木瓜蛋白酶活力测定方法

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1、木瓜蛋白酶活力测定方法分别精密量取酪蛋白溶液5ml,置3支具塞试管中，置40C水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40C水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40C水浴中放置3040分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过,滤液作为供试品溶液。精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40C水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40C水浴中放置3040分钟，滤过，滤液作为空白溶液。照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IVA），以0.1mol/L盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定

2、空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算：效价（单位/mg）=A/As*Cs*12/2*稀释倍数/W式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度：As为酪氨酸对照品溶液的吸收度：Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度，ug/mlW为供试品重量，mg;在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g,加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液50ml，置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加0.05mol/L枸椽酸溶液调节PH至6.00.1，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。酶稀释液：取无水磷酸氢二钠3.55g，加水400ml溶解，加

3、乙二胺四醋酸二钠1.1g和盐酸半胱氨酸2.74g，振摇溶解，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节PH6.50.1,用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸17.99g,加醋酸钠29.94g和冰醋酸18.9ml,加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。酶活力测定对照品溶液的制备：精密称取已105C干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含40ug的溶液。供试品溶液的制备:取本品适量（约相当于木瓜酶活力120万单位），精密称定，加酶稀释液振摇，制成每1ml中含200300单位的溶液，摇匀。实验技术2008-05-2718:01:

4、29阅读213评论0字号：大中小一、目的淀粉是葡萄糖以a-1,4糖苷键及a-1,6糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药纺织工业的基本原料。淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。小麦成熟期如遇阴雨天气，有的品种会发生严重的穗发芽，造成巨大损失，这是小麦种子中淀粉酶活动的结果。因此，淀粉酶的活性测定，具有理论和应用研究的意义。通过本实验，学习酶活测定的一般方法，巩固并熟练分光光度计的使用。二、原理淀粉酶主要包括a淀粉酶、卩淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界

5、。不同来源的淀粉酶，性质有所不同。植物中最重要的淀粉酶是a淀粉酶和卩淀粉酶。a淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分a1,糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、a极限糊精和少量葡萄糖。Ca2+能使a淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，pH3.6以下可使其钝化。卩淀粉酶从非还原端作用于a1,糖苷键，遇到支链淀粉的a1,6键时停止。单独作用时产物为麦芽糖和卩极限糊精。卩淀粉酶是一种巯基酶，不需要Ca2+及Cl等辅助因子，最适pH偏酸，与a淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，70C保温15min可使其钝化。通常提取液中a淀粉酶和卩淀粉酶同时存在。可以先测定（a+卩）淀粉酶总活力，然后在70C加热1

6、5min,钝化卩淀粉酶，测出a淀粉酶活力，用总活力减去a淀粉酶活力，就可求出卩淀粉酶活力。淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸的显色反应来测定。还原糖作用于黄色的3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。以每克样品在一定时间内生成的还原糖(麦芽糖)量表示酶活大小。三、仪器、试剂和材料1.仪器(1) 电子顶载天平(2) 研钵(3) 容量瓶100mL2个(4) 具塞刻度试管25MI15支(5) 试管8支(6) 吸管1mL3支，2mL12支，5mL1支(7)离心机(8)离心管(9)恒温水浴锅(10)分光光度计2.试剂(1

7、)1%淀粉溶液(2)0.4moI/L氢氧化钠(3)pH5.6柠檬酸缓冲液称取柠檬酸20.01g，溶解后定容至1000mL,为A液。称取柠檬酸钠29.41g，溶解后定容至1000mL，为B液。取A液13.7mL与B液26.3mL混匀，即为pH5.6之缓冲液。(4) 3,5二硝基水杨酸精确称取1g3,5二硝基水杨酸溶于20mL1mol/L氢氧化钠中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100Ml，盖紧瓶塞，防止CO2进入。(5) 麦芽糖标准液(1mg/ml)称取O.IOOg麦芽糖，溶于少量蒸馏水，定容至100mL。3.材料萌发3天的小麦芽。四、操作步骤1. 酶液提取称

8、取2g萌发3天的小麦种子(芽长1cm左右)，置研钵中加少量石英砂和2m1左右蒸馏水，研成匀浆，无损地转入100m1容量瓶中，用蒸馏水定容至100m1,每隔数分钟振荡1次，提取20min。3000r/min离心l0min,转出上清液备用。2. a淀粉酶活力测定(1) 取试管4支，标明2支为对照管，2支为测定管。(2) 于每管中各加酶液lml，在70C士0.5。0恒温水浴中准确加热15min,钝化卩淀粉酶。取出后迅速用流水冷却。(3) 在对照管中加入4m10.4mol/L氢氧化钠。(4)在4支试管中各加入1mlpH5.6的柠檬酸缓冲液。(5)将4支试管置另一个40C士0.5。0恒温水浴中保温15m

9、in,再向各管分别加入40C下预热的1%淀粉溶液2m1,摇匀，立即放入40C恒温水浴准确计时保温5min。取出后向测定管迅速加入4ml0.4mol/L氢氧化钠，终止酶活动，准备测糖。3. 淀粉酶总活力测定取酶液5ml,用蒸馏水稀释至100m1,为稀释酶液。另取4支试管编号，2支为对照，2支为测定管。然后加入稀释之酶液lml0在对照管中加入4m10.4mol氢氧化钠。4支试管中各加1mlpH5.6之柠檬酸缓冲液。以下步骤重复a淀粉酶测定第(5)步的操作，同样准备测糖04. 麦芽糖的测定(1) 标准曲线的制作取25ml刻度试管7支，编号。分别加入麦芽糖标准液(lmg/ml)0,0.2,0.6,1.

10、0,1.4,1.8,2.0ml，然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达2.0ml，再各加3,5二硝基水杨酸试剂2.0m1,置沸水浴中加热5min。取出冷却，用蒸馏水稀释至25m1o混匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录吸光度。以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含量(mg)为横坐标，绘制标准曲线。(2) 样品的测定取步骤2,3中酶作用后的各管溶液2m1,分别放入相应的8支25ml具塞刻度试管中，各加入2m13,5二硝基水杨酸试剂。以下操作同标准曲线制作。根据样品比色吸光度，从标准曲线查出麦芽糖含量，最后进行结果计算。（AA0）xVT五、结果处理式中A为a-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖（mg）；Ao为

11、a-淀粉酶的对照管中麦芽糖量（mg）；B为（a十卩）淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖（mg）；Bo为（a十卩）淀粉酶的对照管中麦芽糖（mg）；VT为样品稀释总体积（ml）；VU为比色时所用样品液体积（ml）；W为样品重（g）。六、注意事项（1）酶反应时间应准确计算。（2）试剂加入按规定顺序进行。七、思考题1. 淀粉酶活性测定原理是什么？2. 酶反应中为什么加pH5.6的柠檬酸缓冲液？为什么在40C进行保温？3. 测定酶活力，应注意什么问题？一、目的淀粉是葡萄糖以a-1,4糖苷键及a-1,6糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、纺织工业的基本原料。淀粉酶是加水

12、分解淀粉的酶的总称,淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依据,也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。小麦成熟期如遇阴雨天气,有的品种会发生严重的穗发芽,造成巨大损失,这是小麦种子中淀粉酶活动的结果。因此,淀粉酶的活性测定,具有理论和应用研究的意义。通过本实验,学习酶活测定的一般方法,巩固并熟练分光光度计的使用。二、原理淀粉酶主要包括a-淀粉酶、卩-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。不同来源的淀粉酶，性质有所不同。植物中最重要的淀粉酶是a-淀粉酶和卩-淀粉酶。a-淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分a-1,4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、a-极

13、限糊精和少量葡萄糖。Ca2+能使a-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，pH3.6以下可使其钝化。卩-淀粉酶从非还原端作用于a-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的a-1,6键时停止。单独作用时产物为麦芽糖和卩-极限糊精。卩-淀粉酶是一种巯基酶，不需要Ca2+及Cl等辅助因子，最适pH偏酸，与a-淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，70C保温15min可使其钝化。通常提取液中a-淀粉酶和卩-淀粉酶同时存在。可以先测定(a+卩)淀粉酶总活力，然后在70C加热15min,钝化卩-淀粉酶，测出a-淀粉酶活力，用总活力减去a-淀粉酶活力，就可求出卩-淀粉酶活力。淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5-

14、二硝基水杨酸的显色反应来测定。还原糖作用于黄色的3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。以每克样品在一定时间内生成的还原糖(麦芽糖)量表示酶活大小。三、仪器、试剂和材料1. 仪器(1) 电子顶载天平(2) 研钵(3) 容量瓶100mL2个(4) 具塞刻度试管25M115支(5) 试管8支(6) 吸管1mL3支，2mL12支，5mL1支(7) 离心机(8) 离心管(9) 恒温水浴锅(10) 分光光度计2. 试剂(1) 1%淀粉溶液(2) 0.4mol/L氢氧化钠(3) pH5.6柠檬酸缓冲液称取柠檬酸20.01g,溶解后定容至1000mL,为

15、A液。称取柠檬酸钠29.41g,溶解后定容至1000mL，为B液。取A液13.7mL与B液26.3mL混匀，即为pH5.6之缓冲液。(4) 3,5-二硝基水杨酸精确称取1g3,5-二硝基水杨酸溶于20mL1mol/L氢氧化钠中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100Ml，盖紧瓶塞，防止C02进入。(5)麦芽糖标准液(lmg/m1)称取O.lOOg麦芽糖，溶于少量蒸馏水，定容至100mL。3. 材料萌发3天的小麦芽。四、操作步骤1. 酶液提取称取2g萌发3天的小麦种子(芽长lcm左右)，置研钵中加少量石英砂和2ml左右蒸馏水，研成匀浆，无损地转入100ml容量瓶

16、中，用蒸馏水定容至100ml,每隔数分钟振荡l次，提取20min。3000r/min离心10min,转出上清液备用。2. a-淀粉酶活力测定(l)取试管4支，标明2支为对照管，2支为测定管。(2) 于每管中各加酶液lml，在70C士0.5C恒温水浴中准确加热l5min,钝化卩-淀粉酶。取出后迅速用流水冷却。(3) 在对照管中加入4ml0.4mo1/L氢氧化钠。(4) 在4支试管中各加入lm1pH5.6的柠檬酸缓冲液。(5) 将4支试管置另一个40C士0.5C恒温水浴中保温l5min，再向各管分别加入40C下预热的l%淀粉溶液2ml，摇匀，立即放入40C恒温水浴准确计时保温5min。取出后向测定

17、管迅速加入4m10.4mo1/L氢氧化钠，终止酶活动，准备测糖。3. 淀粉酶总活力测定取酶液5ml,用蒸馏水稀释至l00ml，为稀释酶液。另取4支试管编号，2支为对照，2支为测定管。然后加入稀释之酶液lml。在对照管中加入4ml0.4mo1氢氧化钠。4支试管中各加lm1pH5.6之柠檬酸缓冲液。以下步骤重复a-淀粉酶测定第(5)步的操作，同样准备测糖。4. 麦芽糖的测定(1) 标准曲线的制作取25ml刻度试管7支，编号。分别加入麦芽糖标准液(1mg/ml)0,0.2,0.6,l.0,l.4,l.8,2.0ml,然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达2.0ml，再各加3,5一二硝基水杨酸试剂2.0ml

18、,置沸水浴中加热5min。取出冷却，用蒸馏水稀释至25ml。混匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录吸光度。以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含量(mg)为横坐标，绘制标准曲线。(2) 样品的测定取步骤2,3中酶作用后的各管溶液2ml,分别放入相应的8支25ml具塞刻度试管中，各加入2m13,5-二硝基水杨酸试剂。以下操作同标准曲线制作。根据样品比色吸光度，从标准曲线查出麦芽糖含量，最后进行结果计算。(AA0)xVT五、结果处理式中A为a-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖(mg)；Ao为a-淀粉酶的对照管中麦芽糖量(mg)；B为（a十卩）淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖（mg）；Bo为（a十卩）淀粉酶的对照管中麦芽糖（mg）；VT为样品稀释总体积（ml）；VU为比色时所用样品液体积（ml）；W为样品重（g）。六、注意事项（1）酶反应时间应准确计算。（2）试剂加入按规定顺序进行。七、思考题1.淀粉酶活性测定原理是什么？2酶反应中为什么加pH5.6的柠檬酸缓冲液？为什么在40C进行保温?3.测定酶活力，应注意什么问题？