一化基质效应因子(IS-normalized MF)3。绝对基质效应结果主要影响分析方法的准确度。2.2.2 相对基质效应的评价3 相对基质效应大小可以用IS-normalized MF的变异系数(CV)来判断。具体步骤如下：选择至少六个不同来源的生物基质，利用2.2.1方法测定上述生物基质中待测物和内标的MF（待测物浓度通常选择一个

51、低浓度即可，其浓度应在3LLOQ以内），并计算内标归一化基质效应因子，利用获得的6个内标归一化基质效应因子计算变异系数，其值应小于15%。 如果由于某些特殊情况比如全自动在线样品处理、收集和测定过程，无法中断程序按照上述流程制备得到set1和set2，则需要考察待测物和内标在不同生物样品（至少6个不同个体的来源）中响应强度的差异，以此来证明基质效应对于未知生物样本的测定结果影响可以忽略。具体步骤如下：(1)利用至少6个不同来源的生物样品制备一定浓度（3LLOQ以内）的待测标准品（每个生物样品同时至少制备3份）；(2)按正常样品测试方法测定这些待测标准品的浓度；(3)计算精密度（CV表示）和准确

52、度，其中CV应小于15%；而准确度平均值的偏差应在15%以内，对任何样品，如果其准确度偏差超过20%则需要额外考察并判断原因。 对于方法验证而言，相对基质效应的结果直接影响方法的准确度和精密度，较绝对基质效应更为重要，因此EMEA在生物分析方法的验证指导原则（草案）中并没有就绝对基质效应作出限制标准，而是要求6份内标归一化基质效应因子的CV15%。不过需要注意的是如果绝对基质效应影响过大，通常会表示基质对于方法的影响很大，往往导致精密度的实验结果不符合要求，因此在方法建立之初，如果条件允许，应尽可能降低绝对基质效应。3. 克服基质效应的方法克服基质效应的方法包括下面几种：(1)选择合适的样品预

53、处理方法：常用的样品的处理方法包括蛋白沉淀，液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）。通常 利用LLE或 SPE制备的样品内源性杂质较少，有助于降低绝对基质效应。但样品前处理过程的复杂会降低分析检测的效率，增加污染的风险，并可能带来待测组分的损失，也直接影响待测组分的提取回收率。因此在样品制备方法的选择中要兼顾基质效应和提取回收率两方面的因素，选择合适的样品制备方法。(2)改变被测物的色谱分离条件：即通过优化色谱分离条件使得内源性杂质与待测物分离。采用反相色谱法分离时，最初流出的主要是基质中的极性成分，而这些极性成分往往是引起基质效应的主要原因。当待测组分的色谱保留时间较短时（3min），其受基

54、质效应影响较大。因此，改善色谱分析条件，适当地延长待测组分的保留时间（但要兼顾样品运行时间延长带来的峰展宽、灵敏度下降的问题），有利于减少基质对测定的影响。(3)采用性质相近或稳定同位素内标：如果绝对基质效应影响较大，但内标和被测物的绝对基质效应接近，仍可认为方法可行。但需注意的是，如果绝对基质效应太大，通常会造成方法的变异很大。而且当多个分析物同时检测时，由于存在极性差异，即使是同类物的同位素内标也很难抵消基质效应，从而造成定量结果偏差。因此在方法建立的初期，仍建议采取可行的方法降低绝对基质效应。(4)采用小进样量。在保证灵敏度的情况下，采用小进样体积，可以适当降低基质效应。由于自动进样器的

55、广泛应用，目前即使很小的进样体积也能实现良好的进样精密度。(5)利用液相色谱电解质效应（LC-electrolyte effects）：利用在流动相中添加极少量不同的有机酸/碱促进待测物离子化，从而减少基质效应的影响。(6)使用较低的流速：在LC/MS中，尤其是使用ESI离子源时，较低的流速可以使同时离子化的化合物减少，降低了待测成分与基质成分在电离过程中的竞争，从而减弱基质效应。(7)改用不同的离子源：目前用于定量的离子源主要是电喷雾离子源（ESI）和大气压化学离子源（APCI），通常ESI对于基质效应的敏感程度要高于APCI。对于特定的化合物，特别是对于蛋白质沉淀法处理的样品，若采用ESI

56、有明显的基质效应，更换成APCI源或大气压光离子源（APPI）可能是一种简单易行的方法。4. 结论 液质联用技术对生物样品分析造成的影响是个复杂的问题，受到化合物本身、生物基质、样品前处理过程、色谱条件和不同离子化模式等因素的影响，对于它的控制标准目前除EMEA的生物分析方法的验证指导原则（草案）较明确外，FDA、SFDA还没有明确一致的指导意见，然而在临床试验中对生物样品进行绝对基质效应和相对基质效应的考察将会是一个趋势。 本文仅就基质效应评价的方法及如何消除或减小基质效应进行了简单的讨论，希望引起国内临床研究单位加强对生物样品分析过程中基质效应问题的重视，有意识的在研究中积累实验数据，从而进一步提高分析检测结果的准确度和精密度。