实验1 动物组织总RNA的制备及检测

《实验1 动物组织总RNA的制备及检测》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验1 动物组织总RNA的制备及检测（4页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、实验1 动物组织总RNA的制备及检测实验目的：使学生掌握从动物新鲜组织，采用Trizol抽提法制备总RNA的实验技术，以及用紫外分光光 度法检测RNA的纯度及定量、用琼脂糖电泳法检测RNA的完整性及质量。实验原理：Trizol是一种新型的总RNA即用型制备试剂，适用于从各种组织或细胞中快速分离总RNA。 Trizol内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。Trizol,在样品裂解或 匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。 取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA。Trizol。Trizol试剂可用于小量样品（50lOOmg

2、组织、5x106细胞），也可用于大量样品（三lg组织或三 107个细胞），对人、动物、植物和细菌、血液提取都适用，可同时处理大量不同样品。一个小时内 即可完成反应，提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，可用于Northern blot、RT-PCR、Dot blot、 RNase 保护分析等。实验材料：l 、 器械处理1 .用于RT-PCR的玻璃器皿常规洗净后，在烤箱内180C干烤10h。2 .所有塑料器材（如Eppendorf管、Tips吸头、PCR薄壁管）均为新购产品，使用前用0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）浸泡12h，高压消毒、烘干。3 .用于提取RNA的氯仿、异丙醇均为新包装。4 .7

3、5%的乙醇由25ml 0.1% DEPC水与75ml无水乙醇混匀配制而成，4C保存。2、 试剂配制1 .0.1% DEPC水：1ml DEPC加入900ml双蒸水，定容至1000ml混匀，室温密封保存。2 . 无 RNase 水：0.1% DEPC 水，37C过夜，高压 20min,去除 DEPC。3 . 5xTBE 缓冲液：0.45M Tris硼酸，0.01 M EDTA。配制：54g Tris，27g 硼酸，20ml 0.5MEDTA （pH8.0）,用双蒸水或无RNase水定容至1000ml，室温保存，用时10x稀释。4 .琼脂糖（agarose）：5 . Trizol 试剂：6 . 6

4、 x凝胶载样缓冲液：0.25%溴芬蓝，0.25%二甲苯青FF, 40% （w/v）蔗糖实验步骤：1、动物组织获取1 .小鼠颈椎脱臼处死。2 .迅速分离肝脏组织样品。肝脏组织样品可立即用于制备RNA或超低温（-80C或液氮中）保存。3 . 将 lg 肝脏组织在液氮预冷的研钵中用研杵研磨，期间不断加入液氮。直至研磨成粉末状（无明显可见的颗粒，如果没有研磨彻底，会影响RNA的收率和质量）。4 .液氮挥发，将组织粉末一点一点地加入盛有 10 倍体积 Trizol 的玻璃匀浆器中。 每50-100 mg组织加1ml的Trizol （从1-10 mg的少量的组织中分离RNA样品，往组织中 加入 800 “

5、 Trizol）。5 .将匀浆器（glass-Teflon）置于冰浴中进行匀浆（匀浆化时组织样品容积不能超过Trizol容积的 10%）。直至匀浆液呈无颗粒透明状。6.将匀浆液转移到离心管中，室温静置5min （以使核蛋白体完全分解）。.12,000xg 4C离心力离心5min （台式离心机最大能达到2,600xg的离心力，如果将离心 时间延长到 30-60min 也可以满足操作）。8. 小心吸取上清液体，转移到新的离心管中。切勿吸取沉淀，沉淀中包含有细胞外膜，多 糖，以及高分子量DNA。在匀化后和加入氯仿之前，样品可以在-60-70C保存至少一 个月。注意：RNA在TRIzol试剂中不会被R

6、Nase污染，但在氯仿分相后的上清中已经没有了 RNase 的抑制剂，所以分相后的所有操作要特别小心，保证使用的离心管和枪头都是 RNase-free 的。2、RNA 提取过程1 .细胞变性：提取目的细胞RNA。取干预好的细胞，倒掉培养液，直接于培养瓶（50ml）中加入冰PBS （4C）小心冲洗 细胞3遍，然后加入1ml Trizol试剂，用移液器反复抽吸78次，至液体澄清且无细胞 团块。将悬液移入一经DEPC水处理过的无RNA酶的eppendorf管内，颠倒混匀10下， 于1530 C下孵育5min。2 .分相：加入0.2ml氯仿，盖紧盖子，用力震荡15s，1530C温育15min。在4C下

7、12000g离心15min；将液体分三层，其中上层为水样RNA层，约60%体积。注意：RNA在TRIzol试剂中不会被RNase污染，但在氯仿分相后的上清中已经没有了 RNase 的抑制剂，所以分相后的所有操作要特别小心，保证使用的离心管和枪头都是 RNase-free 的。3 .沉淀RNA：将上层水相RNA小心移入一新的eppendorf管，加入0.5ml异丙醇，充分混匀，于1530C温育10min,在4C下12000g离心10min,隐约可见白色小丸状沉淀。4 .洗涤RNA：弃上清，注意防止沉淀丢失，加1ml无RNase的75%乙醇混匀，轻弹管壁使沉淀分散（RNA沉淀溶于75%的乙醇在2-

8、8C至少可以保存一周，在-5-20C下至少 可保存一年。）。4C7500g离心5min。小心弃上清，室温干燥5min （勿全干，否则RNA 难溶）。5 .溶解RNA：加0.1%灭菌的无RNase水20卩1, 5560C温育10min以完全溶解RNA，瞬时离心，取5卩l进行鉴定，余-70C冻存备用。3、RNA 浓度及纯度1 . 预热紫外分光光度计并调制好各项参数；2 . 用无RNase水1000山 调零。3 . 取RNA样品1山加入无RNase水1000山，混匀。4 .读取 D260、OD280 值；5 .以OD260/OD崗的值判断RNA纯度。RNA的Ratio应均在1.7以上，才表明提取的R

9、NA260 280 较纯，没有蛋白质混入。6 .根据稀释情况得出实际的RNA浓度，反复操作取平均值。RNA浓度计算公式为：RNA浓度=OD260x40卩g/mlx稀释倍数。每1mg肝组织预期的RNA产量为6-10聘。4、RNA 的完整性检测采用水平式琼脂糖凝胶电泳。1 . 组装制胶膜：A. 电泳槽去污剂洗净后乙醇干燥B. 再依次经3%双氧水和0.1% DEPC水浸泡冲洗后列为RNA专用电泳槽；C. 组装制胶膜；调节点样梳，调节梳齿与胶膜底面的距离，保持0.51.0mm。2 . 制备琼脂糖凝胶A.配胶：0.5XTBE （无RNase水稀释）缓冲液制备1.2%的琼脂糖凝胶； 称取0.16g琼脂糖溶

10、于20ml 0.5XTBE溶液中，加热完全溶解，待冷却至60C 左右加入1卩l （10mg/ml）溴化乙锭（EB）溶液，摇匀，倒入插好样品梳的 水平电泳槽制胶板中，胶凝固30min后拔出梳子，将胶板置于电泳槽中，加 入0.5XTBE溶液，使液面高于胶面1mm备用。B. 倒胶：凝胶冷却至60C左右（手感容器能耐受），在凝胶中加入EB至终浓度为 0.5yg/m 1,摇匀后到入制胶膜中，厚度5mm左右，避免产生气泡；C. 凝胶条件：在室温下放置 20-30min；3 .加电泳缓冲液（0.5XTBE缓冲液）：高出凝胶表面1mm；4 . 拔梳子。5 .加样：混合3卩1 RNA与2卩1上样缓冲液，混匀，点

11、样。6 .电泳：100V,电泳30min,用凝胶照相系统观察凝胶，用分析软件对RNA条带进行密度扫描分析。完整的RNA 28S与18S荧光强度比为2:1。注意事项：注意：用 Trizol 抽提 RNA 时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操 作。避免呼吸道吸入。如无例外，所有操作应该在15 -30C的条件下完成，试剂亦在15 -30C的条 件下。1、防止 RNA 酶污染的措施：1 .所有的玻璃器皿均应在使用前于180C的高温下干烤6hr或更长时间。2 .塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用）。3 . 有机玻璃的电泳槽

12、等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2室温10min,然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。4 .配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37C处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经 0.22gm滤膜过滤除菌。5 . 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6 .设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。7 . DEPC能与胺和巯基反应，因而 含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理8 .加样原则是DNA最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探

13、针有多管的话只是DNA不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混 合均匀之后再分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染。9 . 普通实验室容易污染，且污染程度很高，与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系，最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。因此要格外 注意一些。2、常用的RNA酶抑制剂：1 . DEPC:是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。2 . 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的 RNA 酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使 RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中

14、解离出来，又对RNA酶有强烈的变性 作用。3 .氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4 . RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5 .其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。因为DEPc不加选择的修 饰蛋白质和RNA,因此在分离和纯化RNA过程中不能使用，而且它与一些缓冲液（例 如Tri）不能相容在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失 败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。3、确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法：1 .按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中，并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 “的总体积，然后密闭管盖。2 .把其中一份放入70C的恒温水浴中，保温1 h。另一份放置在-20C冰箱中保存1 h。3 . 取出两份样本进行电泳。4 . 电泳完成后，比较两者的电泳条带。5 .如果两者的条带一致或者无明显差别，则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70C保温的样本有明显的降解，贝I说明RNA溶液中有 RNA 酶污染。示例结果：