《蛋白质组学》课件

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1、第 五 章,蛋 白 质 组 学 (Proteomics),医学检验系临床生化教研室 周 琳,重点 蛋白质与蛋白质组学的概念 难点 二维凝胶电泳、酵母双杂交等技术的原理与方法 了解 蛋白质组学在医学中的应用,蛋白质组学研究背景,1.基因研究是20世纪生命科学的主线 1953年，DNA双螺旋结构的提出 1954年，“中心法则”的问世 20世纪90年代，全球性基因组计划尤其是人类基因组计 划（HGP）的大力推进 2000年6月，HGP计划完成,结构基因组学时代,蛋白质组学研究背景,2.“后基因组时代”（postgenome era） 功能基因组学（functional genomics)成为研究的重

2、心，蛋白质组学（proteomics）则是其“中流砥柱”。,转录组学 蛋白质组学 代谢组学 表型组学 相互作用组学,功能基因组学,蛋白质组学是后基因组学时代研究的中心，而以阐明生物体内蛋白质表达模式与功能模式为目标的蛋白质组学成为功能基因组学研究的重要内容之一。,第一节 蛋白质组及蛋白质组学基本概念,蛋白质组(proteome)： PROTEOME = PROTE in +genOME Proteins expressed by a genome. 是指“特定细胞、组织乃至机体作为一个生命单元中所有蛋白质的集合，即生命体中携带的基因信息在某一时段所表达的全部蛋白质。,什么是蛋白质组？,1.对应

3、于基因组的所有蛋白质构成的整体， 不是局限于一个或几个蛋白质。 2.同一基因组在不同细胞、不同组织中的表 达情况各不相同 。 3.在空间和时间上动态变化着的整体。,蛋白质组,Genome=static composition,Proteome = highly flexible composition,Identical Genome but different looks.?,proteome comparison,蛋白质组与基因组的联系与区别,蛋白质组学（proteomics）： 以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，

4、在整体水平上揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。,什么是蛋白质组学？,表达蛋白质组学（expression proteomics)： 即把细胞、组织中的蛋白，建立蛋白定量表达图谱，观察某种细胞或组织中蛋白质的整体表达, 并分析不同情况下表达图谱的变化。,蛋白质组学的分类与研究内容,细胞图谱蛋白质组学（cellmap proteomics）：即确定蛋白质在亚细胞结构中的位置；通过纯化细胞器或用质谱仪鉴定蛋白复合物组成等，来确定蛋白质-蛋白质的相互作用。,组成蛋白质组学 比较蛋白质组学,功能蛋白质组学 结构蛋白质组学,人类蛋白质组学研究进展,2001年成立国际人类蛋白质组组织（HUPO），2003.

5、12.15启动两个首批行动计划 1.人类肝脏蛋白质组计划（HLPP）由中国军事医学科学 院副院长贺福初院士领导，16国80多个实验室参加。 中国第一次领导重大国际协作计划。 2. 人类血浆蛋白质组计划（HPPP）由美国科学家牵头， 13国47个实验室参加。,第二节 蛋白质组学研究的内容及所采用的主要技术,蛋白质组学,表达模式研究,功能模式研究,二维电泳 高效液相色谱HPLC 质谱技术 生物信息学,噬菌体展示技术酵母双杂交系统蛋白芯片技术,蛋白质组学的研究内容与技术,一、蛋白质组学主要研究技术 （Technology of Proteomics）,1.蛋白质分离技术 凝胶二维电泳、HPLC； 2

6、.蛋白质鉴定技术 Edman测序、质谱技术； 3.图像分析与生物信息 图像分析软件，数据库； 4.相互作用研究技术 酵母双杂交技术、免疫共沉淀、蛋白质芯片等。,蛋白质样品制备 (sample preparation) 蛋白质的分离 蛋白质的鉴定 生物信息学研究,Protein Extraction,Protein Prefractionation,Protein Separation,Protein Identification,二、蛋白质组表达模式研究流程图,Database utilization,1、蛋白质的分离,大规模蛋白质的分离技术二维凝胶电泳 （Two-Dimensional Ge

7、l Electrophoresis， 2-DE）,是将不同种类的蛋白质以电荷差异和相对分子量差异为基础进行的高分辨率分离分析方法。 工作原理： (1)1st dimension: 等电聚焦凝胶电泳 (IEF) 根据蛋白质的净电荷或等电点的不同进行分离 (2)2nd dimension: SDS-PAGE 根据蛋白质相对分子质量大小不同进行分离,双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维分布图： 水平方向反映出蛋白在pI上的差异， 垂直方向反映出它们在分子量上的差别。,第一向电泳：等电聚焦电泳,聚焦后凝胶放置在SDS凝胶上，进行第二向电泳,第二向电泳：SDS-PAGE,分子量大,分子量小,pH9,pH

8、3,pH9,pH3,凝胶中加有两性电解质溶液（pH9-3）,加电场后在凝胶内形成一个稳定pH梯度,加样品，然后继续电泳,凝胶染色表明样品按照各自pI值沿着pH梯度分布,(1)等电聚焦凝胶电泳（ IFE） 利用载体两性电解质在电场作用下沿电场方向在凝胶内形成一个连续而稳定的pH梯度。 每种蛋白质都将迁移至与它的pI 相一致的pH处。,所用介质为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R为弱酸性或弱碱性基团，它们构成了分布在pH3-9不同值的缓冲体系。 根据一定的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中

9、而形成pH梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态。,固相pH梯度等电聚焦（IPG-IEF）,等电聚焦凝胶电泳（ IFE）,上样,去除胶条保护层、电泳,转移胶条,固相等电聚焦电泳,垂直板电泳装置,样品迁移方向,(2)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,十二烷基硫酸钠(SDS) 是一种去污剂，从而使蛋白质获得负电荷，屏蔽蛋白质，因此电泳迁移率仅与分子大 小相关。,电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。,(2)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,(3)双向电泳 第一向：等电聚焦电泳第二向：SDS-PAGE 双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二

10、维分布图： 水平方向反映出蛋白在pI上的差异， 垂直方向反映出它们在分子量上的差别。,第一向电泳：等电聚焦电泳,聚焦后凝胶放置在SDS凝胶上，进行第二向电泳,第二向电泳：SDS-PAGE,分子量大,分子量小,pH9,pH3,pH9,pH3,大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片,二维电泳的优点与缺陷,优点： 能溶解大量蛋白质并进行定量，具有高通量、重复 性好、敏感性较高等特点。 缺点： 1.蛋白表达水平的差异较大，一些低丰度蛋白不易检 测。 2.分辨率不能满足蛋白质组学研究的需要。 3.对极酸极碱性和疏水性膜蛋白的分离效果不佳。,如何有效的对双向凝胶电泳图像分析，如何对图谱上的蛋白质点进行

11、检测、定量、比较、分析和归类，挖掘有价值的蛋白质点的信息并对图像进行数字化处理等分析 是双向电泳分析软件所要解决的问题。,2、电泳图谱的图像分析,染色完毕后，利用计算机软件对凝胶图像进行分析，如PD-QUEST软件，LIPS，HERMES，GEMINI等，,3、蛋白质的鉴定,生物质谱技术获得2002年诺贝尔化学奖,质谱技术（mass spectrometry,MS）,样品分子离子化后，根据不同离子间的质量、电荷比（质荷比）差异来确定相对分子质量的技术。 通过正确测定蛋白质分子的质量而进行蛋白质分子鉴定、蛋白质分子的修饰和蛋白质分子相互作用的研究。,质谱技术,Sample Inlet,Ioniz

12、ation,Mass Analyzer,Mass Sorting (filtering),Ion Detector,Detection,Ion Source,Sample/Matrix dried on MALDI Plate (Autoloader Cassette),Detect ions,Forms ions (charged molecules),Sort Ions by Mass (m/z),质谱的基本组成元件,Vacuum Envelope,基本步骤： 1.样品离子化 2.根据荷质比不同分离离子 3.检测每种质量离子的数目 4.收集处理数据得到质谱图,“鸟枪法(shotgun)”定

13、量蛋白质组学技术,蛋白质溶液或经SDS-PAGE分离的蛋白质条带,肽段混合物,酶解,液相色谱分离,串联质谱分析,数据检索，鉴定蛋白,4、蛋白质核酸间相互作用的研究,蛋白质可以与末端标记的核酸探针特异性结合，电泳时蛋白质核酸的复合物比无蛋白质的探针在凝胶中泳动速度漫，表现为相对滞后。,4.1 凝胶迁移滞后实验（EMSA）,Dnase I 可以切割DNA中磷酸二酯键，而结合蛋白质的DNA免于Dnase I水解，不能被切割。,4.2 Dnase I 足纹分析,蛋白质精确结合位点的研究方法。,5、蛋白质与蛋白质相互作用,酵母双杂交系统,酵母杂交系统是将待研究的两种蛋白质的基因(X、Y) 分别克隆到酵母

14、表达质粒的转录激活因子如Gal4的 DNA结合功能域（BD）和转录激活结构域(AD)，构建 成融合表达载体，从报告基因表达产物分析两种蛋 白质相互作用的系统。,BD- X+ AD- Y 报告基因转录,诱饵蛋白,捕获蛋白,GAL4转录因子的分子机理,在GAL4 based双杂交系统中:,正常情况在酵母细胞内:,Promoter,gal metabolic gene,GAL UAS,Transcription,AD,BD,Reporter Gene,GAL4 AD,酵母双杂交系统原理示意图,X,Y,BD,AD,细胞或组织样品蛋白样品制备二维凝胶电泳（2DPAGE）分离蛋白质计算机辅助分析2DPAGE图象对感兴趣的蛋白质进行酶解质谱分析数据库检索蛋白质鉴定分析蛋白质在细胞与组织中的表达情况。,一般流程,小 结,Shotgun技术,第三节 蛋白质组学在医学中的应用,1、在临床肿瘤研究方面的应用 癌细胞不仅有许多特异蛋白质产物,而且这些产物还会影响其他蛋白质的翻译后加工及许多蛋白质的表达水平，因此寻找有价值的肿瘤标志物意义重大。 2、在检验医学中的应用 血清血浆蛋白质组研究、尿液蛋白质组研究以及其他体液蛋白质组研究，筛选疾病标志物。 3、传染病 4、神经性疾病 5、糖尿病、肥胖症,谢谢大家！,