基因工程引物设计-lhyppt课件

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1、,引物设计 之浅谈,PCR过程,内容,引物设计的原则 Primer premier 5.0的使用 植物表达载体引物设计 原核表达载体引物设计 酵母表达载体引物设计,一、引物设计的原则,引物长度,一般为15-30个核苷酸. 在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。,同一碱基连续出现不应超过5个 GC含量一般40-60% GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性 GC含量太高也易于引发非特异扩增。,碱基分布的均衡性,引物Tm值,一般要求：55-65。 计算： 对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A

2、+T)来粗略估算 对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。 Tm = H/( S + R * ln (C/4) + 16.6 log (K+/(1 + 0.7 K+) - 273.15,引物二级结构,引物二聚体 尽可能避免两个引物分子之间3端有较多碱基互补 发夹结构 尤其是要避免引物3端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。,引物3端,引物的延伸从3端开始，因此3端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。 3端的末位碱基会导致不同的错配机率,引

3、物5端,引物5端可以有与模板DNA不配对碱基，在5端引入一段非模板依赖性序列。 5端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5端加上适当数量的保护碱基）。 5端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。 5端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。,总结,1、长度为15-30bp 2、避免有聚嘌呤或聚嘧啶，尤其是端 3、Tm值：55-65 4、避免二级结构 5、3端末位为TG（C）A,二、引物设计软件,Primer Premier 5.0 生物软件网购买 下载，安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU改为vspace=PU，并将其改成只读，

4、便可以使用全部功能。,三、植物表达载体构建引物设计,设计引物步骤,1、对基因进行酶切位点分析 2、选择适当的表达载体及酶切位点 3、根据上、下游序列设计引物,举例,lipid transfer protein ATGGCAGGCTCTTCCGCCCTGTTCAAGCTCGCTTGCTTAGTTGCCGCGTTCATGATTGTATCTGCGCCACATGCAGAAGCTGCCATATCATGCGGTACCGTCGTCTCAAAGCTCGCCCCATGCCTCGGCTTTCTCAGGGGCGGCGGTTCCCCACCACCTGCTTGTTGTAGTGGGATTAGAAACCTTCAAAGCATG

5、GCTAGGAGTACACCCGATCGTCAAGCTGCTTGCGGGTGCTTGAAGTCTGCTTCGGCTGGTGTTAATATGCGTAATGCTGCCGCTCTTCCCGGTAAATGTGGTGTGAACATCGGTTACCCAATCAGCAGGAGCGTTGACTGCTCCAGGGTGAAGTGA,Enzymes that do not cut: ApaLI, ApoI, AscI, AseI, AsiSI, AvaI, AvaII, AvrII, BamHI, BanII, BbeI, BbsI,BbvCI, BceAI, BcgI, BcgI, BciVI, BclI, Bf

6、rBI, BglI, BglII, BlpI, Bme1580I, BmrI, BmtI, BplI, BpmI, Bpu10I, BpuEI, BsaI, BsaAI, BsaBI, BsaHI, BsaWI, BsaXI, BseRI, BseYI, BsgI, BsiHKAI, BsiWI, BsmI, BsmFI, Bsp1286I, BspEI, EcoICRI, Eco57MI, EcoNI, EcoO109I, EcoRI, EcoRV, FalI, FokI, FseI, FspI, FspAI,HaeII, HaeIII, HgaI, Hin4I, Hin4I, HincII

7、, HindIII, HinfI, HpaI, HpaII, HphI,Hpy188I, HpyCH4IV, KasI, MaeIII, MfeI, MluI, MlyI, MmeI, MscI, MseI, MslI, NaeI, NarI, NciI, NcoI, NdeI, NgoMIV, NheI, NotI, NruI, NsiI, PacI, PciI, PleI, PmeI, PmlI, PpiI, PpiI, PpuMI, PshAI, PsiI, PspGI, PspOMI, PsrI, PsrI, PstI PvuII, RsrII, SacI, SacII, SalI,

8、SanDI, Sau96I, SbfI, ScaI, ScrFI, SexAI, SfcI, SfiI, SfoI, SgrAI, SmaI, SmlI, SnaBI, SpeI, SphI, SrfI, SspI, StuI, StyI,StyD4I, SwaI, TaiI, TaqI, TaqII, TaqII, TfiI, Tsp45I, Tsp509I, TspGWI, Tth111I, XbaI, XcmI, XhoI, XmaI, XmnI, ZraI,植物表达载体pROK,确定酶切位点 BamH:GGA TCC Sac ：GAGCTC,同时在正链上设计3端及5端引物,上游：5-A

9、TGGCAGGCTCTTCCGCCCT-3 下游: -ACTGCTCCAGGGTGAAGTGA- 加酶切位点： BamH: L 5-GGA TCCATGGCAGGCTCTTCCGCCCT SacI： R 5-ACTGCTCCAGGGTGAAGTGAGAGCTC,加保护碱基（酶的边际效应）： L-5TAC GGA TCCATGGCAGGCTCTTCCGCCCT3 R-3 ACTGCTCCAGGGTGAAGTGAGAGCTC GTAC5 最后引物序列： L：5-GTAC GGA TCCATGGCAGGCTCTTCCGCCCT R： 5- GTACGAGCTCTCACTTCACCCTGGAGCAGT

10、,原核表达载体引物设计,原核表达载体特点,原核表达载体（举例） pGEX-4T-2 系列原核表达载体携带谷胱甘肽S转移酶GST基因,编码蛋白分子量26.0kD ,若外源片段正确插入载体pGEX多克隆位点后将表达GST融合蛋白。 pET28a 特点是在外源蛋白的端可编码6个组氨酸残基,6个组氨酸对表达蛋白的活性和结构影响很少,但由于组氨酸的咪唑环能与金属Ni形成螯合物,因此利用Ni-NTA树脂可以很方便地将外源蛋白从细菌蛋白中分离出来。载体蛋白分子量约3.5kD。,注意事项: 产生融合蛋白，基因的插入不能影响蛋白的正常翻译,多克隆位点：,BamH I EcoR I Sac I Sal I Hin

11、d III Not I Xho I GGA TCC GAA TTC GAG CTC CGT CGA CAA GCT TGC GGC CGC ACT CGA G Gly Ser Glu Phe Glu Leu Arg Arg Gln Ala Cys Gly Arg Thr Arg A,正向： BamH I : 5-GGA TCC ATG GCA GGC TCT TCC GCC CTG TT-3 Sac I : 5- GAG CTC ATG GCA GGC TCT TCC GCC CTG TT-3 Sal I: 5- GT CGA C ATG GCA GGC TCT TCC GCC CTG TT-

12、3 Sal I: 5- GT CGA CAA ATG GCA GGC TCT TCC GCC CTG TT-3 Hind III : 5- AA GCT TGC ATG GCA GGC TCT TCC GCC CTG TT-3 反向： Xho I : 3-TTGACTGCTCCAGGGTGAAGA CT CGA G -5,无终止密码子,加保护碱基（酶的边际效应）：,L：5-GTACGGA TCC ATG GCA GGC TCT TCC GCC CTG TT-3 R：3-TTGACTGCTCCAGGGTGAAGA CT CGA G GTAC-5,最后引物序列：,L：5-GTACGGA TCC A

13、TG GCA GGC TCT TCC GCC CTG TT-3,R：5-GTACCTCGAGTCTT CAC CCT GGA GCA GTC AA-3,酵母表达载体引物设计,酵母表达载体的特点,酵母表达引物设计,目的片段应该含有Kozak 翻译起始序列 ANNATGG ATGGCAGGCTCTTCCGCCCTGTTCAAGCTCGCTTGCTTAGTTGCCGCGTTCATGATTGTATCTGCGCCACATGCAGAAGCTGCCATATCATGCGGTACCGTCGTCTCAAAGCTCGCCCCATGCCTCGGCTTTCTCAGGGGCGGCGGTTCCCCACCACCTGCTTGT

14、TGTAGTGGGATTAGAAACCTTCAAAGCATGGCTAGGAGTACACCCGATCGTCAAGCTGCTTGCGGGTGCTTGAAGTCTGCTTCGGCTGGTGTTAATATGCGTAATGCTGCCGCTCTTCCCGGTAAATGTGGTGTGAACATCGGTTACCCAATCAGCAGGAGCGTTGACTGCTCCAGGGTGAAGTGA 5端引物设计：BamHI：GGATCC CCTAGG 5- ATG GCA GGC TCT TCC GCC CTG TT-3 5- GGATCC ATG GCA GGC TCT TCC GCC CTG TT-3 5- GGATCC ACG ATG GCA GGC TCT TCC GCC CTG TT-3 5- ATCG GGATCC ATG GCA GGC TCT TCC GCC CTG TT-3,能编码一个氨基酸,没有要求,酵母表达引物设计,3端引物设计的方法：XhoI： C TCGAG GAGCT C 3-TTGACTGCTCCAGGGTGAAGTGA-5 3-TTGACTGCTCCAGGGTGAAGTGAC TCGAG -5 3-TTGACTGCTCCAGGGTGAAGTGAC TCGAG ATCG-5 5-CGATCTCGAG TCACTTCACCCTGGAGCAGTCAA-3,谢谢,