动物分子遗传育种学第4章课件

（自1982以来）已成功：小鼠、大鼠、兔、猪、绵羊、山羊、牛、鸡、鱼等多种转基因动物。第一节第一节动物转基因技术的理论基础动物转基因技术的理论基础 染色体交换与基因转移：联会转座子基因组内转基因（自然产生）生物界的这些现象及其发现是转基因动物得以产生的一个基础。物种进化与基因表达调空：物种进化产生多种物种重要基因高的保守性表达调空机制相似或相同被转基因成功表达 生物界的这些现象及其发现是转基因动物得以产生的又一基础。基因组研究与分子克隆：基因组计划遗传图物理图转录图序列图DNA重组及克隆转基因动物 这些技术的产生和发展是转基因动物得以产生的主要基础。转基因的表达特征：（1）时空特异性表达（2）可控性表达（3）共抑制性（当转基因和内源基因存 在同源关系时，二者的表达均受到抑 制，其原因极其复杂，目前尚未完全 清楚）（4）沉默现象 原因：a.整和在不适当的部位。b.被受体细胞识别为异己DNA 后将其甲基化而失活。c.转基因本身构建不恰当，而 无法转录表达。转基因动物的成功率受精卵（开始）转基因动物 子代（结束）总成功率：阳性动物子代数 待转基因受精卵数不同动物的转基因成功率动物转基因的技术：（1）上游技术：是指利用分子遗传学和分子生物学技术进行基因改造，载体构建，最后组装成转基因单位的一系列方法技术。（2）中游技术：包括外源基因导入受体细胞、胚胎移植、转基因动物的繁育建系等。（3）下游技术：是指转基因的整和表达情况的检测。下游技术的检测方法：（1）在染色体和DNA水平上：a.Southern 杂交 b.PCR扩增 c.荧光原位杂交（2）在 mRNA水平上：a.Nouthern blot杂交b.RT-PCR扩增（3）在Pr水平上：Western blot杂交。（4）表型水平上：检测转基因动物在生长速度、抗病性、产品质量等方面与原来动物有无差异。第二节第二节转基因动物的研究方法转基因动物的研究方法转基因动物的常用方法：（1）显微注射法（2）逆转录病毒法（3）胚胎干细胞法（4）精子载体法显微注射法：外源基因构建准备受精卵显微注射胚胎移植转基因检测 优点：（1）安全（无病毒基因组序列）（2）转移率高（整合率达30%）（3）相对较短周期内可得到纯合体缺点：（1）设备昂贵，所需技术性很强。（2）转基因的拷贝数无法控制，通 常为多拷贝，最多可达几百个 （3）通常在插入点引起突变（重组、缺失）造成动物生理缺陷显微注射法：逆转录病毒法：逆转录病毒：是一种整合性的单链RNA病毒。该方法就是将外源基因重新组合在逆转录病毒载上，然后在去感染着床前或着床后的胚胎，将外源基因导入动物细胞内，是目前开展动物转基因研究中最有效的方法一。优点:（1）整合率高。（2）单位点、单拷贝。（3）插入位点的克隆分析较容易。缺点:（1）逆转录病毒容量小，转移片段一般 小于 10kb，故被转入基因通常无调 空序列。（2）病毒基因组有可能与外源基因一起整 合到受体细胞染色体上，造成转基因 动物的污染，限制了其在商业转基因 动物中的应用。逆转录病毒法：胚胎胚胎干细胞干细胞法法 通过显微注射法或逆转录病毒法将外源基因引入到ES细胞内，使外源基因整合到ES基因组内某一非必需基因位点上,再对 ES细胞进行筛选鉴定和培养扩增,用于生产转基因动物.优点:(1)外源基因整合与表达可以在干细 胞中检 测.(2)可以对外源基因进行定点整合.缺点:需要经过多代的选育,才能得到纯合 的转基因动物,这对牛、羊等产仔数 少，世代间隔长的大动物来讲是很困 难的。胚胎干细胞法胚胎干细胞法精子载体法精子载体法 利用精子作为转移外源基因的载体，通过受精将外源基因带入卵细胞，并整合在染色体上的一种方法。实际上很早以前，人们就已发现，通过受精过程，精子可以将外源基因带入卵细胞。但到目前为止，人们尚不清楚这种过程的确切机制。不过这并不影响精子载体法在转基因动物研究中的应用。精子与外源基因结合的部位：（1）精子的整个头部区域。（2）精子的头前区域。（3）精子的头后区域。该种结合一般不出现在精子的尾部。影响精子与外源基因结合的因素：（1）外源基因的大小（大优于小）。（2）精子头部的特异性蛋白质（有促进）（3）清洗精子（有促进）外源基因的存在方式：（1）整合到受体细胞的染色体上。（2）外源基因以附加体的形式存在（易丢失，但通过设计增加自主复制序列可以稳定存在，并正确表达而得到转基因动物）。优点：（1）方法简单实用，只通过人工受精 就可生产转基因动物。（2）以附加体形式得到的转基因动物 在理论上可以不受受体基因组的 影响，以达到特异性表达精子载体法精子载体法第三节第三节转基因动物育种现状转基因动物育种现状转基因动物育种包括两个方面：（1）常规性转基因动物育种：直接转入高产基因（低产 高产）。（2）动物生物反应器（乳腺、血液等）。常规性转基因动物育种：在国内外均开展了相关技术的研究。例如：转入人GH基因的猪在生长速度、饲料利用率、胴体瘦肉率方面有了明显的改善。但转基因普遍体质下降，表现出病态现象，特别是胃病、关节病明显增加。因此，如用常规性转基因动物培育新的动物品种尚需做很多基础性研究工作。绵羊和鱼:这两种动物的转基因个体没有发现健康和繁殖性能方面的异常，大有希望培育新品种应用于畜牧业生产中。列外:非常规转基因动物育种（动物生物反器）：动物生物反应器的出现生物技术领域和畜牧业的一次革命，具有重要而深远的意义。畜产品工业产品 目前发展最快的是动物乳腺生物反应器，用来生产药用蛋白或酶蛋白，是一种全新的生产模式，其优越性：（1）动物乳腺是一个封闭系统，可避免外源基因表达产物对动物健康造成的危害。（2）乳腺组织对外源表达产物进行正确的加工和修饰，使其具有天然产品相似的生物活性。（3）在乳腺中表达的目的基因可以遗传（可扩繁）利用动物生物反应器生产产品时，不同动物其开发利用价值差异极大。故在选择转基因动物时，需考虑如下因素：（1）世代间隔（2）产仔数（3）抗病力（4）饲养成本（5）目的基因产 物的多少不同转基因动物开发利用价值比较及评价转基因动物中存在的主要问题：（1）外源基因的整合率和总成功率低，已经整合的外源基因易于丢失，遗传率也低。（2）外源基因的表达不理想。（3）外源基因常导致受体动物基因突变或功能紊乱。转基因动物的育种前景：目前，人们在转基因动物育种中，已经取得了一定的经济效益。特别是非常规性的转基因动物育种中。动物生物反应器投资相对少，效益大，无公害。荷兰的Genpharm公司（1990）培育的带有人LF的转基因奶牛，制造婴儿奶粉的年产值达50亿美元。英国的PPL公司（1991）培育的带有人抗胰蛋白酶基因的转基因山羊羊奶，每升售价6000美元。美国DNA公司（1991）培育的带有人Hb转基因猪，年产20万单位人Hb，产值达5000万美元。例如：因此，人们把转基因动物称为“分子农场”。在常规的转基因动物育种中也出现了一些问题，但我们完全有理由相信，在不久的将来，它会给畜牧业生产带来一次革命性的变化。