微生物安全国家标准

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1、食品微生物学检验 菌落总数测定1 范围本标准规定了食品中菌落总数（Aerobic plate count）的测定方法。本标准适用于食品中菌落总数的测定。2 术语和定义2.1 菌落总数:食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。3 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1 恒温培养箱：36 1 ，30 1 。3.2 冰箱：2 5 。3.3 恒温水浴箱：46 1 。3.4 天平：感量为0.1 g。3.5 均质器。3.6 振荡器。3.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（

2、具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。3.8 无菌锥形瓶：容量250 mL、500 mL。3.9 无菌培养皿：直径90 mm。3.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。3.11 放大镜或/和菌落计数器。4 培养基和试剂4.1 平板计数琼脂培养基：见附录A 中A.1。 4.2 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.2。4.3 无菌生理盐水：见附录A 中A.3。5 检验程序检 样25 g(mL)样品+225 mL 稀释液，均质10 倍系列稀释选择2 个3 个适宜稀释度的样品匀液，各取1 mL 分别加入无菌培养皿内每皿中加入15 mL20 mL 平板计数琼脂培养基，混匀培 养计数各平板菌落数计算

3、菌落总数报 告6 操作步骤6.1 样品的稀释6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内， 8000 r/min10000 r/min 均质1 min2 min，或放入盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min2 min，制成1:10 的样品匀液。6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。6.1.3 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注

4、于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。6.1.4 按6.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。6.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2 个3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。6.1.6 及时将15 mL20 mL 冷却至46 的平板计数琼脂培养基（可放置于4

5、6 1 恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。6.2 培养6.2.1 待琼脂凝固后，将平板翻转，36 1 培养48 h2 h。水产品30 1 培养72 h3 h。6.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL），凝固后翻转平板，按6.2.1 条件进行培养。6.3 菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。6.3.1 选取菌落数在30 CFU300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。

6、低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。7 结果与报告7.1 菌落总数的计算方法7.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结

7、果。7.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：N=C(n1+0.1n2)d（1）式中：N样品中菌落数；C平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； n1第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d稀释因子（第一稀释度）。示例：稀释度1:100（第一稀释度）1:1000（第二稀释度）菌落数（CFU）232，24433，35N=C(n1+0.1n2)d=(232+ 244 +33+ 35)2 +(0.1 *2)* 0.01=24727 上述数据按7.2.2数字修约后，表示为25000或2.5104。7.1.3 若所有稀释度的平

8、板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。7.1.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.1.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算。7.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 时，则以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.2 菌落总数的报告7.2.1 菌落数小于100 CFU 时，按“四舍五入

9、”原则修约，以整数报告。7.2.2 菌落数大于或等于100 CFU 时，第3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2 位数字，后面用0 代替位数；也可用10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。7.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。7.2.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。7.2.5 称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。食品微生物学检验 大肠菌群计数1 范围本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。本标准适用于食品中大肠菌群的计数。2 术语和定义2.1 大肠菌群coliform

10、s在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。2.2 最可能数most probable number，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。3 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1 恒温培养箱：36 1 。3.2 冰箱：2 5 。3.3 恒温水浴箱：46 1 。3.4 天平：感量0.1 g。3.5 均质器。3.6 振荡器。3.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。3.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。3.9 无菌培养皿：直径90 mm。3.10 pH 计或pH

11、比色管或精密pH 试纸。3.11 菌落计数器。4 培养基和试剂4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨LST）肉汤： 4.2 煌绿乳糖胆盐BGLB）肉汤：4.3 结晶紫中性红胆盐琼： 4.4 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.4。4.5 无菌生理盐水：见附录A 中A.5。4.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.6。4.7 无菌1 mol/L HCl：见附录A 中A.7。第一法 大肠菌群MPN 计数法5 检验程序大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。检样 25 g(mL)样品+225 mL 稀释液，均质10 倍系列稀释选择适宜 3 个连续稀释度的样品匀液，接种LST 肉汤管 36148h2h 不产气

12、 产 气BGLB 肉汤36148h2h 不产气 产 气大肠菌群阴性 大肠菌群阳性查 MPN 表报告结果6 操作步骤6.1 样品的稀释6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品,放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内, 8000 r/min10000 r/min 均质1 min2 min,或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min2 min，制成1:10 的样品匀液。6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1

13、:10 的样品匀液。6.1.3 样品匀液的pH 值应在6.57.5 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调节。6.1.4 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。6.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1 支1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 mi

14、n。6.2 初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），361 培养24 h2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。6.3 复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 1培养48 h2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。6.4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告按6.

15、3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。第二法 大肠菌群平板计数法7大肠菌群平板计数法的检验程序8 操作步骤检样25 g(mL)样品+225 mL 稀释液，均质10 倍系列稀释选择2 个3 个适宜稀释度的样品匀液，接种VRBA 平板36118h24h计数典型和可疑菌落BGLB 肉汤36124h48h报告结果8.1 样品的稀释(按6.1进行。)8.2 平板计数8.2.1 选取2个3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。8.2.2 及时将15 mL20 mL冷至46

16、的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36 1 培养18 h24 h。8.3 平板菌落数的选择选取菌落数在15 CFU150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。8.4 证实试验从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36 1 培养24 h48 h，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。8.5 大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g（mL）=6.0105