临床荧光PCR结果分析及常见问题

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1、临床荧光PCR结果分析及常见问题 中国人民解放军三零二医院 王海滨 一、荧光 PCR 技术在临床诊、疗中的应用 PCR 技术是于 1983 年由 Mullis 发明，后来传到我国，但是由于实验污染的问题， 1998 年卫生部取缔 PCR 实验方法在临床诊断中的应用。荧光 PCR 出现后，污染减少很多，但近几年由于磁珠的应用，污染又再起。 2003 年， PCR 在 SARS 的早期诊断中非常有效，当时使用的是电泳法。 H1N1 甲型流感（ 2009 ）：荧光 PCR 技术作为确诊指标（ 755 份 / 天）。疾病易感基因的研究（ SNP ）： CR1/ 丙型肝炎 IL-28B 。疾病（肿瘤）易

2、感基因的鉴定。 二、影响临床荧光 PCR 检测结果的因素 （一）影响临床荧光 PCR 检测结果的常见因素 1. 检验因素： 实验室硬件、仪器、试剂、人员素质、技术水平、管理水平。 2. 非检验因素： 标本采集、质量、部位、标本保存、条件、时间、标本中的干扰物质、样本丢失！ （二） 加强检测前标本的质量管理避免问题重复发生 规范标本前处理流程、制度化的重要性，建立不合格标本记录和定期总结制度、制定解决措施与可行路径（编号和项目错误等），查找标本丢失可能的环节。加强本室新进工作人员流程培训，经常性进行临床医护的交流与培训。 （三） 实验室分区 分为：试剂配制、核酸提取、 PCR 扩增以及开放产物分

3、析等区域。 分区目的：通过物理分割达到标本、试剂或使用器具等被沾染或掺入污染，标本间的交叉污染等。 分区要求：至少要有清洁的试剂配制和核酸制备区 三、试剂配制 （一）试剂配制室的设置与维护 以空间内无核酸气溶胶为准！ 1 正压、清洁进风 ( 壁挂式空调 ) 。 试剂冰箱内勿存放病原或核酸相关物品！定期清洁除霜！ 2 有效氯消毒液清洁实验室台面、地面。 3 移液器：使用前的清洁。 4 离心机等：每周定期木浆纸巾擦拭，方法。“一次性物品的使用 - 从 COBAS 的“浪费”中找到均衡！ （二）试剂配制注意事项 试剂配制实际是简单的问题，但是也是非常复杂的环节。 1. 何时配制？如何配制！ 在核酸制

4、备好后再进行试剂配制，注意反复冻溶对试剂质量的影响，以及久配不用试剂对检测的影响 ( 如 hot-TaqE) 。 2. 如何避免荧光淬灭？ 避免在强光下配制，采用有效氯消毒液后应进行通风或清水擦拭，勿在紫外灯下配制。 3. 交叉污染的避免 试剂与核酸何者先加更合理？ 试剂分配中的问题：过吸、残滴（第一孔）。 热盖不能完全阻止蒸发，石蜡油，盖、膜、离心。 （三）试剂配制环境对检测的影响 PPT8 显示的是试剂配制环境对检测的影响，左边的图，是实验室在装修的时候用了一些油漆，在那个环境里面配制的试剂。右边的图，是在无油漆环境下配制的。可以看到左边的图结果很差。 （四）核酸制备 冻存标本使用前要混匀

5、离心后使用；不同类型标本：血清、血浆、细胞、组织、乳汁、痰液、尿液等；标本核酸提取前后的保存；提取后核酸的保存（稳定性）；核酸提取标本加入量与核酸得率的关系！ 1+1 与 2 的关系；指示剂的引入，可以降低差错率。 PPT10 显示的是指示剂在一管法的应用，可以看到上面蓝色的是核酸提取液，非常清楚，降低了差错。 四、 荧光 PCR 扩增 （一）实验室怎么建？ 独立区域、负压通风、物品专用： 1. 实验室清洁用品的专用的重要性。 2. 扩增产物的处理（ PCR 管加盖、封膜、石蜡油），用两层封口袋包装后焚烧（如 PPT12 图）。产物的处理必须由专业工作人员或经过培训的工作人员处理。禁止未经培训

6、的研究生、实习生和进修生进入区域对扩增产物进行操作。 3. 仪器清洁处理程序：载板区先用 70% 乙醇清洁。该区所有垃圾需封闭运输并销毁。 4. 地面和空气处理原则。 （二） 荧光 PCR 仪器如何选择？ PCR 实验室的仪器非常多有几十种，应按照实验的要求不同来进行选择。 （三）荧光 PCR 仪器如何维护？ 荧光 PCR 仪器的功能模块分为三个： 1. 温度模块 包含最基本的升降温。要保证温度模块的均一性，既不能有边缘效应，也不能有局部温度的影响。 2. 光学模块 即测光系统， PCR 反应的过程中每一个循环都要测一次光，测光不论是照相还是扫描，都有一定的差别，光学模块的敏感性要高。 3.

7、软件模块 荧光信号采集以后，要用软件模块来进行分析。分析不但要人性化，而且还要准确，不能有故障。 （四）荧光 PCR 扩增循环数量的选择（ 60:50:40cycles ） COBASTAQMAN 用的是 60 个循环，早期是 40 个循环，近几年的荧光 PCR 试剂，循环数有所增加，如丙肝增加到 45 个循环，乙肝 42 个循环。 PPT16 显示的是实验室的图，扩增的循环数量是 40 个。 （五）质控品的设立 - 没有质控就没有质量保证 对一个完整的实验，一定要注意有空白对照，阴性对照与临界对照，临界对照是对精密度的考核。另外，有平行定量标准品。如果试验测的是血清，质控标准品也应该是血清，

8、而不是人造核酸。 质控品在结果报告中的应用非常重要： 1. 空白对照 一般放在第一孔的位置，监控扩增试剂及环境污染。 2. 阴性对照 第二孔位置，监控核酸提取，试剂是否污染，可自行制备。 3. 临界对照 实验室自行制作，是实验精确度需求。 4. 等效定量标准品 中间位置或最后，实验准确性前提，参与核酸提取，标准范围宽。 （六）质控品的制作 HBVDNA ：介质的选择、临界质控的制作： 400IU/ML-50IU/ML ； HCVRNA ：介质的选择、临界质控的制作： 3000IU/ML-100IU/ML ； EBVDNA/CMVDNA/H1N1/HPV 等定性试剂盒的质控，阳性标本，稳定性实验

9、；质控品的朔源： WHO 标准或 COBAS 等；自建质控品：建立数据记录（稳定性等）；室间质控与室内质控的有机结合！ （七） HBVDNA 结果分析（质控在控与失控） HBVDNA 结果分析，就是荧光曲线的分析，要尽可能保证报告的数值，低限值和高于低限值的线要平行，尽可能不要失控。 临界质控品： 400IU/ml ；基线的选择：平均荧光值的 3-7% ；斜率：保持在 3.0-3.6( 均值 3.3) ；相关系数： r=0.999 。 1.COBAS 定量内标 (QS) 的失控 PPT21 显示的是 COBAS 定量内标失控的情况。 2. 不同定量区域 QS 值分布 PPT22 显示的是不同定

10、量区域 QS 的分布，例数是 900 多例。如果内标出现了失控，定量值就无法参考了。 3. 假阴性曲线的识别 在荧光 PCR 曲线里面，如果有荧光曲线是阴性、不规则的，要考虑是不是有干扰物质，在试剂配制或者标本里边有干扰物质。此时需要复检。 五、实验室人员（与职称和学历无关） （一）实验室人员分类 1. 实习型： 按照操作说明进行操作，但环节控制、环节间衔接和防污染意识差！ 2. 工作型： 能够再现说明书操作要求，具有质量环节控制意识，具有一定的防污染常识，但发现问题和解决问题能力稍差。 3. 示教型： 明晰试验操作的关键环节，并能够对下级工作人员进行演示和示教，具有完整的防污染意识、质量实现

11、和一定的发现问题解决问题能力。 4. 专家型： 能对商品试剂盒存在的问题进行改进，具有提前预知的质量意识。 （二）移液器的使用 移液器的使用，是小问题，大学问。 1. 移液器加吸头的要点，需慢慢压，不能用力压。 2. 不同量程移液器的应用要点（液体性质）。 3. 移液器连续分液挂滴对实验的影响。 4. 如何避免移液器连续分液导致的污染。 5. 移液器吹打混匀带来的污染！ 6. 移液器的清洗，需要高压吗？ 7. 移液器的校准，很多单位无法实现。 （三）质量环节意识的培养（轮流当主任） 1. 环节控制能力 质量环节的认知：明晰实验操作环节的组成和目的！ 关键环节的实现：细节的严谨性与准确性！ 环节

12、的连贯性与细节实现：实现完整实验！ 2. 防污染素质 实验室环境防污染意识：具备科学防污染清洁意识和实现能力，如标本外溢的处理、实验室环境（空气、桌面、地面、移液器等）清洁，实验废物的管理和处理，离心机的清洁和维护等。标本间交叉污染的预防意识和实现能力：避免移液过程中的隐形迸溅污染（移液器）；试剂加样过程中的沾染污染；标准品的携带污染等。扩增产物的外露污染：产物回流预防能力；产物处理流程。 （四）人员的培养与专业技能比对 不同职务、职称和学历人员同时进行；环节操作与结果同时计分；比对结果记录在案并作为评聘指标。 六、试剂盒的质量与评价 （一）评价标准：抗干扰 - 理论值与实际值的吻合。 1.

13、特异性：不同血清型对特异性的影响，抗污染性能和污染试剂 2. 敏感性：血清量、加样量对敏感性的影响（ 1+1=2 ？） , 试剂系统的组成与敏感性 : 引物、探针序列的选择与用量，跨栏式试剂： 10 9 -10 2 IU/ml 应处在线性范围内、且均存在荧光信号的上平台。 3. 重复性：取决于核酸提取方法与扩增效率。 （二）关于临界检测结果的漂移 例如，本场检测的时候，一个病人，一次检测是 53IU ，一次是 20IU ，这都是漂移，这个技术方法性能本身，是正常的和合理的。但这种漂移的原因，是试剂盒核酸提取的稳定性问题。 七、关于内标 （一）实时荧光定量 PCR 无需内标 实时荧光定量 PCR

14、 技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在软件之中，通过对每个样品 Ct 值的计算，根据标准曲线获得定量结果。 1.Ct 值的重现性： PCR 循环在到达 Ct 值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此 Ct 值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的 Ct 值是恒定的。 2.Ct 值与起始模板的线性关系： 由于 Ct 值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量 PCR 是一种采用外标准与标本同步进行核酸提取的曲线定量方法。 （二

15、）内标对实时荧光定量 PCR 的影响 若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则 PCR 反应变为双重 PCR ，双重 PCR 反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。正因如此，定量方法虽然加入内标，仍为一种半定量方法。 美国 Texas 大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。 AppliedBiosystems 公司的 7700

16、型实时荧光定量 PCR 仪是全球公认的荧光定量 PCR 的金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量检测仍然采用外标准曲线的方法，而不用内标进行定量。 （三）内标对 PCR 扩增的影响 PPT34 显示的是内标对 PCR 扩增的影响。 左图，可以看到加入内标后线性范围变窄，无内标线性范围较宽。 右图，无内标时是直线，有内标后，变成曲线。 个人建议：试剂盒在报批时，或使用单位对试剂盒质量进行评估时，使用内标对试剂盒性能进行评价！检定：正如 ELISA 试剂盒的批批检！ 八、如何就分子诊断结果与临床和患者沟通？ 医生和患者，都会对检验结果提出一些质疑。质量、速度应该还是个硬道理，应该权威的结果加虚心的请教。