基因工程知识总结 好

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1、选修三专题一基因工程1 基因工程的工具1.1 几种酶的比较限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶DNA水解酶作用对象DNA分子两个DNA片段之间单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上DNA分子的两 条链之间DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对之间的氢键磷酸二酯键作用产生黏性末形成重组形成新的DNA分形成单链DNA形成游离的结果端或平末端DNA分子子分子脱氧核苷酸注：限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 限制酶是一类酶，而不是一种酶。 DNA连接酶发挥作用时，不需要模板，而DNA聚合酶则需要模板，二者不同。1.2 确定限制酶种类的方

2、法1.2.1 单酶切及筛选 若用同一种限制酶切割质粒和目的基因形成相同的四个黏性末端，因而可能出现多种连接方 式。如:质粒和质粒；目的基因和目的基因；质粒的自身环化，目的基因的自身连接; 质粒与目的基因的连接。质粒与目的基因的连接又会出现正向连接和反向连接两种，目的 基因与质粒的反向连接则导致目的基因不能成功表达。1.2.2 双酶切及筛选因为用单酶切会出现质粒与目的基因的任意连接，所以在实际操作中多使用双酶切。双酶切 可以避免质粒的自身环化，目的基因的自身连接和目的基因和质粒的反向连接，而目的基因 与目的基因的连接因为没有抗生素抗性基因（标记基因）所以可以在含有该抗生素的培养基 上去除，故只剩

3、下质粒与质粒，以及质粒与目的基因的重组质粒。1.2.3 具体方法PstISmal图甲PstI Smal PstlEcoRl图乙s爲抗病基因eLrI1(1) 根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstI。 不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Smalo 为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质 粒，如图甲也可选择用Pst I和EcoR I两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。(2) 根据质粒的特点确定限制酶的种类 所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性

4、末端。 质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙 中限制酶SmaI会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能丢失某些 片段，若丢失的片段含复制原点，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。【例题】图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp I、BamH I、Mbo I、Sma I 4 种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C ( CGG、G ( GATCC、/ GATC、CCC ； GGGo请回答下列问题：8W0质粒5如叩国抗电虾抗件早因H的屈因D IIIGGATCCGGAICC丁| IT匚T CCCGGGCCT

5、AGGGGGCCC CCTA；Gi ： I I F I I I I Tlrl III. I I I I I I I I I I I 746 bp若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选 用的限制酶是o在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一 般需要用添加的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌 菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是o【解析】：限制酶BamH I不能识别限制酶Mbo I的识别序列，但限制酶Mbo I可识别BamH I的识别序列，两种限制酶不能相互替代。质粒中的两种抗生素抗性基因具有标记作用。如 果同时在两种抗

6、生素抗性基因内部切割，则该基因的功能丧失，从而失去标记功能。所以用 限制酶切割后的质粒应至少保留一个抗性基因。但用同种限制酶切割目的基因和质粒还有一 些其他的缺陷，即使基因表达载体成功导入受体细胞，目的基因也不一定能成功表达，由于 目的基因和质粒的四个黏性末端都相同，所以不排除目的基因与载体之间的反向连接，目的 基因不能成功表达。【答案】 BamH I 抗生素 B同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接1.3载体1.3.1载体的作用：作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内；利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。1.3.2载体的作用条件 ： 能在宿主细胞内稳定存在并大量复

7、制。 有一个至多个限制酶切割位点，以便与一个或多个外源基因相连。 具有特殊的标记基因，便于重组DNA的鉴定和选择。1.3.3常用类型：质粒（其中大肠杆菌的质粒最常用）、动植物病毒、久噬菌体的衍生物。2.基因工程的基本操作步骤2.1 目的基因的获取 2.1.1目的基因的概念：目的基因主要是指编码蛋白质的基因。2.1.2目的基因的获取方法:从基因文库中获取：基因文库包括基因组文库和cDNA文库。 人工合成目的基因：已知核苷酸序列较小的基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成； 或以 RNA 为模板，在逆转录酶的作用下人工合成（反转录法）。 通过PCR技术扩增目的基因。目的是通过指数扩增获取大量的目

8、的基因。2.2 基因表达载体的构建 2.2.1目的：目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代，并使目的基因表达和 发挥作用。2.2.2基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：目的基因，启动子，终止子和标记基因 等。（标记基因要完整）注：启动子和终止子位于DNA分子上，启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位是转录 开始的信号，终止子是RNA聚合酶脱离部位是转录结束的信号；起始密码子和终止密码子 位于mRNA上，分别是翻译开始和结束的信号。目的基因的表达需要启动子和终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子和终止子之 间。2.2.3 基因表达载体中启动子、终止子的来源（1）如果目的基因是从自然

9、界中已有的物种中分离出来的，在构建基因表达载体时，不需要 在质粒上目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子，因为目的基因中已含有启动子、终 止子。（2）如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启 动子和终止子的。若只将基因的编码序列导入受体生物中，目的基因没有启动子、终止子， 是无法转录的，因此，在构建基因表达载体时，需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后 端接上特定的启动子、终止子。2.3 将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2+处理法受体细胞体细胞（或受精卵）受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入Ti

10、 质粒的T-DNA上，通 过农杆菌一导入植物 细胞一整合到受体细 胞的染色体DNA上 一表达将含目的基因的基因 表达载体提纯一取受 精卵一显微注射入受 精卵一受精卵发育一 获得具有新性状的动 物用Ca2+处理细胞一感 受态细胞一重组表达 载体DNA分子与感 受态细胞混合一感受 态细胞主动吸收DNA分子注：将目的基因导入植物受体细胞时，若需要考虑基因污染，则需将目的基因导入叶绿体 中。将目的基因导入到植物细胞的其他方法：花粉管通道法、基因枪法。2.4 目的基因的检测与鉴定（1）分子水平检测 检测目的基因是否导入：DNA分子杂交技术（DNA探针与转基因生物DNA杂交），观 察是否出现杂交带。 检测

11、目的基因是否转录：分子杂交技术QNA探针与转基因生物mRNA杂交），观察是 否出现杂交带。 检测目的基因是否翻译：抗原抗体杂交，观察是否出现杂交带。（ 2）个体水平鉴定生物性状的表现与否一目的基因是否表达 注：基因工程操作过程中只有第三步（将目的基因导入受体细胞）没有碱基互补配对现象。3 基因工程的应用和发展3.1 植物基因工程 培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质3.2 动物基因工程 提高动物生长速度来提高动物生产产量；改善产品品质；用转基因动物生产药物；转基因动 物做器官移植的供体等。注：乳腺生物反应器：使外源基因在哺乳动物的乳腺中特异性表达，利用动

12、物的乳腺组织生 产药物蛋白。需要将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起。3.3 基因治疗 把正常基因导入病人体内，使其表达产物发挥作用，从而治疗疾病，分为体内基因治疗和体 外基因治疗。基因治疗对原来细胞中存在的缺陷基因没有清除或改变。3.4 基因诊断又称DNA诊断，是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。4 蛋白质工程4.1 概念：以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因 合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活需求。4.2 基本途径：从预期蛋白质的功能出发推测应有的氨基酸序列推测基因中相对应

13、的脱氧核苷酸序列合成具有预期功能的蛋白质5 PCR 技术(多聚酶链式反应)5.1 PCR的概念:PCR技术是体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的DNA为模板， 在几小时内复制出上百万份的 DNA 拷贝。5.2 PCR原理：DNA分子在一定条件下可以进行半保留复制。DNA的热变性原理：在 80100C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性；当温 度缓慢下降后，两条被分离开的DNA链又会重新结合成双链，这个过程称为复性。5.3 PCR的反应条件(1) 稳定的缓冲液环境：维持反应的PH值不变(2) DNA 模板： DNA 母链(3) 分别与模板DNA两条模板链相结

14、合的两种引物：使DNA聚合酶从引物的3端开始连接 脱氧核苷酸(DNA聚合酶的特点：不能从头合成DNA，而只能从3端延伸DNA链，因此， DNA复制需要引物，为DNA聚合酶提供3端)(4) 合成子链的原料:四种游离的脱氧核苷酸(5) 热稳定DNA聚合酶，(Taq酶)：催化合成DNA子链5.4 PCR扩增方向(1) 3端和5端：为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基末端称为3端， 而含磷酸基团的末端称为5末端；一个双链的DNA分子中含有两个3末端和两个5末 端，如果一条链的方向是3 5,则另一条链的方向就是5 3，这就是反向平行的 含义。(2) DNA分子中相邻两个脱氧核苷酸残基通过3,5

15、磷酸二酯键相连，该化学键由一分子脱 氧核苷酸中3号碳原子上的羟基，与相邻的另一分子脱氧核苷酸中的5号碳原子上的磷酸基 团脱水聚合而成。所以DNA合成的方向总是从子链的5端到3端。5.5 PCR过程(1) 高温变性：当温度上升到90C以上时，DNA解旋为单链1丨1丨丨丨I IIIHI I I丨MlI III丨丨门I丨I IIIIIII I I 951变性I! I I I I W I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I W I I I I I I I I11 L I丄1 1 L丄丄1 11 I I丄l丄丄丄丄1 1 L I丄1 11 I丄I 1 II

16、 L I丄1(2) 低温复性：温度下降到55C左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合, 形成局部双链。lllllllllliymmim】 |门引物3，7巒”111111111111丨1111111 i 1111 丨 1111 丁1111 丨丨 IT(3) 中温延伸：温度上升到72C左右，在热稳定DNA聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷 酸为原料，根据碱基互补配对原则，从引物的5端一3端延伸合成与模板互补的DNA链。5.6 PCR 的结果PCR 的每一轮循环包括高温变性，低温复性，中温延伸三步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物I延伸而成的DNA单链会与引物I

17、I结合，进行 DNA延伸，这样，DNA聚合酶只能特异的复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固 定长度的DNA序列成指数扩增。5.7 PCR技术与DNA复制的比较PCR技术DNA复制场所体外细胞内原理半保留复制半保留复制模板一段目的DNA片段整个DNA分子原料四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸酶热稳定DNA聚合酶(Taq酶)解旋酶，DNA聚合酶条件能量热能（PCR仪控制温度）ATP引物单链DNA片段RNA片段其他缓冲液，Mg2+，无菌操作胞内环境过程高温变性一低温复性一中温延伸解旋一复制一重新螺旋结果快速复制目的DNA复制DNA （速度较慢）注：PCR技术最突出的优点是快速、高效、灵活、易于操作。

18、【经典例题】1. 据图所示，有关工具酶功能的叙述不正确的是（）A. 限制性核酸内切酶可以切断a处B. DNA聚合酶可以连接a处C. 解旋酶可以使b处解开D. DNA连接酶可以连接c处【解析】：据图分析，其中a是磷酸二酯键（相邻两个脱氧核苷酸间），b是氢键，c是磷 酸二酯键（脱氧核苷酸内）。限制酶能够破坏相邻两个脱氧核苷酸间的磷酸二酯键， DNA 连接酶和DNA聚合酶催化磷酸二酯键的形成，解旋酶能够使氢键断裂。限制酶能切割a （相邻两个脱氧核苷酸间的磷酸二酯键），A正确；DNA聚合酶能将单个的脱氧核苷酸连接到DNA片段上，形成a （磷酸二酯键），B正确； 解旋酶作用于b （氢键），C正确DNA连

19、接酶作用于相邻两个脱氧核苷酸间的磷酸二酯键（a处），而不是脱氧核苷酸内的 磷酸二酯键（c处），D错误【答案】： D2甲图示DNA决定某一多肽链中的酪氨酸和丙氨酸过程示意图，乙图示样品DNA经PCR 技术（聚合酶链式反应）扩增，可以获取大量DNA克隆分子。分析回答：甲图中含有种核苷酸；丙氨酸的遗传密码子。该图表示了 DNA中遗传信息的过程。（2）有一种贫血症是血红蛋白分子的一条多肽链上，一个酪氨酸被一个苯丙氨酸所替代造成 的。此种贫血症的根本原因 ，即发生了改变。乙图的“PCR，与人体内的DNA复制相比有何特殊之处？现在要通过“PCR”得到甲图中DNA片段的1024个克隆片段，则至少要向试管中加

20、入 个腺嘌吟脱氧核苷酸。【解析】：分析题图：甲图为基因表达的过程，包括转录和翻译，乙图为样品DNA经PCR 技术扩增，获得大量DNA克隆分子的过程，其中A为高温变性，B为低温复性，C为中温 延伸。（1）甲图共有五种碱基，8种核苷酸（脱氧核苷酸4种，核糖核苷酸4种），包括DNA中 的4种脱氧核苷酸和RNA中的4种核糖核苷酸。遗传密码子指位于mRNA 上,编码一个氨 基酸的3个相邻的碱基，据甲图可知，丙氨酸的密码子应为GCC，甲图表示DNA中的遗传 信息的转录和翻译的过程。（2）根据题意说明控制该多肽合成的基因发生了碱基的替换（只有一个氨基酸发生改变） 故，此种贫血的根本原因是基因突变。（3）乙图

21、为PCR技术，与细胞内复制相比，特殊之处为离体条件，需要高温，需要热稳定 DNA 聚合酶（即 Taq 酶）（4）甲图中的DNA片段含有3个腺嘌吟脱氧核苷酸，得到1024个克隆片段，相当于新 和成1023个DNA片段，所以共需要腺嘌吟脱氧核苷酸1023X3=3069【答案】：（1）8 GCC转录和翻译（2）基因突变DNA的碱基序列（或基因结构）（3）离体条件，需要高温，高温酶（Taq酶）（答两个即可）（4）3069 3.某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr 表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHI酶切

22、后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混 合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三 种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。 回答下列问题：答出两点即可）。1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是；并且的细胞也是不能区分的，其原因是。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目

23、的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有的固体培养基。（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于【解析】（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有：能够自我复制、具有 标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点等。（2）依题意可知，目的基因插入后，导致四环素抗性基因（Tetr ）失活，而氨苄青霉素抗 性基因（Ampr）仍能行使正常功能。如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四 种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞，因二者均不含氨苄青霉素抗 性基因，在该培养基上都不能生长，所以是不能区分的；含有质粒载体和含有插入了目的基

24、因的重组质粒的细胞，因二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都能生长，因此也是 不能区分的。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的 单菌落，还需使用含有四环素的固体培养基；因目的基因插入后，导致四环素抗性基因（Tetr ）失活，含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌在该培养基中不能生长，而含 有质粒载体的则能正常生长。（3）噬菌体是专门寄生在细菌细胞内的病毒，在侵染细菌时，噬菌体的DNA进入细菌细 胞内，而蛋白质外壳留在细胞外，在噬菌体DNA的指导下，利用细菌细胞内的各种物质来 合成噬菌体的组成成分，进而组装，释放。所以基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为 载

25、体，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞【答案】（1）能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点（答出两点 即可）（2）二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒） 二者都含氨苄青霉素抗性基因， 在该培养基上均能生长四环素（3）受体细胞4.图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了 EcoR I、BamH I和Sau3A I三种限制性内切 酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体示意图（载体上的EcoR I、Sau3A I的 切点是唯一的）。GAATTCGGATCCCTTAAGCCTAGGT TGATC图

26、(a)启动子jScoRI刃终止子复制原点抗生素抗性基因根据基因工程的有关知识，回答(1)经 BamH I 酶1得到的目的基因可以与上述表达载体被酶切后的产物连接，理由是（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图（c）所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有【解析】（1）由于限制酶Sau3A I与BamH I切割后产生的片段具有相同的黏性末端，所以经BamH I酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3A I酶切后的产物连接。（2）启动子是一段有特殊序列的DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRN

27、A，最终获得所需要的蛋白质。终止子也是一段有特殊结构的DNA短片段，相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停止下来，在基因表达载体中，启 动子应位于基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，也就是说目的基因要插入到启动子 和终止子之间，这样目的基因才能表达。而甲中目的基因插入在启动子上游，丙中目的基因 插入在终止子下游，两者的目的基因均不能转录，也就不能表达出目的基因的产物。(3)常见的DNA连接酶有己coliDNA连接酶 和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是t4dna连接酶【答案】(l)Sau3Al 两种梅切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2) 甲和丙甲中目的基因插

28、入在启动子的上游， 丙中目的基因插入在终止子的下游，两者目的基因均不能转录(3) EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶【练习】1. PCR 过程与细胞内的 DNA 复制过程相比，主要有两点不同，它们是() PCR过程需要的引物是人工合成的DNA单链 PCR过程不需要DNA聚合酶 PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的 PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制A. B.C. D.【答案】 B2. PCR仪实质上是一台自动调控温度的仪器，它调控不同温度的目的是() 95C，使DNA分子变性，失去生物活性 95 C，使DNA分子

29、变性，解开螺旋 55 C，使DNA分子开始复制、延伸 55C，使DNA分子恢复双螺旋结构，恢复活性 72C，使DNA分子开始复制、延伸 72C，使DNA分子恢复双螺旋结构，恢复活性A.B.C.D.【答案】 C3. 植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关，若从该植物中获得该耐旱基因， 并将其转移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。回答下列问题：(1) 理论上，基因组文库含有生物的基因；而cDNA文库含有生物的基因。(2) 若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因组文库，再从中出所需的耐旱基因。(3) 将耐旱基因导入农杆菌，并通过农杆菌转化法将其导入植物的体细胞中，经过

30、一系列的过程得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测此再 生植株中该基因的，如果检测结果呈阳性，再在田间试验中检测植株的是否得到提高。（4）假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为3:1 时，则可推测该耐旱基因整合到了（填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”）。【答案】（1）全部 部分（2）筛选（3）乙 表达产物耐旱性（4）同源染色体的一条上4. 在基因工程中，把选出的目的基因（共 1000 个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸460 个）放入PCR仪中扩增4代，那么，在PCR仪中放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数至少应是 A640B8100C600D8640【答案】B5对禽流感的确诊，先用PCR技术将标本基因大量扩增，然后利用基因探针，测知待测标 本与探针核酸的碱基异同。下图P表示禽流感病毒探针基因在凝胶的电泳标记位置，M、N、 Q、 W 是四份送检样品在测定后的电泳标记位置， 哪份标本最有可能确诊为禽流感 （）答案】 CPMNQ wL. MB. -NC. QDW