引物合成常规问题

《引物合成常规问题》由会员分享，可在线阅读，更多相关《引物合成常规问题（7页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、Q1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种，无论采用什么机器合成， 合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多 少。 去保护：加入Deblocking脱去碱基上5- OH的保护基团DMT，获得游离的5- OH； 耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基5-OH仍然被DMT保护，3端被活化 与溶液中游离的5-0H发生耦合反应；(3) 封闭:耦合反应中极少数5- OH没有参加反应，用封闭试剂终止其后继续发生反应；(4) 氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。Q2.引物合成后如何处理？切割与脱保护基：

2、将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂 解CPG与初始核苷之间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的3羟基。纯化:根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有C18 OPC、PAGE 和 HPLC。定量：根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。储存：分装抽干。Q3.需要什么级别的引物？ 根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。应用 引物长度要求 纯度级别要求般 PCR扩增 60base HEPDDNA 测序 20base 左右 HEPD亚克隆，点突变等 根据实验要求定 HEPD, PAGE，HPLC 基因构建（全基因合成） 根据实验要求定 HEPD

3、PAGE 反义核酸根据实验要求定HEPDPAGE修饰引物根据实验要求定PAGE, HPLCQ4引物的质量是不是跟序列有关？四种碱基的性质和各自保护基的性质都有差别。所以合成难度是不一样的。难度最大的当属 GC 重复多的和序列中还有多个连续的 G 的引物。尤其对于后者，国内公司一般都做不了 20个G以上的引物。实验证明，如果引物中有超过三个连续G的结构，传统方法得到的产 物质量就会开始下降。而且目前通用的脱盐、OPC和PAGE方法都无效。鼎国昌盛生物公司拥有的HEPD专利技术能够克服高GC或者高G含量引物的合成和纯化 障碍，对普通引物、高GC引物和无论长短的oligo d （G）都能得到同样的非

4、常好的结果。 Q5需要合成多少OD数？根据实验目的确定。一般PCR扩增，2 OD引物，可以做500-1000次50ul标准PCR反 应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。Q6如何计算引物的浓度？ 引物保存在高浓度的状况下比较稳定。一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成 100pmol/ul，称为保存浓度，而引物的工作浓度一般配制成10-50pmol/ul。加水的体积（微升）可直接参照合成报告单上推荐的体积，也可按下列方式计算：V （微升）=OD数x 33 x 10000 /引物的分子量引物的分子量可以从合成报告单上获得。注意：1 OD260= 33 ug/ml。Q7如何计算引物

5、的Tm值？弓I物设计软件都可以给出Tm,与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子强度有关。长度为25base以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4C(G + C)+ 2C(A + T)对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10Na+ + 0.41 (GC%) - 600/size *公式中，Size二引物长度。Q8引物(含修饰)的分子量是如何确定的？非修饰的引物的分子量(MW)在随引物提供的报告单上可以找到。如果需要估计一个引物 的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量二碱基数x碱基的平均分子量， 或按下列公式计算 MW= (NA

6、* WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) + (Nx * Wx)+( NI* WI) +16* Ns-62.NA, NG, NC, NT, NI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA, WG ,WC, WT, WI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量,Nmod , Wmod分别为修饰基团的 数目和分子量。对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混 合的分子量为(313.21 + 329.21 )/2 = 321.21。Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量 16。常规碱基分子量Base

7、 Molecular WeightA313.21C289.18G329.21T304.19314.2U 290.17常规修饰基团分子量5-Biotin405.453-TAMARA623.605-(6 FAM)537.463-Dabsyl498.495-HEX744.133-(6 FAM)569.465-TET675.243-Amino Modifier C3153.075-Cy5533.633-Amino Modifier C7209.185-Cy3507.593-Thiol Modifier C3154.12Q9 如何溶解引物？ 干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好瞬时离心一下，或管垂直向上

8、在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或TE(pH8.0)缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5)，引物在这种条件下不稳定。Q10 如何保存引物？引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成无色或白色絮状干粉。干粉：运输时常温运输，-20弋可以保存一年。储存液：配好后分装成几管，避免反复冻融，-20C可以保存半年。工作液：常规使用，4弋保存，也可-20C保存，但应避免反复冻融。修饰荧光引物：需要避光保存，尽快使用为宜。Q11.最长可以合成多长的引物？我们合成过lOOba

9、se的引物但是产率很低。除非需要建议合成片段长度不要超过80base。 弓I物越长，出现问题的概率就越大，按照目前的引物合成效率，大于80base的粗产品，全 长引物的百分比不高，后续处理还有丢失很多，最后的产量很低。Q12.为什么修饰引物的产量要比一般引物低，价格要高？主要因为是修饰单体稳定性较差，偶连时间长，效率低，最后得到的产量自然低于一般的引 物。修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化，纯化过程损失大。修饰引物使用的原料是一 般引物原料的几百倍，所以产品的价格也高。Q13 引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？连接反应需要引物的5磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体

10、上，引 物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善 引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退 火温度。Q14.为什么引物的OD260/OD280小于1.5 ?需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过 低一般是由于引物中 C/T 的含量比较高所致。下表是一个 2Obase 同聚体引物的 OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。 A26O/28O ratios of Crude 2O-mer Oligos of D

11、iffering Base Compositions Base Composition A26O/28O5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 2.5O5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 1.145-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3 1.66Q15伺样的OD用PAGE检测，EB染色为什么深浅不一？通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量（如质粒DNA），因为EB可以嵌合到双链 DNA中。而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染 色程度也会有差异，比如Oligo（dT）等不形成二级结构,EB染色效果就非常差。所以不要用 EB

12、染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。Q16 如何检测引物的纯度？实验室方便的做法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取 0.2-0.5OD 的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性（95弋,2口ins）。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电 压进行电泳，一定时间后（约2-3小时），剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带 之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用银染方式染色。Q17.已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？如果您溶解引物的水pH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混 合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻溶。建议使用 10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5 ），引物在这 种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题，而是PCR使用材料特别是模板的质量 与先前使用的不完全一致。