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1、CRISPR-Cas系统基因修饰技术,1 CRISPR-Cas概述,1987年，日本大阪大学（Osaka University）在对一种细菌编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的两端还存在一段不太长的特有的序列。 2013以后，研究者们在包括science和nature biotechnology等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确的基因修饰。,1 CRISPR-Cas概述,CRISPR-
2、Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。,CRISPR-Cas主要由两部分组成：,识别,切割,1 CRISPR-Cas概述,1.1 CRISPR结构,CRISPR： （clustered regularly interspaced short palindromic repeats） CRISPR 是一个特殊的DNA重复序列家族, 广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats) 组成, 重复序列的长度通常 2148 bp, 重复序列之间被 2672 bp 间隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通
3、过这些间隔序列（space）与靶基因进行识别。,1.1 CRISPR结构,1.2 Cas家族,Cas（CRISPR associated）： 存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。,2 CRISPR-Cas系统的发现,CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。,2 CRISPR-Cas系统的发现,2 CRISPR-Cas系统的发现,2 CRISPR-Cas系统的发现,CR
4、ISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫, 而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了CRISPR 介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由CRISPR 间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列（spacer）来实现的。,2 CRISPR-Cas系统靶向要求,最主要的要求： PAM（protospacer-adjacent motif）为NGG。,2 CRISPR-Cas系统靶向要求,在人类基因组中，平均每8bp就出现一个NGG PAM。,2 CRISPR-Cas系统靶向要求,3 CRISPR-Cas系
5、统介导基因修饰,3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换,2013年1月29日在nature biotechnology上发表的RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems一文中，作者利用CRISPR-Cas系统用设计好的DNA模板替换的相应基因来达到基因的定向修饰。,3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换,3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰,2013年1月29日在nature biotechnology上发表的efficient genome editing in zebra fish
6、 using a CRISPR-Cas system一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进行修饰。,3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰,3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰,3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰,Cas9,sg-RNA,2013年2月15日在science上发表的Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems一文中，作者利用一个包含两个靶向不同基因的spacers的crRNA实现了同时对两个基因进行编辑。,3.3 cr-RNA：Cas介导双基因修饰,3.3 cr
7、-RNA：Cas介导双基因修饰,4 CRISPR-Cas系统前景分析,这是一项靶向基因修饰的革新技术，一项极具有可能获得诺贝尔奖技术。,4 CRISPR-Cas系统前景分析,2013年4月12日在cell stem cell上发表的Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs一文中，作者利用TALENs和CRISPRs对同一基因进行修饰，效率分别为0%-34%和51%-79%。,4 CRISPR-Cas系统前景分析,而且从实际应用的角
8、度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。,4 CRISPR-Cas系统前景分析,只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。 编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构建TALENs和ZFNs更简单方便。 较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复的TALENs编码载体带来的并发症。,技术优势,1987年，当时有一个科研小组观察到，在细菌编码的一个基因末端有一段非常奇怪的重复序列。 越来越多的生物学家们开始从事微生物基因组的解析工作，这时他们也都发现了这种奇怪的
9、现象 在大约40%的细菌和90%的古细菌（archaea）中都能够观察到这种现象，于是科学家们给这种序列取了一个名字，叫作CRISPR，即成簇的、规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）。 在2005年，有3个生物信息学课题组报道称，这些 CRISPR序列里的空格DNA总是能够与噬菌体的 DNA序列互补、匹配 美国马里兰州美国国家癌症生物技术信息中心的Eugene Koonin等人提出了一个新想法，即细菌和古细菌能够吸收噬菌体的DNA，然后将其留作己用，并转录出相应的RNA，与入侵的外源DNA
10、结合，这有点类似于真核生物采用的RNA干扰（RNA interference, RNAi）机制。 Danisco公司的研究人员 Rodolphe Barrangou、Philippe Horvath等人在2007年发现，他们只要对嗜热链球菌进行一番遗传学改造，插入或者去掉几个与噬菌体序列互补的空格DNA片段，就可以改变细菌对噬菌体的免疫力。,发现历史,Doudna和Emmanuelle Charpentier则分别把工作往前推进了一步,依赖Cas9蛋白的CRISPR系统要比其它 CRISPR系统更简单。 Doudna和Charpentier的课题组都必须证明，他们能够非常精确地控制Cas9蛋白
11、的切割位点，确保不会发生脱靶的情况。 Doudna的博士后Martin Jinek提出了将tracrRNA和空格 RNA组合起来，形成一个所谓的“向导RNA分子（single-guide RNA）”的想法，并且他们课题组已经在去年成功地构建出了好几个这种向导RNA，而且将其与Cas9蛋白混合在一起，成功地对特定的DNA位点进行了切割（Science , 17 August 2012, p. 816）。,十年前，科学家们开发出了锌指核酸酶（zinc finger nucleases），该蛋白拥有两个人工组合在一起的结构域，它可以依靠其中的 DNA结合结构域（DNA-binding domains
12、）结合到基因组中特定的位点上，然后再依靠其中的酶切结构域将该位点的DNA链切断。该技术诞生之后也掀起了一股热潮，甚至有人成立了公司，专门以该技术为平台开发艾滋病治疗手段（Science , 23 December 2005，p. 1894）。,锌指核酸酶,最近又出现了另外一种基因组改造工具，那就是TALEN人工核酸酶，这是一种比锌指核酸酶更方便的基因组定向改造工具，并且有可能会彻底取代锌指核酸酶（Science, 14 December 2012, p. 1408）。,TALEN人工核酸酶,CRISPR系统是以 RNA作为基因组定位工具，而锌指核酸酶和 TALEN核酸酶则都是以人工开发的特异性 DNA位点结合蛋白作为基因组定位工具。 合成RNA要比合成蛋白质容易得多，用CRISPR技术只需要几个星期就可以拿到确定的实验结果，可人工核酸酶技术至少需要好几个月。”,几者之间的区别,
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